Theoretically, for proton transfers via thiols, a maximum depletion of deuterium would be expected for 50 to 60 vol.% D2O in the aqueous medium. The ratio of the methane isotopologues CH3D/CH4 in the headspace gas over MCR-I containing assays was determined as a function of the molar fraction of D2O (20 to 96 vol.%) in the medium.
Methan: einfachster Vertreter der Kohlenwasserstoffe
Globale und interstellare Bedeutung
Wenn der Permafrost auftaut, ist aufgrund der thermischen Zersetzung von Methanhydraten (CH4 · xH2O) und zusätzlicher Methanvergärung mit großen Methanemissionen zu rechnen. Abbildung I-2 b zeigt die Struktur von Methanhydraten oder – chemisch korrekt – Methanclathraten, die durch seismische Untersuchungen anhand ihrer Reflektoreigenschaften identifiziert werden können.
Biotische und abiotische Entstehung
Etwa 5000 Gt C entsprechen in etwa der Gesamtmenge an fossilen Brennstoffen weltweit und dem 1500-fachen des Methanvorrats in der Atmosphäre. Unter der Annahme eines Monosaccharids als Kohlenstoffquelle haben Methanbakterien nur eine Ausbeute von 1/3 Mol ATP pro Mol Kohlenhydrat, weshalb die Methanogenese im Vergleich zu anderen katabolen Stoffwechselwegen wie Atmung oder Photosynthese ein eher ineffizienter Prozess ist (siehe Deckwer et al., 2008; Fuchs.
Abbau in der Atmosphäre
Harting et al. Der Anteil steigender Methankonzentrationen am anthropogenen Treibhauseffekt wird derzeit auf 14 % geschätzt (vgl. Deckwer et al., 2008).
Aerobe und anaerobe Oxidation durch Mikroorganismen
Nach der Carbonylierung von CH3-X zu Acetyl-CoA erfolgt eine reduktive Carboxylierung zu Pyruvat als Vorstufe anaboler Stoffwechselwege (vgl. Deckwer et al., 2008). Auch die Konzentrationen der für ANME-2-Archaeen charakteristischen Biomarker (Archaeol, Crocetan, Pentamethyleicosatrien) und Desulfosarcina-ähnlichen Bakterien (11-Hexadecensäure) stiegen mit der Zeit deutlich an (vgl. Nauhaus et al., 2007).
Aktivierung durch Metallkomplexe im Labormaßstab
Bei einem Druck von ca. 20 bar wird ∆G des sulfatgebundenen AOM einen Wert von −40 kJ mol−1 nicht überschreiten, so dass die Menge an oxidiertem Methan, um die Struktur der Matten aufrechtzuerhalten, die des assimilierten Kohlenstoffs um mehr als eine Größenordnung übersteigt in ihrem Umfang überschreiten (vgl. Michaelis et al., 2002). Aufschlussreiche Parallelen zu einem aktuell diskutierten Hydridmechanismus der MCR (siehe Kapitel I 2.4.2, II 3.2) ergaben sich aus Untersuchungen an einem Nickelocen-LiAlH4-System in Tetrahydrofuran, das bei 70 °C im Überstand einen H-D-Austausch zwischen CH4 und D2 eingeht (vgl. Rubtsova et al., 1993).
Großtechnische Verfahren
Abhängig vom Katalysator und den Reaktionsbedingungen (Feststoff-/Wirbelschichtreaktor; Nieder-/Mitteldruckverfahren), Flüssiggas (Gassol → C3-C4), Benzin (C5-C10), Kogasin (C10-C18), Paraffine (> C28) und es werden geringere Mengen an Alkoholen gebildet (vgl. Deckwer et al., 2008). Analog bietet die Untersuchung dieser Stoffwechselprozesse viele Anregungen und Schlussfolgerungen zur Lösung technischer Probleme (vgl. Liebermann und Rosenzweig, 2004).
Metalloporphyrinoide
Vorkommen und Bedeutung
Dieses chemisch labile, blaugrüne Pigment wird schnell abgebaut, kann aber durch Methylierung der Hydroxymethyl- und Propionsäure-Seitenketten stabilisiert werden. Hier sind auch metallfreie Geoporphyrine zu nennen, während das in Abbildung I-8b dargestellte Nickel-Desoxophylloerythroetioporphyrin oder die entsprechenden Vanadylderivate weitaus häufiger in Sedimenten vorkommen (vgl. Deckwer et al., 2008).
Cofaktor F430: Struktur, Nomenklatur und Koordinationschemie
Bei der Reinigung von F430 entsteht nach einem noch unbekannten Mechanismus auch dessen 19,20-Didehydro-Derivat F340 mit einem charakteristischen Corinyl-Chromophor (siehe Abbildung I-16b). Alle weiteren Einzelheiten zur IUPAC/CA-Nomenklatur von F430 und seinen abgeleiteten Strukturen sind in den Tabellen I-1 und I-2 enthalten.
Eisen-, Nickel- und Cobalt-Komplexe im Vergleich
Beim anschließenden Übergang zur Koordinationszahl sechs wird jedoch eine bathochrome Verschiebung mit zusätzlicher Hyperchromie beobachtet (vgl. Jaun und Thauer, Bertini und Luchinat). Diese Befunde sprechen eindeutig für F430 als effizienten Katalysator für die Methylreduktion und für Cobalamin als geeignete Methylgruppe Transferagent (vgl. Thauer f.).
Chromatographische Trenntechniken
Fließmitteloptimierung
Das PRISMA-Modell (adaptiert von Nyiredy et al. f.): a) Angleichung der Lösungsmittelstärken; b) Kombination der mobilen Phase. Bei Bedarf kann die Lösungsmittelstärke der Gesamtmischung unter Beibehaltung der gewählten Selektivität auch mit n-Hexan reduziert werden (vgl. Nyiredy et al.
Dünnschichtchromatographie
Auch die Ionenpaarchromatographie an vorimprägnierten RP-Schichten hat sich für geladene Komponenten als sehr effektiv erwiesen (vgl. Sherma und Fried, 1996: 24 f.). Aufgrund der Sättigung der Kammer verringert sich der Bedarf an Fließmittel bei gleicher Distanz und die Rf-Werte sind entsprechend niedriger.
Hochleistungs-Flüssigchromatographie
Das „Subtraktionsmodell“ für Selektivität in der RP-Chromatographie basiert auf fünf Arten von Molekül-Säulen-Wechselwirkungen: Hydrophobie – sterischer Widerstand – Wasserstoffbindung durch Säulensäure – Wasserstoffbindung durch Säulenbasizität – Kationenaustauschaktivität der Säule. Im experimentellen Design dieser Arbeit spielen zwei RP-Phasen eine dominierende Rolle: Chromolith® und Hypercarb® (siehe Kapitel I 4.7).
Massenspektrometrie
Größen, Einheiten und Symbole
Matrix-unterstützte Laserdesorptions-Ionisation
Das spezielle Verfahren der MALDI-Massenspektrometrie nach Zerfall (MALDI-PSD-MS) ermöglicht es, nicht nur die in der Ionenquelle gebildeten Fragmentionen zu erfassen, sondern auch solche Ionen, die erst während der Flugstrecke des Analysators entstehen (vgl. Rücker et al.). In der Absorptionswolke wurde unter anderem auch atomarer Wasserstoff nachgewiesen, was unter erhöhtem Protonendruck auf die Existenz von Radikaladdukten [M + H•] gegenüber der Matrix bzw. der Probe schließen lässt (vgl. Knochenmuss S.).
Plasma-basierende Verfahren
NMR-Spektroskopie
Paramagnetische Systeme
Einem Gerät mit umgekehrter Geometrie (magnetisch vor dem elektrostatischen Analysator) gelingt es, alle Molekülfragmente nacheinander zu detektieren: DADI = Direct Analysis of Daughter Ions oder MIKE(S) = Mass Analyzed Ion Kinetic Energy (Spectrum) (vgl. Budzikiewicz und Schäfer) Ersteres ist eine Kopplung ohne Energieaustausch zwischen räumlich diskreten magnetischen Momenten, vorausgesetzt, dass der Elektronenteil auf dem Metall und der Kernteil auf dem Rest des Moleküls lokalisiert ist.
Kryo-Probenkopf
Eine detaillierte Behandlung der NMR-Spektroskopie paramagnetischer F430-Derivate findet sich im gesamten Kapitel I der Dissertation von I. Im Allgemeinen kann die Empfindlichkeit eines NMR-Experiments als die Beziehung zwischen dem Signal und dem Rauschen des gesamten Empfängersystems verstanden werden, mit der Signal, das in der in der Empfängerspule der Sonde induzierten Spannung angegeben ist, bedeutet, dass das Rauschen andererseits aus thermischem Rauschen in der Empfängerspule, im Vorverstärker und in der Probe selbst besteht.
Shigemi-Meßröhrchen
Beim Einsatz von Kryosonden wird der Rauschbeitrag der Spule im Vergleich zu dem der Probe gering. Darüber hinaus kann der Lärmbeitrag um den Faktor 2,7 reduziert werden, indem der Durchmesser des Rohrs von 5 mm auf 3 mm verringert wird, wobei gemäß Gleichung I-28 die Konzentration des zu messenden Stoffes innerhalb des Rohrs erhöht werden soll möglichst gleiche Reichweite.
Elektrophile α-Methylsulfanylierung zyklischer Ketone
Substituierte Enolate von Cyclohexanon-Derivaten zeigen eine stereochemische Präferenz gegenüber axialer Methylsulfanylierung (vgl. Caine, 2005). Wenn andererseits eine elektrophile Trifluormethylierung angestrebt wird, werden Trifluormethylsulfanylamide (CF3S−NHR) als innovative Reagenzien empfohlen, die effiziente CF3S+-Donoren in saurer Lösung darstellen (vgl. Bacque et al., 2007).
TLC- und HPLC-Optimierung
Nach dem Abschaben der Substanzbereiche, der Desorption der Einzelkomponenten und der Entsalzung der Eluate lag F430Me5 (pTLC) in einer Reinheit von ≥ 97 % (HPLC) vor, mit ≈ 1,2 % F340Me5 und. Da diese Phase bisher nur im analytischen Maßstab verfügbar ist, ist die Säule bereits bei 1 μmol Brutto-F430-Fraktion pro Zyklus deutlich überladen.
Derivatisierung der Cofaktoren
Letzteres wird als polar protisches, wenn auch leicht nukleophiles Lösungsmittel für Pentacarbonsäuren und Pentaalkylester F430 und Derivate dringend empfohlen, da es den Ni(II)-Komplex im diamagnetischen Zustand hält, aber im Gegensatz zu DCM leicht zu dosieren ist. Die Absorptionsmaxima sind hypochrom verschoben (432 nm → 378 nm; 274 nm → 229 nm), wobei durch Schütteln gegen H2O das ursprüngliche UV/VIS-Spektrum für die Demethylierungsprodukte in der wässrigen Phase wiederhergestellt wird.
Chromatographische Aufarbeitung der Rohextrakte
Hydrolyse der Ester in 20 % H2SO4 und Co-Injektion auf Säureebene und durch Vergleich der NMR-Spektren. Abbildung I-19 zeigt sofort, dass der Anteil der MeS-Variante (rot) relativ zu F430 und seinen Derivaten (blau) im pentamethylierten Rohisolat Nr. 2 ist deutlich höher als in der entsprechenden Mischung Nr. Eine Kaltmethylierung des Rohisolats Nr. Allerdings ist zu beachten, dass sich die Rohisolate bereits in ihrer Zusammensetzung deutlich unterschieden.
Spektroskopische und spektrometrische Charakterisierung
UV/VIS, CD
Spektren: a) HPLC-Isolate aus Rohfraktion Nr. 4 – Pentamethylester in CH2Cl2; b) HPLC-Isolate aus Rohfraktion Nr. Die umfassendste Übereinstimmung im CD-Spektrum von F430 und seiner MeS-Variante sowohl auf Säure- als auch auf Esterebene zeigt deutlich, dass das Methylsulfanylderivat in den Ringen A, B und C von Hydrocorphin die gleiche absolute Konfiguration aufweist ( siehe Abb. I-9).
MALDI-TOF-/-ICR-MS
Das charakteristische MS-Muster von F430 und seinen Derivaten basiert auf einer Überlagerung des Ni-Isotopenmusters mit den C-12/C-13-Signalen (siehe Abschnitt I 1.2.2). MALDI-ICR-MS (positiver Modus, 4-CCA-Matrix): 2-Punkt-Kalibrierung mit einer Mischung aus Rohisolat Nr.
LA-ICP-SF-MS
Mit der Laserablationsmethode können die benötigten Probenmengen auf den hier entscheidenden Mikrogrammbereich reduziert werden. Mithilfe der HPLC-Integrale für Komponenten mit m/z freien Säuren oder m/z Pentamethylester konnten die 60Ni/32S-Molquotienten in den verwendeten Isolaten berechnet und mit den LA-ICP-SF-MS-Auswertungen verglichen werden.
NMR
2 reichten bereits aus, um die Zusammensetzung der F430-Variante zu bestimmen, die wesentlichen Schritte der Strukturaufklärung wurden am Rohisolat Nr. durchgeführt. Bei diesem Isomer der F430-Variante bestehen die auffälligsten Unterschiede in den chemischen Verschiebungen für die Protonen und den Kohlenstoff Atome des Cyclohexenonrings.
Versuche zur Semisynthese der F430-Modifikation
Analytik von Cofaktor F430
Wenn ausreichende Mengen der MeS F430-Variante aus biogenen oder teilsynthetischen Quellen verfügbar sind, können andere spektroskopische Methoden zur Charakterisierung eingesetzt werden. Während die C-S-Streckschwingungen im Bereich von 710–570 cm-1 liegen und als schwache, breite IR-Absorptionsbanden keine praktische Bedeutung haben, sind die entsprechenden Raman-Signale sehr ausgeprägt (vgl. Pretsch et al.
Biochemische Relevanz der MeS-Variante
MeS-F430 als neu entdeckte Variante des F430-Cofaktors (vgl. Krüger et al., 2003), wobei auch Protein II mit dem Methanogen Hydrocorfin F430 im relativen Überschuss vorhanden ist (3 % der gesamten zellulären Proteinfraktion). Folglich sollten mögliche Funktionen des (172S)-172-MeS-Substituenten im Zusammenhang mit den Sequenzunterschieden zwischen Protein I und MCR aus Methanogenen betrachtet werden (vgl. Kahnt et al., 2007).
Semisynthetische Methylsulfanylierung
Für eine elektrophile Substitution mit CF3−S+ an Position 172 bieten Trifluormethylsulfonamide und hypervalente I(III)-CF3-Verbindungen als innovative Reagenzien vielseitige Möglichkeiten (siehe Abschnitt I 1.6). α-Tetralon eignet sich besonders für Modellsynthesen zur Umwandlung des Cofaktors F430 in seine MeS-Variante, insbesondere im Hinblick auf Aussagen über die sterische Präferenz des Rests in Position 172.
Dünnschichtchromatographie
Im Fall von HClO4 wurde der größte Teil des solubilisierten Kieselgels durch 5-minütige Zentrifugation bei etwa 280 × g entfernt und der Überstand über SPE-HLB-Kartuschen entsalzt (mit H2O spülen, mit MeOH desorbieren). Nach Beschleunigung der Phasentrennung durch 1-minütige Zentrifugation bei ≈280×g wurden die DCM-Phasen mit einer gasdichten Hamilton-Spritze entfernt, die letzten Wasserspuren durch Filtration durch Watte und Zellulose entfernt und die Mischung zur Trockne eingedampft .
Bakterienmatten: Isolate Nr. 1-4
Nach 10-minütigem Schütteln setzten sich die unlöslichen Carbonate innerhalb von 5 Minuten ab und der mit der Zellsuspension vermischte Überstand wurde 10 Minuten lang bei 24.000 x g zentrifugiert. Zur Extraktion der Hydrocorphinoid-Nickelkomplexe wurde diese Suspension mit KOH auf pH 7 eingestellt, 20 Minuten mit einer Titanplatte bei maximaler Leistung und einer Temperatur von 4 °C im Eisbad beschallt und schließlich 30 Minuten bei 24.000 °C zentrifugiert . ×g.
Entsalzung
Die adsorbierten Nickelkomplexe wurden mit MeCN:H2O:TFA v/v eluiert, wobei diese Hydrocorphinoide erneut auf eine C-18-Säule (1 cm x 25 cm) in der verbleibenden wässrigen Lösung aufgetragen wurden, nachdem das Acetonitril an einem Rotationsverdampfer abgezogen wurde. und konnte über einen MeCN-Gradienten desorbiert werden. Nach erneuter Entfernung des organischen Lösungsmittels wurde das Eluat mit KOH neutralisiert und auf eine QAE Sephadex A25-Säule übertragen.
Veresterung der Rohextrakte
Hydrolyse von Cofaktor-F430-Pentamethylestern
Epimerisierung am MeS-Substituenten
HPLC von F430-Pentacarbonsäuren und -methylestern
Nach Entsalzung und Rotation wurde das Zwischenprodukt (≈ 1,8 µmol) als 10 mM Lösung in 180 µL 0,1 M KH2PO4-Puffer (pH 5,8) injiziert, wobei die Trennung der beiden Hauptkomponenten über Hypercarb® 5 µm mit Vorsäule erfolgte : Injektionsvolumen: 20 µL;.
UV/VIS-, CD-Spektroskopie
Zur Aufnahme und Verarbeitung der CD-Spektren wurde ein JASCO J-170 Spektropolarimeter mit JASCO Spectra Manager Software (Version 1.53.00) verwendet, wobei sich die Proben in Präzisionsküvetten aus Quarzglas (d = 0,100 cm) befanden.
MALDI-Massenspektrometrie
MCRsilent (siehe Abb. II-1 c) enthält das verknüpfte CoM-S-S-CoB-Heterodisulfid, wobei die CoB-Einheit nahezu mit der Anordnung in der MCRox1-silent-Struktur übereinstimmt. Die intermediäre Methyl-Ni(III)-Spezies kann hier weggelassen werden, und die Existenz mehrerer methylierter Aminosäuren (Arg, Cys, Gln, His) in der α-Untereinheit von Methanothermobacter MCR weist wahrscheinlich auf die Bildung von Methylradikalen im Katalysezyklus hin ( siehe Kap. II 1.1).
LA-ICP-SF-MS
NMR-Spektroskopie
Nach der Reinigung mittels semipräparativer RP-HPLC wurden die Konfigurationsisomere (172S)-172-MeS-F430Me5 und (172R)-172-MeS-F430Me5 mithilfe von SPE-HLB-Kartuschen entsalzt (siehe Abschnitt I, 4.3). Da die Messung von (172S)-172-MeS-F430Me5 alle paar Wochen wiederholt werden musste, erwies es sich als vorteilhaft, dieses Isomer vor der zweiten Verwendung mittels pHPTLC zu reinigen (siehe Abschnitt I 4.1).
Partialsynthese
Labormaterial
Kristallstruktur von MCR ox1-silent und MCR silent
In MCRox1-silent (siehe Abb. II-1 b) sind die Coenzyme B und M im aktiven Zentrum gebunden, wo das Thiol-S von CoM als −SH oder −S− axial an Ni(II) in einem Abstand von koordiniert 2, 42 Å und interagiert mit den phenolischen Hydroxygruppen von Tyrα'333 und Tyrβ367 und einem H2O-Molekül zwischen den beiden Coenzymen. Ein zweites Sulfonat-O-Atom bildet Wasserstoffbrücken zum Lactamring des Cofaktors F430 und zur Hydroxygruppe von Tyrβ367, ein drittes zu einem H2O-Molekül in der Nähe der Sulfonatbindungsstelle in MCRox1-silent.
Gegenüberstellung der beiden MCR-Isoenzyme
Katalytische Eigenschaften der MCR
Die Stabilisierung des MCRred1-EPR-Signals durch Methyl-CoM in Abwesenheit von CoB kann dahingehend interpretiert werden, dass die elektrophile Methylierung von Ni(I) F430 eine Protonierung von Methyl-CoM im Sulfoniumderivat erfordert. Allerdings wäre eine Modifikation des Mechanismus I denkbar, bei der Methyl-CoM und Ni(I) F430 wiederum Methyl-Ni(III) bilden, das ohne vorherige Reduktion direkt zu CH4 und Ni(III) F430 protolysiert wird.
Lösungsmittel-Isotopeneffekte
- Vergleich zwischen H 2 O und D 2 O
- Fraktionierungsfaktoren
- Kinetische und thermodynamische Effekte
- Besonderheiten bei Enzymen
- Enzymatische Spaltung von C−H-Bindungen
- Modellierung enzymatischer Isotopeneffekte
Letztere Reaktion wird in der bioorganischen Chemie häufig zur Quantifizierung der katalytischen Aktivität von Hydrogenasen verwendet. Änderungen der Lösungsmittelviskosität können bei diffusionsabhängigen Prozessen primäre und sekundäre Effekte hervorrufen.
CH 3 -Metabolismus von Methanosarcina barkeri
Bestimmung des Fraktionierungsfaktors für Thiole
Im 1H-Spektrum aller deuterierten Chargen erschien die Sulfanylgruppe als breite Linie mit einer Schulter, deren grobe Integration, normiert auf das tripletoide Signal (2H) für H2C(7'), einen durchschnittlichen ΦSL-Wert von 0,51 (n = 3) berechnet werden. Das SH-Integral nimmt mit steigender D2O-Konzentration ab, und da die zugrunde liegenden Spektren ohne Unterdrückung des Lösungsmittelsignals aufgenommen wurden, ergab der Fraktionierungsfaktor ΦSL (CoB) bezogen auf ∫H2C(7') = 2H n = 2).
Analyse von Gemischen aus Methan-Isotopologen
Die hohe Korrelation zwischen dem volumetrisch ermittelten Deuteriumgehalt in der Gasphase und den berechneten Integralwerten lässt sich aus Abbildung II-9b ablesen. Darüber hinaus ist MCR nicht in der Lage, hinzugefügtes CoM bei einem Methanpartialdruck von 1 bar in der Gasphase in Abwesenheit von MeCoM zu alkylieren.
Simulationen zur Reaktionskinetik der MCR
Fraktionierungsfaktoren, Methan-Analytik
Schlußfolgerungen zum Reaktionsmechanismus
Synthese von Coenzym B
Fraktionierungsfaktor für R−SH
Isolierung und Aufreinigung von MCR I
Bestimmung der Protein-Konzentration
Aktivitätstest für MCR I
Analyse der wäßrigen Phasen
Überprüfung des D 2 O-Gehaltes
Simulationen
Labormaterial
Charakteristika der MCR in Gegenwart von Polysulfanen
Herstellung von Diorganodisulfanen
Sulfan-Disulfan-Austauschreaktionen
Biochemische Eigenschaften von Coenzym M
Kristallisationstechniken
Dekomplexierung von makrozyklischen Tetrapyrrolen
Fällung und Komplexierung von Nickelionen
Neutronenaktivierung von Nickel-haltigen Verbindungen
