Fraktionierungsfaktoren

Jede Verbindung mit aciden Protonen, die in einem Gemisch aus H₂O und D₂O gelöst wird, enthält im Gleichgewicht an allen austauschbaren Stellen einen bestimmten An- teil von Deuterium, entweder identisch mit dem D-Anteil im Lösungsmittel oder kleiner beziehungsweise größer. Ein quantitatives Maß für die Deuterium-Präferenz einer be- stimmten funktionellen Gruppe A relativ zum Solvens S liefert der isotopische Fraktio- nierungsfaktor Φ, wobei n den molaren Anteil von Deuterium (D⁺ / D^• / D⁻) bezeichnet (siehe Gl. II-5). Mit guter Näherung können die Fraktionierungsfaktoren für mehrere austauschbare Stellen im Molekül als voneinander unabhängig betrachtet werden, was als die Regel der Geometrischen Mitte bekannt ist und auch im Falle von geringen

Abweichungen hinreichend zuverlässige Schlußfolgerungen bei mechanistischen Fra- gestellungen erlaubt:

(Gl. II-5).

Zugleich definiert die Regel der Funktionellen Gruppe, daß der Fraktionierungsfaktor eines beliebigen aciden Restes im Molekül nur von der chemischen Natur dieser Grup- pe abhängt, unabhängig von deren molekularen Umgebung. Somit wird beispielsweise allen Alkoholen derselbe Φ-Wert zugeordnet, allen Thiolen derselbe, etc. Eine Übersicht der am häufigsten verwendeten Gleichgewichts-Fraktionierungsfaktoren liefert Abbildung II-3. Qualitativ sind die aufgelisteten Φ-Werte relativ einfach zu inter- pretieren. So liegen einige davon in der Gegend von 1, das heißt Deuterium bindet an

die entsprechenden protischen Stellen mit derselben Affinität wie an umgebendes H₂O. Dies ist der Fall für Hydroxy-, Carboxyl-, Amino- und Ammonium-Funktionen in den Seitenketten unter anderem der Aminosäuren Serin, Lysin, Asparagin- und Glut- aminsäure sowie Histidin. Carbonyl-Hydrate und Hemiacetale hingegen akkumulieren Deuterium, da eine partielle Resonanz die freie Drehbarkeit der C−OH-Bindung ein-

Φ_A [AD] AH [ ]

--- SOH[ ] SOD

[ ]

--- [AD] AH [ ]

--- 1 n( – ) ---n

= =

O

C R

C R

O O

L

R

O R R

L +

O L

N L

N L R R R

+

S L R L

O O R

C L L

R

1.0

1.0

1.23-1.28

0.69

0.47-0.56

0.92

0.97

0.40-0.46

0.62-0.64 (sp) 0.78-0.85 (sp²) 0.84-1.18 (sp³)

Funktionelle Gruppe

Funktionelle Gruppe

) )

Abb. II-3. Isotopische Fraktionierungsfaktoren Φ biochemisch relevanter funktioneller Gruppen (L = Lyonium) relativ zu H₂O (verändert nach Schowen, 1977: 70).

schränkt und die Bindungsaffinität für L erhöht. Aus demselben Grund zeigt N−L in Peptidbindungen einen Fraktionierungsfaktor von ≈ 1.1. Trägt das Sauerstoffatom in Lyonium-artigen Verbindungen wie Hydronium oder protoniertem Ether-O von Estern und Acetalen eine positive Partialladung, so wird die Bindung zu L geschwächt und folglich Deuterium abgereichert. Prinzipiell ließe sich dies auch auf Ammonium-Grup- pen anwenden, bei denen jedoch der verringerte Bindungsgrad entlang der N−H- Streckschwingung durch eine erhöhte sterische Resistenz der Tetraederstruktur kom- pensiert wird. Der niedrige Φ-Wert für Thiole, z. B. in den Seitenketten der Prolin-Ra- cemase, beruht auf dem geringen Widerstand einer S−L-Bindung gegenüber Streck- und Beugedeformationen. Spielt also ein Cystein-Rest eine Schlüsselrolle als Nucleo- phil im Katalysezyklus, so erwartet man unter Umständen einen inversen Lösungsmit- tel-Isotopeneffekt. Der auffallend niedrige Fraktionierungsfaktor für Hydroxid wiederum wirkt sich auf alle Enzymmechanismen mit Alkoxid-Intermediaten aus, beispielsweise in den Seitenketten von Serin oder Threonin. Dessen primäre Ursache beruht auf dem Zusammenwirken dreier Φ-Werte von jeweils 0.7 für Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Lösungsmittel und den drei einsamen Elektronenpaaren am Sauerstoff.

Auch Spezies ohne austauschbare Protonen rufen manchmal spürbare Lösungsmit- tel-Isotopeneffekte hervor, und zwar in den Fällen, worin die Freie Transfer-Enthalpie

∆G_tr beim Übergang zwischen H₂O und D₂O für das jeweilige Ion von null verschieden ist. Diese sogenannten Medium-Effekte resultieren aus protischen Positionen in der Solvatationshülle und betreffen häufig biologisch relevante Spezies wie Mg²⁺ (0.9), RCOO⁻ (≈ 1) oder Cl⁻ (≈ 0.8). Der besonders tiefe Wert für RS⁻ im Bereich 0.4-0.7 läßt bei der Beteiligung von Thiolat in katalytischen Reaktionen einen signifikanten Me- dium-Effekt zusätzlich zum Lösungsmittel-Isotopeneffekt erwarten.

Neben den soeben behandelten thermodynamischen Effekten existieren auch kine- tische Fraktionierungsfaktoren für Übergangszustände in Katalysezyklen. Diese können nicht direkt experimentell gemessen werden, sondern sind nur über Modell- untersuchungen und k_H/k_D-Quotienten oder mittels Berechnung von Schwingungs- energien zugänglich. Die meisten H-Brückenbindungen, das heißt jene mit Bindungs- energien ≤ 20 kJ mol⁻¹, zeigen Φ-Werte nahe bei 1 und tragen deshalb kaum zu Lö- sungsmittel-Isotopeneffekten bei. Vergrößern sich beim Übergang von D₂O zu H₂O die

∆pK_a-Werte der Wasserstoffbrücken-Donatoren und -Akzeptoren, so steigt die Bin- dungsenergie, und die Fraktionierungsfaktoren für die Brücken-Protonen nehmen ab.

Dabei basieren primäre Wasserstoffbrücken auf einem barrierefreien Protonentransfer zwischen funktionellen Seitenketten des Enzyms und dem Substrat und bedingen so- mit eine allgemeine Stabilisierung des Übergangszustandes über Säure-/Base-Kataly- se, wobei sich typische Werte für Φ_T zwischen 0.2 und 0.5 bewegen. Gewinnen jedoch H-Brücken im Vergleich im Übergangszustand an Stärke (Φ_R ≈ 1 → Φ_T < 1), ohne daß ein Protonentransfer erfolgt, so spricht man von sekundären Wasserstoffbrücken, wel- che für Φ_T-Werte zwischen 0.3 und 0.7 verantwortlich sind. Da in keinem der bespro- chenen Fälle die Bindung zum isotopenvariierten Atom gebrochen wird, handelt es sich ausschließlich um sekundäre Isotopeneffekte (vgl. Schowen, 1977: 67-72; Quinn, 2006: 1004-1006).

Was den Fraktionierungsfaktor für Sulfane anbelangt, wurden in den vergangenen Jahrzehnten einige Experimente in dieser Hinsicht unternommen. P. A. Small konnte 1937 die Gleichgewichtskonstante für die Reaktion

H₂S + HDO HDS + H₂O (Gl. II-6)

bestimmen, indem er gasförmigen Schwefelwasserstoff mit einem H₂O-D₂O-Gemisch (4-5 % D) umsetzte und den Deuterierungsgrad des Sulfans indirekt über den Deute- rium-Verlust in der wäßrigen Phase densitometrisch errechnete. Unter Bezugnahme auf K = 3.24 (15 °C) für [HDO]²/[H₂O][D₂O] und K = 4 für [HDS]²/[H₂S][D₂S] ergab sich K für die heterogene Reaktion in II-6 mit 0.42 (Flüssigphase/Gasphase) sowie 0.45 (Gasphase/Gasphase). Die aus Nullpunktsenergien und spektroskopischen Daten er- rechneten Werte lagen zwischen 0.44 und 0.45.

F. W. Hobden et al. studierten 1939 die folgenden Austauschreaktionen

C₅H₁₁OH + HDO C₅H₁₁OD + H₂O (Gl. II-7)

C₂H₅SH + HDO C₂H₅SD + H₂O (Gl. II-8),

indem sie n-Amylalkohol beziehungsweise Ethanthiol bei 25 °C mit einem H₂O-D₂O- Gemisch (ca. 2 % D) für mehrere Stunden äquilibrierten, die lipophile Phase verbrann- ten und den D-Gehalt im Verbrennungswasser densitometrisch analysierten. Der Frak- tionierungsfaktor betrug für n-Amylalkohol 1.09 (l) bzw. 1.00 (g), für das Thiol 0.43 (l) bzw. 0.42 (g).

Aufschlußreich sind auch die Versuche von K. H. Geib 1939, der bei Temperaturen

≤ −79 °C sowohl von CH₃OD (l) und H₂S (l) als auch von CH₃OH (l) und D₂S (l) ausge- hend entsprechende Austauschreaktionen durchführte, wobei der Alkohol am Ende verbrannt und der Deuterium-Gehalt im Verbrennungswasser über dessen Wärmeleit- fähigkeit ermittelt wurde. Nach Äquilibrierung ging der D-Gehalt im Schwefelwasser- stoff rund doppelt so stark wie in der alkoholischen Hydroxy-Gruppe zurück. Bei

−79 °C betrug die Halbwertszeit für die Reaktion

D₂S + 2 CH₃OH H₂S + 2 CH₃OD (Gl. II-9)

0.2-0.5 min, bei einer errechneten Aktivierungsenergie von etwa 30 kJ mol⁻¹ und einer Geschwindigkeitskonstante k von 10⁷-10^7.5 M⁻¹s⁻¹.

Mit Hilfe von NMR- und FT-IR-Spektroskopie bestimmten R. J. Szawelski et al.

(1982) den Fraktionierungsfaktor für Thiole. Die Integration der NMR-Spektren von 2-Thioethanol in H₂O-D₂O-Mischungen, referenziert auf die Methylen-Protonen in α- Stellung zu −SH, war ohne größere Probleme möglich, da die Thio-Gruppe in Abwe- senheit von Puffersalzen hinreichend langsam austauscht und somit zwar breite, aber unverschobene Signale liefert. Φ ließ sich auf diese Weise zu 0.55 errechnen, während FT-IR-Spektren von Ethanthiol in Ethanol einen Fraktionierungsfaktor von 0.62 erga- ben. Die Differenz in den Nullpunktsenergien zwischen protierten und deuterierten De- rivaten beträgt 4.2 kJ mol⁻¹ für Thiole und 5.6 kJ mol⁻¹ für Wasser. Deuterium reichert sich bevorzugt in Systemen niedriger Polarisierbarkeit an, charakterisiert durch steile Potentiale und geringe interatomare Auslenkungen.