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Katalytische Eigenschaften der MCR

No documento III Weitere Studien zur Wirkungsweise von F430 (páginas 163-169)

Der letzte Schritt der Methanogenese über MCR verläuft exergon und zeigt unter Stan- dardbedingungen (cSubstrate = cProdukte = 1 M; pMethan = 105 Pa) eine Freie Enthalpie ∆G0‘ von −30 kJ pro mol CH4. Im physiologischen Bereich ergibt sich daraus ∆G‘ gemäß

(Gl. II-1).

Somit wird die Rückreaktion exergon, falls der Produkt-Substrat-Quotient einen Wert von ungefähr 105 erreicht, was beispielsweise für einen gegebenen Methan-Partial- druck von 105 Pa, cCoM−S−S−CoB = 10-3 M und cMethyl-CoM = cCoB = 10-4 M der Fall wäre. Über-

∆G' ∆G0' RT [Produkte] Substrate

[ ]

--- ln

+ ∆G0' 5.7 kJ

mol---lg Produkte[ ] Substrate

[ ]

---

= = +

Tab. II-1. Eigenschaften der beiden MCR-Isoenzyme im Vergleich (verändert nach Bonacker et al., 1992: 89-91; Bonacker et al., 1993: 587-592).

MCR I MCR II

Substruktur α2β2γ2

(bis-Heterotrimer)

α2β2γ2 (bis-Heterotrimer) Expression unter standardi-

sierten Wachstumsbedingun- gen

Phase 2 (linear)

Phase 1 (exponentiell)

Degradation unter standardi- sierten Wachstumsbedingun- gen

Phase 3 (stationär)

Phase 3 (stationär)

Gaszufuhr (80 % H2 / 20 % CO2)

limitierend nicht limitierend

Temperaturoptimum 65-70 °C 55-65 °C

pH-Optimum 6.5-7.0 7.5-8.0

KM für Me-CoM 0.6-0.8 mM 1.3-1.5 mM

KM für CoB 0.1-0.3 mM 0.4-0.6 mM

Vmax für aktivste Präparation 6 U mg1 21 U mg1

einstimmend mit diesen durchaus realistischen Annahmen oxidieren methanogene Archaea in der Tat Methan unter strikt anaeroben Bedingungen, wenngleich mit sehr geringen Umsatzraten. Nach neueren Erkenntnissen ist das Reduktionspotential für CoM−S−S−CoB/CoM + CoB nicht in der Gegend des früher verwendeten Wertes von

−200 mV anzusiedeln, sondern eher bei −143 ± 10 mV. Ferner müssen für die Bildung von Methyl-CoM aus Methanol und CoM neben den Bindungs- auch die Solvatations- energien herangezogen werden, so daß −30 ± 10 kJ mol−1 dem tatsächlichen ∆G0‘- Wert für die Methyl-CoM-Reduktion zweifellos näherkommen.

Das Isoenzym I der MCR aus Methanothermobacter marburgensis (siehe Abschnitt II 1.2) zeigt für die Methanbildung aus Methyl-CoM eine maximale spezifische Aktivität von rund 100 U pro mg Protein bei 60 °C und eine Wechselzahl kcat von 500 s−1 unter Annahme von Kooperativität zwischen beiden aktiven Stellen. Vernachlässigt man die Aktivierungsentropie im geschwindigkeitsbestimmenden Schritt, so entsprechen diese Werte einer Aktivierungsenthalpie von etwa 63 kJ mol−1. In der exponentiellen Wach- stumsphase liegt die spezifische Methanbildungsrate für MCR I in der Gegend von 5 U pro mg Protein, wobei 1 mM und 0.1 mM als KM-Werte für Methyl-CoM beziehungswei- se CoB bestimmt wurden. Um die Rate der Methanoxidation abzuschätzen, zieht man die Haldane-Gleichung heran, welche die Gleichgewichtskonstante K mit der kataly- tischen Effizienz (kcat KM−1) für die Hin- und Rückreaktion korreliert:

(Gl. II-2).

Gemäß ∆G0‘ = −RTlnK = −30 kJ mol−1 liegt K in der Größenordnung von 105. Unter der Annahme, daß KM für alle Substrate und Produkte gleichermaßen 0.1 mM beträgt und daß Vmax für die Methanogenese mit 100 U mg−1 zu veranschlagen ist, würde die Methanoxidation maximal mit 1 mU mg−1 erfolgen, wobei der Toleranzbereich für ∆G0‘ von ± 10 kJ mol−1 letztlich Vmax-Werte zwischen 0.01 mU mg−1 und 10 mU mg−1 zuläßt.

Die Reduktion von Methyl-Coenzym M erfolgt in einer hydrophoben Tasche des ak- tiven Enzyms (siehe Kapitel II 1.1), welche von Substraten und Produkten praktisch nur ohne nebenvalent gebundenes Wasser erreicht beziehungsweise verlassen werden kann. Methyl-CoM muß zuerst mit der Sulfonat-Gruppe voran den engen Kanal pas-

∆G0' –RT Kln RT

kcat KM ---

 

 

Hinreaktion

kcat KM ---

 

 

Rueckreaktion

--- – ln

= =

sieren, da dieser nach Bindung von CoB für weitere Moleküle blockiert ist, und zeigt letztendlich mit seiner Methyl-Gruppe oder seinem Thioether-Schwefel zum Ni(I)-Zen- trum. Coenzym B wiederum orientiert sich mit dem Thioheptanoyl-Rest in Richtung von F430 und mit der Phosphat-Gruppe zum Kanaleingang, wobei dessen Sulfanyl-Rest aus einer Entfernung von 8 Å nicht direkt mit dem Ni(I) interagieren kann, wohl aber mit der Methyl-Gruppe oder alternativ mit dem Thioether-S von Methyl-CoM. Höchstwahr- scheinlich startet der katalytische Zyklus der MCR nach Bindung von CoB mit einer ge- schwindigkeitsbestimmenden Konformationsänderung im aktiven Zentrum, welche ihrerseits die Wechselwirkung zwischen Methyl-CoM und Ni(I) begünstigt. So weiß man, daß die Inaktivierung von MCRred1 zu MCRred1-silent durch 2-Bromethansulfonat wie auch das EPR-Signal nach Zugabe des Substratanalogons CoM unmittelbar von der CoB-Konzentration abhängen und daß Experimente zur Steady-State-Kinetik klar für die Existenz eines ternären Komplexes sprechen (siehe Abschnitt II 1.2).

Für den Reaktionszyklus der MCR werden im wesentlichen drei Mechanismen po- stuliert (siehe Abb. II-2), welche allesamt über Thiyl-Radikale laufen, wobei in den Schemen I und III auch anionische Disulfid-Radikale auftreten. Diese Spezies spielen ebenso eine Schlüsselrolle bei der Reduktion von Ribonucleotiden. Die Standard-Re- duktionspotentiale für die Redoxpaare Thiyl-Radikal/Thiol und Disulfid/Disulfid-Radi- kal-Anion relativ zur Normalwasserstoffelektrode betragen +1.3 V beziehungsweise

−1.4 V und liegen damit weiter auseinander als die E0‘-Werte für Ni(III)F430/Ni(II)F430 (≈ +1.3 V) und Ni(II)F430/Ni(I)F430 (−0.6 V).

Mechanismus I, basierend auf früheren Arbeiten zur Reaktivität von Ni(I)F430 mit artifiziellen Substraten, geht primär von einer SN2-Methylierung am Ni(I)-Zentrum durch Methyl-Coenzym M aus. Die folgende 1e-Oxidation von CoM durch Methyl- Ni(III) liefert ein protoniertes CoM-Thiyl-Radikal-Kation und Methyl-Ni(II), welches schließlich mit H+ in einer SE-Reaktion zu CH4 und Ni(II) abreagiert. Das entstandene CoM-Thiyl-Radikal im aktiven Zentrum bewegt sich in Richtung des CoB-Thiolates und bildet mit diesem − in enger Analogie zur Ribonucleotid-Reductase − ein radikalisches Disulfid-Anion, welches Ni(II) zur aktiven Ausgangsstufe Ni(I) reduziert und selbst zum CoM-CoB-Heterodisulfid oxidiert wird. Dabei könnte der Elektronentransport zu Ni(II) über das Thioglycin Glyα445 erfolgen, dessen Thion-Schwefel über Wasserstoffbrücken zum Amid-Stickstoff von Asnα481 wiederum mit dem Thiol-Schwefel von CoB interagiert.

Als Intermediat wäre ein Thioketyl-Radikal denkbar, welches aus einem Thioamid und

Ni(I) CH3

S SO

3

Ni(III) CH3

HS SO

3

Ni(II) CH3

S SO

3

R SH

R S

R S

Ni(II)

S SO

3

R S

+ CH4 Ni(I)

S SO

3

R S Coenzym B

Me-CoM

Heterodisulfid

SN2 1e-Transfer

S SO

3

R S H I

1e-Transfer

H+

Ni(II)

S SO3

R S S

SO3

Ni(II)

CH3 R

SH

Ni(I) Me-CoM H3C

S SO

3

Ni(I) R

SH Coenzym B

H-Transfer

1e-Transfer

S

SO3

Ni(II) +CH4

R S

S SO3

R S SRN

S SO

3

R S

Ni(II) CH3

Ni(II)

S SO

3

R S

+CH4

S SO

3

Ni(I) CH3

R

S

Ni(I) Me-CoM CH3

S SO

3

Ni(I) R

S Coenzym B

1e-Transfer

Heterodisulfid

X R

SH I

X XH

XH

Abb. II-2. Postulierte Mechanismen I-III für den Reaktionszyklus des Enzyms MCR.

I

II

III

dem besagten Disulfid-Radikal-Anion entsteht. Was das Protoneninventar anbetrifft, so startet die initiale Methylierung von Ni(I) mit einer vorausgehenden − oder wahr- scheinlicher − konzertierten Protonierung von Methyl-CoM über Tyrα‘333 oder Tyrβ367 zur entsprechenden Sulfonium-Spezies, wobei die Sulfanyl-Gruppe von CoB als eigentli- cher H+-Donator fungiert. Entsprechende Analogien findet man in den Kristallstruktu- ren von o-Hydroxyphenyl- oder o-Hydroxybenzyl-Thioethern (5- und 6-gliedrige Ringe) sowie von (Benzothio)pyran- und Thianthren-Derivaten. Das CoB-Proton in Form des CoM-Thiyl-Radikal-Kations, dessen Acidität deutlich höher liegt als diejenige von CoM oder CoB, dient schließlich zur Protolyse von Methyl-Ni(II), welche als irreversibler Schritt alle vorausgehenden wie nachfolgenden Reaktionen antreibt. Mechanismus I wird unterstützt durch die experimentellen Befunde, daß MCRred1 mit 3-Brompropansul- fonat zu MCRBPS mit Alkyl-Ni(III) ↔ Alkylradikal-Ni(II)-Struktur reagiert und daß Ni(I)F430Me5 in aprotischen Lösungsmitteln mit Iodmethan zu Methyl-Ni(II) umgesetzt werden kann, welches seinerseits leicht zu Methan und Ni(II)F430Me5 protolysiert.

Daß die Umsetzung von Ethyl-Coenzym M zu Ethan mit weniger als 1 % der katalyti- schen Aktivität der Methanogenese erfolgt, spricht ferner für einen SN2-Mechanismus im ersten Schritt. Die Stabilisierung des MCRred1-EPR-Signals durch Methyl-CoM in Abwesenheit von CoB kann dahingehend interpretiert werden, daß die elektrophile Methylierung von Ni(I)F430 obligatorisch eine Protonierung von Methyl-CoM zum Sul- fonium-Derivat voraussetzt. Allerdings besitzen Dialkylsulfonium-Verbindungen einen pKa-Wert von ca. −5.5 und benötigen für eine Halbionisierung mindestens 68 %ige Schwefelsäure (vgl. Arnett, 1963: 324), so daß es sehr fraglich erscheint, ob in biolo- gischen Systemen derartige Säurestärken größenordnungsmäßig überhaupt erreicht werden können. Außerdem sind sowohl die UV/VIS- als auch die EPR-Spektren für ak- tives Enzym und freies, vierfach koordiniertes Ni(III)F430Me5 deutlich verschieden, was nicht zuletzt durch die unterschiedlichen Koordinationssphären bedingt ist.

Im Gegensatz hierzu beginnt Mechanismus II, entworfen vor Kenntnis der Kristall- struktur von MCRsilent, mit der Aktivierung des Thioethers Methyl-CoM durch das CoB- Thiyl-Radikal zum entsprechenden Sulfuranyl-Radikal. Letzteres reagiert mit der eben- falls radikalischen Spezies Ni(I)F430 (17 Valenzelektronen) über SR zum CoM-CoB- Heterodisulfid und Methyl-Ni(II), welches analog zu Mechanismus I unter Protolyse Methan freisetzt. Der Katalysezyklus benötigt in diesem Fall eine weitere redoxaktive Gruppe X, welche die initiale Einelektronenoxidation von CoB−SH zum Thiyl-Radikal

bewerkstelligt. Während Ni(II)F430 als möglicher Elektronenakzeptor ausscheidet, da nur die Ni(I)-Form aktiv Substrate umsetzt, käme die bislang ausschließlich in MCR ge- fundene Aminosäure Thioglycin (Glyα445) in Frage. Als protoniertes Thioketyl-Radikal würde diese das vierte H-Atom im freigesetzten Methan liefern und danach als Radikal- Anion Ni(I) regenerieren. Auf intermediäre Methyl-Ni(III)-Spezies kann hierbei verzich- tet werden, und die Existenz mehrerer methylierter Aminosäuren (Arg, Cys, Gln, His) in der α-Untereinheit der Methanothermobacter-MCR weist möglicherweise auf die Entstehung von Methyl-Radikalen im Katalysezyklus hin (siehe Kapitel II 1.1).

Auf Grund von DFT-Berechnungen kamen Pelmenschikov et al. (2002/2003) zur Überzeugung, daß Mechanismus I thermodynamisch nicht plausibel ist. Stattdessen formulierten sie Mechanismus III, wonach das Ni(I)-Zentrum nicht am Methyl-Kohlen- stoff, sondern in einer SRN-Reaktion am Thioether-S des Methyl-Coenzym M angreift.

In Folge treten dann anstatt eines Methyl-Nickel-Derivates Ni(II)-Thiolat neben einem Methyl-Radikal als Zwischenprodukte auf. Die weiteren Schritte verlaufen gemäß Schema II-2 über H-Abstraktion von CoB−SH mit Freisetzung von CH4, Bildung des CoM-CoB-Disulfid-Radikal-Anions und Reduktion von Ni(II) analog zu Mechanismus I.

In ihrer ersten Veröffentlichung 2002 gehen die Autoren von einem Methyl-Radikal als kurzlebiges reales Zwischenprodukt aus, welches H in einem zweiten rascheren Schritt von CoB−SH abstrahiert. Die nachfolgende Publikation im Jahre 2003 be- schreibt hingegen die CH3-Freisetzung aus Methyl-CoM mit der H-Abstraktion durch naszierendes CH3 in einer konzertierten, geschwindigkeitsbestimmenden Aktion mit einer vorausgesagten Aktivierungsenergie von rund 80 kJ mol−1. Für den hier postulier- ten Reaktionszyklus spricht klar die Beobachtung, daß Coenzym M mit seinem Thiol- Schwefel in aktiver MCR bei Anwesenheit von Coenzym B reversibel an Ni(I)F430 ko- ordiniert. Gegen Mechanismus III läßt sich die Beobachtung anführen, daß MCR das Substratanaloge Ethyl-Coenzym M nur mit sehr geringer Effizienz zu Ethan reduziert und Allyl-Coenzym M überhaupt nicht metabolisiert, obgleich Letzteres als kompetiti- ver Inhibitor vom Enzym gebunden wird (Ki = 0.1 mM) und obgleich das Ethyl- als auch insbesondere das Allyl-Radikal gegenüber CH3 thermodynamisch wesentlich bevor- zugt sind.

In hinblick auf die anaerobe Oxidation von Methan durch MCR werfen alle drei dis- kutierten Mechanismen Probleme auf. Reaktionszyklen I und II würden mit der Inser- tion von Ni(II)F430 in eine C−H-Bindung des Methans unter simultaner Freisetzung ei-

nes Protons starten, was aufgrund der geringen Elektrophilie von Ni(II) (E0‘ ≈ −0.6 V) in Verbindung mit der minimalen Acidität von CH4 (pKa > 48) a priori ausscheidet. Auch die Methanaktivierung gemäß Mechanismus III bringt einige Schwierigkeiten mit sich, da die Umsetzung eines Thiyl-Radikals mit Methan zu einem Methyl-Radikal und Thiol aufgrund der Bindungsdissoziationsenergien für C−H von 439 kJ mol−1 und für S−H von 365 kJ mol−1 thermodynamisch ungünstig liegt. Denkbar wäre aber eine Modifikation von Mechanismus I, worin aus Methyl-CoM und Ni(I)F430 wiederum Methyl-Ni(III) ent- steht, welches ohne vorherige Reduktion direkt zu CH4 und Ni(III)F430 protolysiert wird. Diese Spezies kann man als „Superelektrophil“ (E0‘ > 1 V) auffassen, welches CH4 in End-On- oder Side-On-Orientierung metalliert, wie dies auch für die C−H-Akti- vierung über hochvalente Metallkomplexe beschrieben wird.

Die experimentell aufgefundene Halbseiten-Reaktivität der MCR (siehe Kapitel III 1.1) legt einen „Zweitakter“-Mechanismus des Enzyms nahe, das heißt endergone Katalyseschritte in dem einen Zentrum wären simultan mit exergonen Reaktionen in der gegenüberliegenden aktiven Stelle gekoppelt. So weisen MCRred1/silent-Präparatio- nen in der Tat stark verringerte Methanbildungsraten auf (vgl. Jaun and Thauer, 2007:

345-349; Thauer, 1998: 2394 f.; Thauer and Shima, 2008: 164 f.).

No documento III Weitere Studien zur Wirkungsweise von F430 (páginas 163-169)