tivität aufweist, um CH4 von überschüssigem N2 / O2 basisliniengetrennt zu separieren.
Im Laborfachhandel sind gepackte GC-Trennsäulen bekannt, um Methan neben ubi- quitären Begleitgasen wie H2, N2, O2, CO, CO2 zu analysieren, so beispielsweise die Phasen 100/120 HayeSep D, 100/120 Carbosieve S-II und 60/80 Carboxen-1000.
Auch ließe sich die Stickstoff-Wasserstoff-Atmosphäre in den Enzympräparationen
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00
Molenbruch von D im Medium
Molenbruch im Methan
Molenbruch von D im Methan Molenbruch von H im Methan
Differenz zwischen den Molenbrüchen von D im Medium und im Methan
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00
Molenbruch von D im Medium
Molenbruch im Methan
Molenbruch von D im Methan Molenbruch von H im Methan
Differenz zwischen den Molenbrüchen von D im Medium und im Methan
Abb. II-8. Abreicherung von Deuterium in der Gasphase: a) berechnet für R−OL (Φ = 1.00); b) be- rechnet für R−SL (Φ = 0.42).
a
b
nötigenfalls durch Helium ersetzen. Allerdings existiert bislang keine GC-Technik, um Methan von seinem Monodeutero-Derivat zu trennen, so daß die Problematik hinsicht- lich isobarer Überlappungen zwischen beiden Spezies im EI-MS auf diese Weise nicht gelöst werden kann.
Den entscheidenden Durchbruch ermöglichte schließlich die ebenso einfache wie wirkungsvolle Methode, Methan und seine Isotopologe mit Hilfe einer Stahlkapillare möglichst fein verteilt durch ein mit CDCl3 gefülltes NMR-Röhrchen zu blasen und das im organischen Medium gelöste Gas mittels 1H-NMR zu analysieren. Wie die Abbildun- gen II-9 a und II-11 zeigen, verschieben sich die Signale für Methan mit jedem H/D- Substitutionsschritt um etwa 15 ppb mehr ins Hochfeld und lassen sich somit gut se- pariert integrieren, zumal im Bereich von 0.22-0.18 ppm kaum Störungen durch orga- nische Verunreinigungen zu befürchten sind. Lediglich die äußerst scharfen Signale von Methan mit Linienbreiten nahe der Auflösungsgrenze des NMR-Spektrometers (≈ 0.2 Hz) bereiteten Schwierigkeiten hinsichtlich der Shim-Optimierung. Das Signal- zu-Rauschen-Verhältnis konnte im wesentlichen nur durch Erhöhen der Methankon- zentration im Überstand der Enzymlösung verbessert werden, hingegen kaum durch bloßes Vergrößern des entnommenen Gasvolumens. In diesem Zusammenhang war für reproduzierbare Meßergebnisse auch entscheidend, die NMR-Röhrchen nach Be- gasen möglichst rasch abzudichten, damit sich ein konstantes Gleichgewicht zwischen gelöstem und gasförmigem Methan einstellt. Nach Befüllen evakuierter Injektionsfla- schen mit CH4 beziehungsweise CH3D aus Druckbehältern mußte man über einen kurzfristigen Druckausgleich mit der Umgebung sicherstellen, daß beide Gase in der- selben Molarität vorliegen. Während sich Methan bei 20 °C unter Atmosphärendruck (1.01325 bar) nur wenig in H2O löst (c ≈ 1.6 mM), können in Chloroform unter densel- ben Bedingungen um ein Vielfaches höhere Konzentrationen erreicht werden (c ≈ 21.3 mM), welche gemäß dem Henryschen Gesetz proportional zum Methan-Partial- druck in der Gasphase sind (vgl. Lide, 2006: 8-82; Fischer und Zerbe, 1923: 17 f.).
Zu Eichzwecken erwies es sich als vorteilhaft, die exakte volumetrische Dosierung der Methan-Isotopologe in 60mL-Injektionsflaschen mit Hilfe von gasdichten Glas-Te- flon-Spritzen Modell SampleLock sowie konischen Nadeln mit seitlicher Öffnung vorzu- nehmen, um ein Ausstechen der Tellergummikappen mit nachfolgendem Verstopfen der Nadel zu vermeiden. Für die dünnen PTFE/Gummi-Septen der 2mL-HPLC-Bördel- flaschen waren Injektionskanülen der Abmessung 0.50 mm × 40 mm optimal, für die
massiven Naturgummi-Stopfen der 8mL-Serumflaschen Injektionskanülen mit 0.80 mm × 80 mm. Die hohe Dichtigkeit der PTFE/Gummi-Septen zeigte sich unter an- derem darin, daß sechs Monate nach Versiegeln noch rund 20 % der ursprünglich ge-
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0
Volumenanteil von CH3D, %
Molenbruch(NMR) Molenbruch von CH
3D Lineare Regression
Abb. II-9. a) 1D-1H-NMR-Spektrum einer Mischung von CH3D:CH4 [40:60] v/v (600 MHz, CDCl3);
b) Eichgerade für CH3D-/CH4-Gemische: Korrelation zwischen NMR-Integralen und volumetri- scher Bestimmung (r = 0.999, A = 1.006, B = 0).
a 4H
3H
b
bildeten Methanmenge vorhandenen waren. Außerdem belegten Langzeitversuche über mehrere Tage klar, daß der Diffusionsverlust an Methan durch die Gummistopfen der NMR-Röhrchen keinem Isotopeneffekt unterliegt. Ferner wiesen die Methan-Isoto- pologe im Rahmen der Meßgenauigkeit dieselbe Löslichkeit in CDCl3 auf, so daß die Integrale tatsächlich das H/D-Verhältnis im Überstand der Enzymlösung widerspiegeln (vgl. Bacsik et al., 2002; Salem et al., 1994). Aus Abbildung II-9 b kann die hohe Kor- relation zwischen dem volumetrisch bestimmten Deuteriumanteil in der Gasphase und den berechneten Integralwerten abgelesen werden. Für eine 1:1-Mischung aus CH4 und CH3D (gesamt 0.5 µmol Methan in 450 µL N2-Methan-Gemisch) beispielsweise be- trug die Stichproben-Standardabweichung bei sechs Einzelmessungen nach Integra- tion nur ± 0.6 %.
Ansätze mit aktiver MCR I (c ≈ 500 nM) wurden in gasdichten Gefäßen bereitet und mit Methyl-CoM sowie CoB-Homodisulfid in Gegenwart von Ti(III)citrat und katalyti- schen Mengen an Hydroxocobalamin (siehe Teil II 4.5) umgesetzt. Die letzteren beiden Komponenten stellen reduktiv CoB−SH als eines der beiden Substrate bereit und ent- fernen in derselben Weise CoB−S−S−CoM als eines der beiden Produkte aus dem Reaktionsgleichgewicht. Es erwies sich als vorteilhaft, in vier parallelen Experimenten wäßrige Pufferlösungen mit 19.8 / 26.6 / 46.1 / 60.7 / 80.2 / 96.1 Vol.% D2O anzusetzen und davon in einer Serie die Methanbildungsrate gaschromatographisch zu bestimmen (siehe Abb. II-10 a). Die übrigen drei Reihen blieben für die gesamte Inkubationszeit undurchstochen, und deren Überstand wurde später auf den molaren Anteil von CH3D im Gesamtmethan hin analysiert. Was die Kinetik der Methanbildung anbelangt, so er- wies sich Vmax unter Substratsättigung innerhalb der experimentellen Fehlergrenze (< 15 %) als unabhängig vom Deuteriumgehalt des Mediums. Entsprechende Ansätze mit sättigenden Bedingungen für das erste Substrat MeCoM unter Variation der CoB- Konzentration (zweites Substrat) zwischen 0.1-1 mM zeigten eine Zunahme des appa- renten KM-Wertes für CoB von 63 µM in 100 Vol.% H2O auf 270 µM in 96 Vol.% D2O, wenngleich die Fehlergrenzen der angewandten Bestimmungsmethode erfahrungsge- mäß recht groß ausfallen. Abbildung II-10 b läßt unmittelbar erkennen, daß die gemes- sene Deuterium-Abreicherung in der Gasphase zu einer konkaven Kurve führt, deren Krümmung einem isotopischen Fraktionierungsfaktor von 0.27 entspricht, was markant unterhalb des Φ-Wertes für CoB, CoM und Thiole im allgemeinen liegt (siehe Abschnit- te II 1.4.2, II 2.1). Um den Protium- beziehungsweise Deuteriumgehalt der Enzyman-
sätze zu überprüfen, wurde zu Eichzwecken jeweils 1 mL CDCl3 durch Ausschütteln gegen 200 µL H2O-/D2O-Gemisch (10-90 Mol% D) mit Wasser gesättigt, um anschlie- ßend die 1H-NMR-Integrale für das H2O- sowie für das HDO-Signal getrennt zu bestim- men. Da dies nur bis inklusive 40 Vol.% D2O reproduzierbar möglich war, bereitete man alternativ eine Eichlösung von Acetonitril in DMSO-d6 und analysierte damit den
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
t / min ngesamt(Methan) / nmol
19.8 % D2O (4.4 U/mg) 26.6 % D2O (4.7 U/mg) 46.1 % D2O (4.4 U/mg) 60.7 % D2O (4.4 U/mg) 80.2 % D2O (4.0 U/mg) 96.1 % D2O (3.1 U/mg)
0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 0.800 0.900 1.000
0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00
Molenbruch von D2O Molenbruch vonCH3D
Molenbruch von CH
3D im Experiment Molenbruch von CH3D berechnet für ) = 0.27 Molenbruch von CH
3D berechnet für ) = 1.00
Abb. II-10. a) Methanbildungsrate der MCR I in Abhängigkeit von der D2O-Konzentration im Me- dium und der spezifischen Enzymaktivität; b) Abreicherung von Deuterium in der Gasphase: ge- messen im Experiment und berechnet für verschiedene Werte von Φ.
a
b
H/D-Gehalt in einem definierten Volumen zugegebener Enzymlösung unter Berück- sichtigung der ursprünglichen Spuren an Wasser im Eichmedium.
Unter mechanistischen Gesichtspunkten als besonders interessant ist die Beobach- tung zu werten, daß für D2O-Konzentrationen ≥ 96 Vol.% einerseits 6.7 % Methan-d2 in der Gasphase und andererseits 8.5 % CH2D−CoM im wäßrigen Medium nachweis- bar sind, sofern MeCoM im Überschuß vorliegt (siehe Abb. II-11 und II-12 mit den cha- rakteristischen Multiplizitäten für Kernspin 1). Um diese Resultate in künftigen For- schungsprojekten zur Reversibilität der Methanogenese beziehungsweise zur Methan- aktivierung durch MCR verwerten zu können, war eine Reihe von Kontrollmessungen nötig. Diese ergaben, daß ohne Enzym weder Methan gebildet noch funktionalisiert wird. Das Abstoppen der Methanogenese nach 3 / 6 / 9 / 12 / 15 min zeigte in Abhän- gigkeit von der jeweiligen D2O-Konzentration ein konstantes Verhältnis von CH3D:CH4 über die Reaktionszeit. Auch blieb das Isotopologen-Verhältnis Methan-d0/-d1/-d2 bei Verdopplung der MCR-Konzentration gleich, wohingegen sich die CH2D2-Bildungsrate
105 110
115 120
125 130
135 Hz
31.3 585
100 ³
Abb. II-11. Methanogenese durch MCR I in H2O:D2O [3.9:96.1] v/v: 1D-1H-NMR des im Überstand enthaltenen Gasgemisches mit 10.6 % CH4 (s), 82.7 % CH3D (t), 6.7 % CH2D2 (quint) (600 MHz, CDCl3).
4H
3H
2H 1 : 1 : 1
1 : 2 : 3 : 2 : 1 15 ppb
15 ppb
proportional zur Enzymkonzentration verhielt. Ferner verfügt die MCR nicht über die Fähigkeit, in Abwesenheit von MeCoM zugesetztes CoM bei einem Methan-Partial- druck von 1 bar in der Gasphase zu alkylieren. In diesem Zusammenhang muß beach- tet werden, daß Methan bei einem Partialdruck von 1.01325 bar und einer Temperatur von 333.15 K in reinem H2O beziehungsweise D2O praktisch dieselbe Löslichkeit von 0.95 mM besitzt, entsprechend 1.56 mM bei 293.15 K (vgl. Clever and Young, 1987: 3, 45 f.). Berücksichtigt man noch die Salinität der Enzymlösung (9.7 ‰ w/v), so ergibt sich ein Wert von 0.75 mM (vgl. Duan and Mao, 2006). Da die MCR im Medium eine Konzentration von rund 500 nM beziehungsweise unter Berücksichtigung von zwei ak- tiven Stellen pro Molekül von 1 µM erreicht, wirkt für die beschriebenen Ansätze zur reversen Methanogenese das Substrat Methan keinesfalls als limitierender Faktor, sondern liegt vielmehr in großem Überschuß vor.
ppm 100
6.19
2.14 2.13 2.12 2.11 2.10 2.09 2.08 2.07 2.06 2.05 2.04
Abb. II-12. Methanogenese durch MCR I in H2O:D2O [3.9:96.1] v/v: 1D-1H-NMR der Flüssigphase mit 91.5 % CH3−CoM (s), 8.5 % CH2D−CoM (t) (600 MHz, D2O).
3H
2H