No último colóquio científico de avaliação de risco da European Food Safety
Authority (EFSA, 2008) foi definido que a maneira de lidar com o contaminante AA,
amplamente distribuído nos alimentos, a fim de evitar riscos desnecessários, era seguir o princípio da precaução, devido ao conhecimento insuficiente dos mecanismos envolvidos num suposto processo de cancerigénese no homem. As autoridades recomendaram a redução dos níveis de AA, pelo uso de tecnologia apropriada no processamento alimentício distribuído comercialmente, monitorização anual e reporte dos dados às entidades reguladoras. Por outro lado, a minimização de teores de AA na alimentação caseira ficou a cargo da instrução dos consumidores a adoptarem normas apropriadas na preparação da sua própria alimentação. Toda a comunidade científica foi alertada para a falta de dados consistentes e incentivada a melhorar as abordagens seguidas nomedamente no desenho rigoroso das experiências a realizar.
Actualmente, o príncipio da precaução continua a ser aplicado em todos os países da União Europeia, e a EFSA espera, com os dados de monitorização reportados pelos vários países em relação aos anos 2007, 2008 e 2009, juntamente com estudos importantes que decorrem no momento, possa tomar uma posição mais concreta no próximo ano (2011) (EFSA, 2010).
Como a AA é um caso paradigmático, com um número razoável de estudos contraditórios, mostrando uma certa inconsistência nos resultados obtidos, o objectivo da comunidade científica continua a ser a análise de novos resultados que permitam uma melhor harmonização do conhecimento e consequente diminuição das incertezas. Neste âmbito, é requerida uma melhor compreensão dos mecanismos de acção da AA, nomeadamente do seu metabolito GA. Este último é frequentemente associado à
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cancerigénese pela AA, mas não totalmente compreendido, em particular em determinadas linhas de evidência como nos tumores da glândula mamária. A natureza dos eventos que contribuem para uma mutagénese e tumorigénese de AA e GA é o tópico actual de investigação.
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Dado que a AA é rapidamente distribuída para todos os órgãos e tecidos, incluindo o tecido mamário e visto que existem diversas linhas de evidência, quer em experimentação animal, quer em estudos epidemiológicos, para uma possível relação causal entre ingestão de AA e risco de carcinoma da mama, torna-se fundamental elucidar os potenciais mecanismos subjacentes a este fenómeno. Em particular, é importante elucidar o papel da GA, que é claramente apontada como o metabolito genotóxico e cancerígeno da AA por intermédio da formação de aductos de DNA e subsequente mutagenicidade. Neste âmbito, as células mamárias não tumorais MCF10A têm-se apresentado como modelos celulares adequados para não só avaliar a citotoxicidade e genotoxicidade de um dado agente cancerígeno para o tecido mamário, mas também para melhor compreender os mecanismos envolvidos. Na toxicidade induzida pela AA e pela GA, existem diversas hipóteses em debate, para além da formação de aductos, existe também uma possível lesão oxidativa do DNA, que até ao momento apenas foi estudada em células tratadas com AA. O estudo do envolvimento das ROS na acção deletéria da GA poderá clarificar esta hipótese. Também o papel do glutationo na destoxificação da GA em células mamárias não tumorais é fundamental, não só porque este composto é o maior antioxidante intracelular, mas também porque é um reconhecido factor para minorar a toxicidade de electrófilos.
Deste modo, o presente trabalho teve como objectivo principal avaliar a citotoxicidade e genotoxicidade da GA em células mamárias MCF10A, tendo como objectivos específicos:
- Definir o espectro de concentrações citotóxicas de GA em células epiteliais mamárias MCF10A, através da avaliação da viabilidade celular, recorrendo ao teste da redução do MTT.
- Avaliar o papel do GSH na citotoxicidade da GA, através da sua deplecção (BSO) ou da conjugação extracelular de GSH com GA.
- Testar o envolvimento do stress oxidativo através da modulação da citotoxicidade da GA, utilizando um antioxidante catalítico sintético (composto mimético da superóxido dismutase, SODm) e antioxidantes enzimáticos (CuZn-SOD peguilada e CAT peguilada).
- Medir os níveis de ROS em células epiteliais mamárias MCF10A tratadas com GA, através do ensaio da dihidrorodamina 123, uma sonda fluorogénica sensível a ROS. - Definir o potencial genotóxico da GA recorrendo ao ensaio do micronúcleo em
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3.1. Materiais
3.1.1. Reagentes
Os materiais utilizados neste trabalho estão indicados na Tabela VII, com excepção dos materiais de uso comum na manipulação de culturas celulares. A água utilizada foi captada a partir de um sistema de purificação Milli Q (Millipore, França).
Tabela VII. Materiais utilizados no presente trabalho.
Material Fonte
Ácido acético Sigma-Aldrich, E.U.A
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) Sigma-Aldrich, E.U.A Brometo de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5 difenil-tetrazólio
(MTT) Sigma, E.U.A
Catalase – polietilenoglicol (CAT-PEG) de fígado bovino Sigma, E.U.A
Citocalasina B Sigma, E.U.A
Cloreto de potássio Merck, Alemanha
Cloreto de sódio Merck, Alemanha
Dihidrorodamina 123 (DHR123) Molecular Probes, Oregon, E.U.A
Dimetilsulfóxido (DMSO) Sigma-Aldrich, E.U.A
Dulbecco's Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 Ham
(DMEM/F12) Sigma, E.U.A
Entelan Merck, Alemanha
Etanol Merck, Alemanha
Factor de crescimento epidérmico humano (EGF) Sigma, E.U.A Filtros de seringa millex, tamanho de poro 0,22 µm Millipore, França
Glicidamida (CAS Nº: 5694-00-8) Toronto Research Chem., Canada
Hidrocortisona Sigma, E.U.A
Hidrogenocarbonato de sódio Sigma-Aldrich, E.U.A Insulina de pâncreas bovino Sigma-Aldrich, E.U.A L-Butionina Sulfoximina (BSO) Sigma, E.U.A
L- Glutationo reduzido (GSH ) Sigma-Aldrich, E.U.A
Metanol Merck, Alemanha
Mitomicina C Sigma, E.U.A
Ribonuclease A (RNAse) Invitrogen, E.U.A
RPMI 1640 com L-glutamina e bicarbonato de sódio (0,1g/L) Sigma, E.U.A Solução de antibióticos (10000 U/mL Penicilina – 10 mg/mL
Streptomicina) Sigma, E.U.A
Solução de Giemsa (azur eosina)/Azul de metileno Merck, Alemanha
Solução de Tripan Blue (0,4%) Sigma, E.U.A
Soro de cavalo Sigma, E.U.A
Soro fetal bovino (FCS) Sigma, E.U.A
Superóxido dismutase – polietilenoglicol (SOD-PEG) de
eritrócito bovino Sigma, E.U.A
Tampão Fosfato (PBS) 0,01M; pH 7,4 Sigma-Aldrich, E.U.A Tert-butil-hidroperóxido (TBHP) Sigma-Aldrich, E.U.A Tóxina colérica de Vibrio cholerae Sigma, E.U.A
3.1.2. Linha celular
Neste trabalho foi utilizada uma linha celular bem caracterizada de epitélio mamário humano, MCF10A (CRL-
celular não tumoral preserva a maioria das características bioquímicas tecido mamário e foi inicialmente isolada
uma doente caucasiana de 36 anos historial familiar de neoplasia de mama
Em cultura, as células MCF10A
caracterizando-se por um crescimento aderente formando uma monocamada de células poliédricas com núcleos redondos de tamanho homogéneo e com nucléolo proeminente. Estas células possuem características de
mioepiteliais (Tait et al., 1990)
Figura 5. Fotografias de microscopia óptica de células crescem em monocamada, a
7ATCC: American Type Culture Collection
http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNu m=CRL-10317&Template=cellBiology
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Linha celular
Neste trabalho foi utilizada uma linha celular bem caracterizada de epitélio mamário -10317), adquirida na ATCC7 na passagem 97
preserva a maioria das características bioquímicas
inicialmente isolada do tecido epitelial da glândula mamária uma doente caucasiana de 36 anos, diagnosticada com doença fibro
r de neoplasia de mama (Soule et al., 1990).
as células MCF10A (Figura 5) apresentam uma morfologia epitelial, se por um crescimento aderente formando uma monocamada de células poliédricas com núcleos redondos de tamanho homogéneo e com nucléolo proeminente. Estas células possuem características de células luminais ductais e não de células
, 1990).
Fotografias de microscopia óptica de uma cultura de células MCF10A. Ampliação 100x. células crescem em monocamada, aderentes à superfície do frasco de cultura.
American Type Culture Collection; informação disponível sobre a linha celular em http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNu
10317&Template=cellBiology.
Neste trabalho foi utilizada uma linha celular bem caracterizada de epitélio mamário passagem 97. Esta linha preserva a maioria das características bioquímicas e endócrinas do do tecido epitelial da glândula mamária de diagnosticada com doença fibroquística e sem
apresentam uma morfologia epitelial, se por um crescimento aderente formando uma monocamada de células poliédricas com núcleos redondos de tamanho homogéneo e com nucléolo proeminente. s ductais e não de células
uma cultura de células MCF10A. Ampliação 100x. As
; informação disponível sobre a linha celular em http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNu
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3.2. Métodos
Todas as operações envolvidas no manuseamento das células e respectivos meios foram efectuadas em condições de assepsia, com material estéril, e em câmara de fluxo laminar. Os materiais e reagentes utilizados foram adquiridos comercialmente estéreis, ou foram esterilizados no próprio laboratório através de um processo de esterilização em autoclave a 121ºC durante 30 minutos, excepto indicação em contrário. A manipulação das culturas celulares foi sempre efectuada em câmaras de fluxo laminar vertical, sistematicamente desinfectada com etanol a 70% e com fungicida (Divoseptyl®, Diversey, Portugal). Protecção adicional foi conferida pela utilização da luz ultravioleta, aplicada nas câmaras de fluxo laminar e em toda a sala de cultura durante vinte minutos, antes da manipulação das culturas celulares.
3.2.1. Cultura de células MCF10A
As células MCF10A foram cultivadas em Dulbecco's Modified Eagle Medium
nutrient mixture F-12 Ham (DMEM/F12) suplementado com 5% de soro de cavalo, 1%
de solução de antibióticos (penicilina-streptomicina), 10 µg/mL de insulina, 0,5 µg/mL de hidrocortisona, 20 ng/mL de factor de crescimento epidérmico humano (EGF) e 100 ng/mL de toxina colérica, de acordo com a informação publicada (Soule et al., 1990). Os suplementos foram previamente preparados, esterilizados através de filtros de celulose com 0,22 µm de poro e armazenados de acordo com as instruções do fabricante.
As células foram rotineiramente mantidas em frascos de cultura de 75 cm2 (Sarstedt)
a 37ºC numa atmosfera humidificada com 5% CO2/95% ar. Quando atingiram uma
confluência superior a 80%, procedeu-se à subcultura das mesmas através de um processo de desagregação enzimática. Este processo, também designado por tripsinização, consistiu na decantação do meio de cultura celular, lavagem das células com uma solução de verseno (80 g/L NaCl, 4 g/L KCl, 2 g/L EDTA, 0,2 g/L vermelho de fenol, a pH alcalino), previamente aquecida a 37ºC e, posterior adição de uma solução de tripsina a 0,25 mg/mL. A tripsinização foi promovida por incubação a 37ºC (~5 min) interrompendo-se o destacamento das células aderentes pela adição de meio
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completo, ao que se seguiu a centrifugação das suspensões celulares obtidas (5 min a 131 x g; centrifuga Sigma, modelo 2-6, Alemanha). Os sedimentos celulares resultantes foram reconstituídos em meio de cultura completo e as células distribuídas por novos frascos de cultura.
A mudança do meio de cultura foi efectuada de acordo com a confluência apresentada pelas células, i.e., a cada três dias. As células foram passadas no máximo 10 a 12 vezes, o que significa que para todos os ensaios realizados as células MCF10A se encontravam entre a passagem 100-109.
3.2.2. Ensaio de redução do MTT
O ensaio do MTT é um dos métodos colorimétricos mais utilizados na determinação da viabilidade celular. De acordo com a literatura, este método permite avaliar a citotoxicidade de um determinado composto, pela medição da função mitocondrial das células (Mosmann, 1983). O ensaio consiste na redução metabólica do brometo de 3- [4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT), um sal de cor amarela, a um produto de cor púrpura, formazan, por acção de desidrogenases mitocondriais associadas à oxidação de NADH e NADPH, seguida de quantificação espectrofotométrica do produto formado. A absorvância dos cristais de formazan produzidos no interior das células metabolicamente activas, previamente dissolvidos com solventes orgânicos, reflecte indirectamente o número de células viáveis (Wang et
al., 2006).
Neste trabalho, a redução do MTT foi utilizada como indicador bioquímico de toxicidade da GA em células MCF10A, na ausência e presença de moduladores do glutationo e enzimas da via antioxidante, descrita em separado nas secções seguintes.
Para o ensaio propriamente dito, foram cultivadas em placas de 96 poços (Sarstedt) cerca de 4 × 103 células em 200 µL de meio de cultura por poço e incubadas a 37ºC sob
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3.2.2.1. Determinação da viabilidade celular
Culturas celulares com 48 horas foram expostas à GA em concentrações de 0,1; 0,25; 0,5; 1; 2; 3 e 4 mM, por um período de 24 horas. A solução de GA foi preparada em tampão fosfato pH 7,4, filtrada e conservada em aliquotas a -20ºC (solução stock). Conforme a concentração final pretendida, foram preparadas diluições intermédias, utilizadas apenas uma vez por experiência.
Após o tempo de incubação com o composto, as células foram lavadas com meio de cultura e foram aplicados 200 µL de solução de MTT (dissolvido em meio de cultura) numa concentração de 0,5 mg/mL. As placas foram incubadas por um período adicional de 2,5h e posteriormente, cuidadosamente lavadas com PBS. Após uma secagem cuidadosa das placas, adicionou-se 200 µL de dimetilsulfóxido (DMSO) a cada poço e homogeneizou-se bem de forma a solubilizar os cristais de formazan formados. A absorvância a 595 nm foi lida num leitor de microplacas Zenyth 3100 Multimode Detection (Anthos Labtec, Austria) (ver Figura 6). Aos valores de absorvância medidos foi subtraída a absorvância do DMSO e o resultado normalizado com o valor das culturas controlo, que correspondem a 100% de viabilidade celular.
Para as diferentes doses de GA analisadas foram realizadas três a nove experiências independentes. Em cada experiência foram efectuados oito replicados para cada uma das concentrações testadas. Os resultados obtidos foram analisados estatisticamente conforme descrito na secção 3.2.6.
O índice de toxicidade IC50 (concentração de GA requerida para inibir 50% do crescimento celular) foi determinado recorrendo ao software Graph Pad Prism (versão 5.01, E.U.A), por ajuste sigmoidal da curva dose-resposta.
3.2.2.2. Modulação de glutationo na citotoxicidade da glicidamida
A modulação do glutationo na citotoxicidade da GA em MCF10A foi efectuada por pré-incubação com butationina sulfoximina (BSO) ou por co-incubação com glutationo reduzido (GSH). O procedimento experimental foi adaptado do método de modulação de GSH em células expostas a AA descrito por Oliveira et al. (2009).
Culturas celulares com 24 horas foram pré-incubadas com 0,1 mM de BSO por um período de 24 h.Terminado este tempo o meio foi removido, as células lavadas com meio de cultura e expostas a 1 mM de GA por mais 24 h. A concentração de GA
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aplicada foi escolhida, com base nos resultados preliminares, de modo a que fosse atingido um efeito com uma diminuição de ~ 50% da viabilidade celular.
Nas experiências de co-incubação, culturas celulares com 48 horas foram simultaneamente expostas a 1, 2 ou 3 mM de GA e GSH a 1 mM, por um período de 24 h. Concentrações de 3 mM de GSH foram igualmente testadas com 1 mM de GA. Após o período de incubação com os compostos, procedeu-se ao ensaio de viabilidade celular pelo ensaio de redução do MTT conforme descrito na secção 3.2.2.1 (ver Figura 6).
As soluções stock dos moduladores foram preparadas em água, esterilizadas por filtração, e conservadas em aliquotas a -20ºC. O volume necessário foi adicionado directamente à cultura de células de forma a alcançar a concentração final desejada. Ambos os moduladores, BSO e GSH, foram incubados com as células na ausência de GA para observação do efeito do próprio composto em si.
Os valores de absorvância apresentados pelas culturas de células MCF10A, sem adição de GA, BSO ou GSH, ou seja, as culturas controlo, correspondem a 100% de redução do MTT. Pelo menos cinco experiências independentes foram realizadas para a co-inbubação da GA com GSH e três experiências independentes com pré-incubação com BSO. Em cada experiência, foram usadas oito culturas individuais (replicados). Os resultados obtidos foram analisados estatisticamente (ver secção 3.2.6).
3.2.2.3. Efeitos de antioxidantes na citotoxicidade da glicidamida
Para determinar o papel relativo de ROS na citotoxicidade da GA foi utilizado um antioxidante catalítico sintético (composto mimético da superóxido dismutase – SODmimético), gentilmente cedido pela Professora Batinic-Haberle (Duke University), bem como antioxidantes enzimáticos (CnZn superóxido dismutase peguilada - CuZn- SOD-PEG e a catalase peguilada - CAT-PEG) com funções próprias no sistema de defesa oxidativo da célula (Cecarini et al., 2007).
À semelhança dos ensaios anteriormente descritos, culturas celulares com 48 horas expostas a 1 mM de GA, foram co-incubadas com SOD-PEG (50 U/mL) ou com CAT- PEG (50 U/mL) por um período de 24 h (Cao et al., 2008). Ambas as enzimas também foram incubadas na ausência de GA, para testar a viabilidade das células perante estes compostos individualmente. Em paralelo, duas concentrações diferentes (1 e 5 µM) de Mn (III) 5,10,15,20-tetrakis (N-etilpiridínio-2-il) porfirina (MnTE-2-PyP) foram co-
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incubadas com 1 mM de GA durante 24h. Após o período de incubação com os compostos, procedeu-se ao ensaio de viabilidade celular conforme descrito na secção 3.2.2.1 (ver Figura 6).
A SOD-PEG e a CAT-PEG foram preparadas e conservadas a -20ºC, em soluções de concentração ideal à pipetagem de volumes de composto < 5% do volume total de incubação. As soluções de SOD mimético foram preparadas na altura de utilização.
Os valores de absorvância das culturas de células MCF10A, sem adição de GA, SOD-PEG, CAT-PEG ou MnTE-2-PyP, ou seja, culturas controlo, correspondem a 100% de redução do MTT. Realizaram-se duas e três experiências independentes no caso dos antioxidantes enzimáticos e antioxidante catalítico sintético, respectivamente. Cada experiência foi efectuada com oito replicados de culturas individuais. Os resultados obtidos foram analisados estatisticamente conforme descrito na secção 3.2.6.
Figura 6. Fluxograma simplificado do ensaio de redução do MTT. Comparação da abordagem seguida na determinação da viabilidade celular das MCF10A na presença da glicidamida, moduladores do glutationo (co-incubação com GSH e pré-incubação com BSO) e compostos antioxidantes (SOD, CAT e MnTE-2- PyP). GA + BSO GA SOD/CAT/MnTE/GSH 0 24 48 72 74,5 4 × 103 células 200 µL meio Incubação* 0,1 mM BSO
Substituição do meio de cultura Adição de compostos
Descarte do meio cultura Lavagem das células Adição de GA 1mM
Lavagem das células; Adição de MTT 0,5 mg/mL Incubação*
Lavagem com PBS 0,01 M pH 7,4 Solubilização com DMSO