Introdução
As cefaleias primárias são entidades clínicas largamente prevalentes na população geral. Constituem também um importante problema de Saúde Pública, pelas implicações económicas e sociais que acarretam. Entre elas, a enxaqueca é aquela cuja tendência familiar tem sido mais estudada. A hereditariedade mendeliana só está comprovada numa variante rara, autossómica dominante, a “enxaqueca hemiplégica familiar (EHF)”. A sua semelhança com as formas mais vulgares de enxaqueca sugere a possibilidade de existirem mecanismos patogénicos comuns. Recentemente, foram identificadas mutações num gene dos canais de cálcio (CACNA1A) no cromossoma 19p13, em metade das famílias de EHF identificadas, tornando possível a detecção directa de mutações. Objectivo
Com o presente estudo pretende-se dar um contributo para o conhecimento sobre a hereditariedade da enxaqueca e de outras cefaleias primárias.
Metodologia
Para a recolha dos sujeitos e familiares procedeu-se a um estudo prospectivo de todos os tipos de enxaqueca e de todas as variedades de enxaqueca e de cefaleias em salvas associadas a outras doenças hereditárias. Os métodos moleculares utilizados nesta fase do estudo basearam-se na extracção de ADN pelo método salino, amplificação por PCR e detecção por electroforese em gel de poliacrialmida.
Resultados
Foi estabelecida uma base de dados clínica com diferentes tipos de cefaleias, incluindo enxaqueca, constituida por cerca de 8.415 doentes. Estabeleceu-se um banco de ADN de enxaquecas com um total de 460 indivíduos, incluindo probandos, familiares, controlos e casos isolados. Não foram encontradas mutações causadoras da doença no gene CACNA1A, para os doentes estudados. No entanto, vários polimorfismos foram detectados.
Discussão
Considerando as dificuldades apresentadas a nível da participação dos familiares e consequentemente a nível laboratorial, nem todos os objectivos inicialmente propostos foram cumpridos nesta fase do estudo (primeiro de três anos de duração prevista). Contudo, os dados preliminares obtidos são já significativos para um estudo deste tipo e animadores quanto às perspectivas futuras.
Palavras-Chave: Cefaleias, Epidemiologia, Epidemiologia Genética, Genética Molecular.
Título de cabeçalho: Estudo Genético da Enxaqueca: aspectos clínicos e moleculares.
Maria-José Castro1, Madalena Pinto2, Teresa Mendonça2, Assunção Tuna2, Carla Fraga2, José Barros2, Patrícia Maciel3, Alda Sousa1,4, Isabel Silveira1, Jorge Sequeiros1,4, José Pereira Monteiro2
1-Unidade de Investigação Genética e Epidemiológica em doenças Neurológicas, Instituto de Biologia Molecular e Celular, Porto; 2-Serviço de Neurologia, Hospital Geral de Santo António, Porto; 3-Escola de Ciências da Saúde (ICVS), Universidade Minho, Braga; 4-Departamento de Estudos das Populações, Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto, Porto.
Introdução
As cefaleias primárias ou idiopáticas (enxaquecas, cefaleias em salvas e cefaleias tipo tensão) são entidades clínicas largamente prevalentes na população geral, como o demonstraram estudos epidemiológicos nacionais e internacionais (1-4). Estas afecções constituem também um importante problema de Saúde Pública, pelas suas implicações económicas (elevado consumo de cuidados de saúde, redução de rentabilidade profissional, elevado absentismo laboral e escolar) e sociais (perturbação do ambiente familiar e social e redução da qualidade de vida) que acarretam (2,3,5-8). Entre as cefaleias primárias, a enxaqueca é aquela cuja tendência familiar tem sido mais estudada. No entanto, a falta de definição clara das suas diversas variantes clínicas, os erros metodológicos dos estudos populacionais, sobretudo dos mais antigos, a diferença entre os sexos e a sua expressividade variável, assim como a grande influência de factores ambienciais tem contribuído fortemente para criar alguma confusão sobre a prevalência e o modo de hereditariedade desta entidade clínica (9-13).
As conclusões dos diversos estudos efectuados são por vezes contraditórias tendo sido sugeridos vários modos de hereditariedade (14-17), nomeadamente, hereditariedade autossómica dominante (com alta penetrância (18-19); com baixa penetrância (20-21)), autossómica recessiva (com baixa penetrância) (22-23), multigénica ou multifactorial (24). As únicas modalidades definitivamente excluídas foram a hereditariedade ligada ao sexo e a transmissão feminina (ligada ao ADN mitocondrial). A hereditariedade mendeliana só está comprovada numa variante rara, autossómica dominante denominada “enxaqueca hemiplégica familiar (EHF)”, que é constituída por episódios de cefaleias do tipo da enxaqueca associados a surtos de hemiparesia ou hemiplegia reversíveis (25). A semelhança desta entidade com as formas mais vulgares de enxaqueca (com e sem aura) no que respeita aos sintomas, factores desencadeantes e resposta ao tratamento, é considerável, e também a sua ocorrência em familiares de doentes com Enxaqueca Hemiplégica Familiar sugere fortemente a possibilidade de existirem mecanismos patogénicos comuns (26).
Recentemente, foram identificadas mutações num gene dos canais de cálcio neuronais dependentes da voltagem (CACNA1A), no cromossoma 19p13, em metade das famílias de EHF identificadas, tornando possível a detecção directa de mutações (27). Este gene dos canais de cálcio é alélico com duas outras afecções, a ataxia episódica tipo 2 (AE-2)(28-30) e a ataxia espino-cerebelosa
tipo 6 (SCA 6) (31). Num estudo de 28 famílias com enxaqueca, com e sem aura, procederam à análise familiar e molecular e encontraram a presença deste gene no cromossoma 19p em maior número do que seria de esperar pelo acaso (32). Contudo, num outro estudo de 4 famílias não foi encontrada qualquer associação semelhante (15). Estes dados sugerem que este gene do cromossoma 19p é pelo menos parcialmente responsável pelas manifestações clínicas, em algumas famílias de enxaqueca (com e sem aura) e em metade das famílias com EHF, mas, necessitam de ser mais amplamente confirmados. Também é necessário estudar casos esporádicos e doentes com outras afecções associadas, como por exemplo: as cefaleias em salvas (Horton) que ocorrem 14 vezes mais nas famílias com enxaqueca do que na população geral, convulsões infantis familiares benignas, tremor essencial benigno, sindrome de Usher, epilepsia rolândica benigna, epilepsia occipital benigna, hemiplegia alternante benigna da criança, doença de Rendu-Weber-Osler, malformações cavernosas cerebrais familiares, CADASIL, angiopatia amilóide cerebral hereditária (forma holandesa) assim como algumas citopatias mitocondriais (MELAS e MERRF).
Mais recentemente, uma enorme família de 49 membros com enxaqueca hemiplégica familiar autossómica dominante com alta penetrância foi ligada ao cromossoma 1q31 (33); 4 famílias francesas foram também ligadas a uma região próxima localizada no cromossoma 1q21-23 mas com heterogeneidade demonstrada em relação às anteriores (34). A caracterização destas mutações genéticas está a ser conduzida nos laboratórios onde foram identificadas.
Através do estudo clínico e genético dos fenótipos de enxaqueca e das doenças associadas, integrado em bases de dados, e do genótipo obtido a partir da análise molecular dos haplótipos, será possível fazer estudos de correlação para todos os tipos de enxaqueca. Os casos esporádicos também podem ser estudados para avaliar a ocorrência de genes mutantes da EHF. A base de dados clínicos e genéticos assim constituída pode vir a ser usada para posterior estudo da influência genética na apresentação clínica da doença e eventualmente pesquisar a potencialidade de resposta a determinado tipo de terapêuticas.
Objectivos
Os principais objectivos deste trabalho foram:
1. constituir uma base de dados clínicos de doentes com enxaqueca e de controlos, e respectivas famílias;
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2. seleccionar os probandos; 3. construir um banco de ADN;
4. caracterizar geneticamente as famílias identificadas para mutações conhecidas;
5. estudar a hereditariedade da enxaqueca nas famílias dos probandos;
6. procurar novas mutações no mesmo ou noutros loci (genes candidatos);
7. procurar novos loci em famílias informativas;
8. estudar a correlação genótipo-fenótipo nas famílias seleccionadas.
Metodologia
1. Métodos para a recolha dos sujeitos e familiares Estudo prospectivo de todos os tipos de enxaqueca e de todas as variedades de enxaqueca e de cefaleias em salvas associadas a outras doenças hereditárias ou eventualmente hereditárias constando de:
1. Descrição e classificação clínica de acordo com os critérios de diagnóstico da International Headache Society (IHS) (35);
2. Inquérito familiar;
3. Questionário para colheita de dados clínicos e familiares de qualquer forma de enxaqueca (familiar ou esporádica);
4. Constituição de uma base de dados clínicos e familiares para posterior análise de correlação clinica com o genótipo;
5. Preenchimento de uma norma de consentimento informado para colheita de sangue para estudos de genética molecular.
2. Métodos moleculares
O ADN genómico foi obtido a partir de cerca de 10 a 30 mL de sangue periférico de cada indivíduo. Os leucócitos foram posteriormente separados por centrifugação e o ADN isolado por digestão com a enzima proteinase K, na presença do detergente SDS e de EDTA. A precipitação do ADN baseou-se no método salino, usando para tal uma solução saturada de cloreto de sódio (36).
Para a análise de mutações e polimorfismos genéticos nas diferentes regiões do gene CACNA1A utilizou-se a técnica de amplificação por Polymerase Chain Reaction (PCR) como anteriormente descrito (37). A detecção dos produtos de amplificação foi feita por Single Strand Conformational Polymorphism (SSCP) já que esta técnica permite a visualização de qualquer alteração no padrão de migração de cada uma das cadeias (single strand) que se encontram separadas num gel de poliacrilamida, mesmo que essa alteração se verifique em apenas um par de base
(38). A sequenciação automática e/ou Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) foram também técnicas utilizadas, nomeadamente na confirmação da presença de mutações ou polimorfismos (37).
Para o estudo do repeat (CAG) utilizou-se o protocolo descrito para o diagnóstico de SCA6 (31).
Resultados
1. Constituição de uma base de dados clínicos de doentes com enxaqueca e de controlos, e respectivas famílias
Foi estabelecida uma base de dados clínica na Consulta Externa de Cefaleias do Serviço de Neurologia do Hospital Geral de Santo António (HGSA), com diferentes tipos de cefaleias, incluindo enxaqueca. Cerca de 8.415 doentes foram registados. De acordo com os critérios de diagnóstico da IHS de 1988, os doentes foram classificados: 2468 (29,3%) com enxaqueca [520 com aura (MA), 1573 sem aura (MO) e 375 com outras cefaleias tipo enxaqueca], 2402 (28,5%) com cefaleias tipo tensão [632 episódica, 992 crónica e 778 com formas combinadas], 169 (2%) com cefaleias em salvas [93 episódica, 49 crónica e 30 com periodicidade indeterminada] e 34 (0.4%) foram classificados com outras cefaleias primárias. Casos de cefaleias secundárias foram um total de 1856 (22,1%) e cefaleias não classificadas 1486 (17,7%).
2. Selecção clínica dos probandos
Após o estabelecimento da base de dados clínica procedeu-se a uma selecção dos probandos (na consulta externa de cefaleias) com base numa entrevista clínica e preenchimento de um formulário com os critérios de diagnóstico da IHS. Inicialmente, foram apenas seleccionados aqueles com um diagnóstico clínico definido, com história familiar positiva e com facilidade em aceder a outros membros da família. Contudo, uma série de casos esporádicos foram também colhidos. Foi obtida uma base de dados desses probandos (n= 138) e respectivas famílias.
3. Estabelecimento de um banco de ADN das famílias e controlos
Um total de 460 indivíduos, incluindo probandos, familiares, controlos e casos isolados, constitui, o banco de ADN de enxaquecas (Tabela I). Do banco de dadores de sangue do HGSA foram colhidos 76 indivíduos excluídos para dores de cabeça, classificados no estudo como controlos. O diagnóstico clínico de todos estes indivíduos foi estabelecido de acordo com os critérios publicados pela IHS, diagnóstico esse definido pela entrevista clínica e pelo preenchimento de um questionário cuida-
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dosamente elaborado para este estudo, como referido anteriormente. Todos os indivíduos deram o seu consentimento informado.
4. Estudo molecular no gene CACNA1A num grupo de famílias com diferentes tipos de enxaqueca
Para uma primeira fase do estudo molecular foram seleccionados 116 doentes, pertencentes a 90 famílias com diferentes tipos de enxaqueca (MO, MO e MA, MA, EHF, e outras cefaleias).
Considerando a existência de uma certa sobreposição clínica entre a ataxia e a enxaqueca hemiplégica, procedeu-se à determinação do tamanho dos repeats CAG localizados no exão 47 do gene CACNA1A, para os 116 doentes seleccionados. Note-se que a presença de uma expansão deste tripleto, que corresponde a um número de repetições superior ao normal, pode causar a SCA6. Não foram encontradas expansões alélicas do repeat CAG nos 116 doentes estudados, verificando-se um intervalo de tamanhos de 7-16 repeats; o alelo 11 é o mais frequente nesta população (Fig. 1.).
Foram seleccionados 90 probandos das 138 famílias que existiam no laboratório, para iniciar o estudo das mutações descritas no gene CACNA1A (Tabela II). Não foram encontradas mutações descritas para os 116 doentes estudados. Para a pesquisa de novas mutações foram seleccionadas 43 famílias, usando como critério base a existência de mais de um doente com o mesmo diagnóstico na família. Também neste caso não foram encontradas mutações causadoras da doença. Note-se que foram encontradas alterações na migração, detectadas por SSCP, em cerca de 50% das regiões do gene estudadas (exões e regiões intrónicas flanqueantes), sendo quase todas correspondentes a polimorfismos descritos para outras populações ou alterações que não parecem explicar a doença (Tabela III).
Tabela I. Descrição das famílias que participaram no estudo, constituídas por 1 a 3 gerações com doentes
Diagnóstico Nº Famílias Nº Total Nº Total Nº Total do Colhidas Doentes Doentes Familiares
Probando Colhidos Colhidos
Enxaqueca
sem aura 69 218 103 162
Enxaqueca
com aura 43 118 73 117
Enxaqueca
com e sem aura 10 35 19 27
Enxaqueca
Hemiplégica 7 32 22 30
Cefaleias em Salva 8 8 8 10
Outras Cefaleias 1 2 1 1
Total 138 413 226 347
Tabela II. Descrição clínica das famílias seleccionadas para iniciar o estudo de mutações no gene CACNA1A MO MO MA FHM Outras Total + Cefaleias MA Casos com História Familiar 34 3 29 8 1 75 Casos Isolados 5 0 2 0 4 11 Casos em Situação Desconhecida 0 1 1 0 2 4 Total 39 4 32 8 7 90
Tabela III. Polimorfismos detectados na região codificante do gene CACNA1A
Locali- Troca Freq. nos Freq. nos Conse- zação Nucleotídica doentes controlos quência
E4 nt 854 g→a Thr193 0.02 0.02 E6 nt 1151 a→g Glu292 0.01 0/50 E8 nt 1457 a→g Glu394 0.59 0.43 E12 nt 1904 g→a Thr543 0.02 0.02 E13 nt 2054 c→g Val593 0.02 0.02 E16 nt 2369 g→a Thr698 0.18 0.27 E19-2 nt 3029 g→c 0.2 0.43 Glu918Asp E19-2 nt 3125 g→c Thr950 0.01 0/37
E19-2 nt 2962/3 AC→GA all?/ Variant
E19-3 nt 3263 t→c Gly996 0.07 not done
E23 nt 4142 t→c Phe1289 0.39 0.46
E29 nt 4898 t→c Ser1541 0.05 0/50
E30 nt 5054 g→t Val1593 all?/ Variant
E30 nt 5089 c→t all?/ Variant Ala1605Val
E30 nt 5128 c→t all?/ Variant Ala1618Val
E42-2 nt 6407 g→a Thr2044 0.02 0/50
E46 nt 6909-6935 (His)n 0.03 0/46
E46 nt 6938 t→c His2221 0.03 0.54
Discussão
A dificuldade em aceder às famílias dos probandos, nomeadamente a pouca receptividade inicial por parte dos familiares à participação neste estudo, condicionou bastante o número de membros familiares observados. Como membros essenciais para a informatividade da família, a sua ausência pode conduzir ao impedimento da realização de determinado tipo de estratégia molecular necessária para a análise deste tipo de doenças. Quanto à participação dos dadores de sangue, considerados controlos uma vez que são igualmente entrevistados quanto à presença de cefaleias ou doenças relacionadas, tem ido bastante além das expectativas. Contudo, a
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aqueca...
Figura 1. Distribuição dos tamanhos dos alelos (CAG)n do gene CACNA1A, em 116 doentes com diferentes tipos de cefaleias.
dificuldade em obter controlos emparelhados por sexo e idade é já notória nesta fase inicial do estudo.
O banco de ADN de doentes e seus familiares, controlos e casos isolados com enxaqueca apresenta-se em constante crescimento, sendo prioritário o preenchimento das famílias que estão já incluídas no estudo, já que a exclusão do gene CACNA1A constitui um passo importante para o seu avanço. A informatividade das famílias condiciona de algum modo a estratégia molecular escolhida, daí que, para o estudo desta doença heterogénea complexa sejam necessárias famílias extensas e com a menor variabilidade clínica possível, considerando a existência de fenómenos de forte agregação familiar. Nestes doentes não foram encontradas expansões no CAG repeat do gene CACNA1A, o que se coaduna com a ausência de fenómenos atáxicos neste grupo. Foram encontrados diferentes polimorfismos, descritos e novos, quer nos exões quer nas regiões intrónicas envolventes. Devido à limitação do método usado para a detecção de alterações, existem dois fragmentos do gene que irão continuar a ser estudados, usando outras metodologias. Contudo, pode concluir-se que mutações no gene CACNA1A estão praticamente excluídas nestas famílias com enxaqueca.
Portanto, considerando as dificuldades apresentadas a nível da participação dos familiares para a entrevista e respectiva colheita de sangue e consequentemente a nível laboratorial, nem todos os objectivos inicialmente propostos foram cumpridos nesta fase do estudo (primeiro de três anos de duração prevista). Assim sendo, os objectivos não realizados foram adiados até que as famílias potencialmente informativas fossem completadas e o número de indivíduos doentes (probandos) e respectivas famílias alargasse até às cerca de 200 famílias, como inicialmente proposto. O número de indivíduos controlo terá também de aumentar substancialmente para garantir a possibilidade de aplicar as diferentes metodologias quantitativas ao estudo desta doença complexa. Contudo, os dados preliminares obtidos são já significativos para um estudo deste tipo e animadores quanto às perspectivas futuras.
Agradecimentos: Prestamos desde já os mais sinceros agradecimentos aos
membros das famílias e controlos pela sua preciosa colaboração e fornecimento das amostras de sangue.
Financiamentos: Este trabalho é financiado pela Fundação para a Ciência e
Tecnologia (FCT) através de um projecto de investigação (POCTI/MGI/34390/99) e pelo Financiamento Plurianual de Unidades de Investigação. Maria-José Castro é financiada por uma bolsa de investigação integrada neste projecto.
Numa fase inicial, este projecto obteve financiamento do Ministério da Saúde através de uma Bolsa do Fundo de Fomento da Investigação em Cuidados de Saúde assim como uma Bolsa Tecnifar.
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