Bestimmung des Fraktionierungsfaktors für Thiole

Da die Messung von Φ für −SL schon einige Jahrzehnte zurückliegt (siehe Abschnitt II 1.4.2), waren eigene Versuche notwendig, um den tabellierten Wert von 0.40-0.46 experimentell zu überprüfen. Das durch Aminosäure-Rest sowie Phosphat-Gruppe ge- kennzeichnete polyionische Coenzym B würde mit seiner Vielzahl von Ladungen die Zuordnung von m/z-Signalen im HiResESI-ICR-MS sehr erschweren. Somit griff man auf die Natriumsalze von 2-Thioethansulfonsäure (TES; Coenzym M) und 2-Hydro- xyethansulfonsäure (HES) zurück, welche in Mischungen aus H₂O / D₂O + CH₃OH / CD₃OD + NH₃•H₂O / ND₃•D₂O gelöst wurden. Das molare Verhältnis von 1:3 beruht auf der Beobachtung, daß TES im negativen Modus etwa dreimal stärkere Signalintensi- täten liefert als eine identische Menge an HES. Die isotopenvariierten Lösungsmittel wurden auf einen Endgehalt von 25 / 50 / 75 Mol% D eingestellt, ebenso der Deuterie- rungsgrad der Hydroxy- beziehungsweise Sulfanyl-Funktion der Ethansulfonsäure-De- rivate. Da die Integrale der MS-Signale das Verhältnis von TES-d1 zu TES-d0 nicht notwendigerweise absolut widerspiegeln, benötigt man den HES-d0/HES-d1-Quotien- ten als interne Referenz. Aufgrund der Beziehung

(Gl. II-19)

kann mit Φ_OL = 1.00 der gesuchte Wert für Φ_SL direkt aus den Signalintensitäten der HES- und TES-Isotopologe berechnet werden (siehe Abb. II-4). Auf der Basis von sechs Meßergebnissen für 50 Mol% D und jeweils drei Werten für 25 / 75 Mol% D ergab sich für Φ_SL ein Durchschnittswert von 0.35, allerdings mit einer Standardabwei- chung von ±16.5 % (n = 12).

Infolgedessen fokussierte man sich auf NMR-spektroskopische Methoden, welche allesamt die molekulare Integrität der Testsubstanz nicht verändern. Lösungen des in

Φ_OL

HES OH–

( )

∫

HES OD–

( )

∫

--- Φ_SL

TES SH–

( )

∫

TES SD–

( )

∫

---

aciden Positionen entsprechend un-, teil- oder volldeuterierten Diammoniumsalzes von CoB−SH in TRIS-HCl/H₂O (50 mM; pH 7.6), TRIS-DCl/D₂O (50 mM; pD 7.6) und Mischungen aus beiden Solventien (40 / 60 / 75 Mol% D) wurden in einem NMR-Röhr- chen mit Kapillareinsatz und Dioxan als Eichsubstanz bei 500 MHz und 65 °C gemessen. Das ¹³C-Spektrum zeigte für das C-Atom in α-Position zur −SH-Gruppe (²J- Kopplung) in 100 Mol% D relativ zu 100 Mol% H eine Hochfeld-Verschiebung von rund 0.2 ppm. Im ¹H-Spektrum aller Deuterium-haltigen Ansätze erschien die Sulfanyl-Grup- pe als breite Linie mit Schulter, deren grobe Integration unter Normierung auf das tri- plettoide Signal (2H) für H₂C(7‘) einen durchschnittlichen Φ_SL-Wert von 0.51 (n = 3) errechnen ließ. Die H/D-Verschiebung dieser α-Methylen-Protonen (³J-Kopplung) selbst lag nur noch im sub-ppb-Bereich.

Wesentlich exaktere Ergebnisse lieferten vier Ansätze mit jeweils 10 mg feinkristal- linem CoB-Diammoniumsalz (siehe Abb. II-5), aufgereinigt durch Umfällen anstelle von Entsalzen, gelöst in je 700 µL entgastem Wasser mit 0 / 25 / 75 / 100 Vol.% D₂O unter Zusatz von 0.7 µL 1,4-Dioxan und überführt in NMR-Röhrchen mit gasdichtem Schraubdeckel. Die Messungen erfolgten bei einer Frequenz von 600 MHz (¹H) beziehungsweise 150 MHz (¹³C) und bei einer Temperatur von 4.1 / 25 / 50 °C mit Kryokopf,

HES-d0

HES-d1

SES-d0

SES-d1

Abb. II-4. HiResESI-ICR-MS (negativer Modus): Relative Signalintensitäten der d0/d1-Isotopologe von 2-Hydroxyethansulfonsäure (HES) und 2-Sulfanylethansulfonsäure (SES) in H₂O:D₂O [50:50]

v/v.

wobei die Lyonium-Konzentration im Bereich von pL 4.38-4.91 lag. Die Zuordnung sämtlicher ¹H- und ¹³C-Signale, referenziert auf internes 1,4-Dioxan, wurde anhand eines DQF-COSY- sowie eines MedHSQC-Spektrums in reinem D₂O bei 4.1 °C bestä- tigt. Die Bestimmung von Φ_SL (CoB) erfolgte auf zwei voneinander unabhängige Weisen, und zwar zum einen durch Integration der Deuterium-verschobenen ¹³C-Si- gnale von C(7‘), zum anderen durch direktes Integrieren des ¹H-Signals der Sulfanyl- Gruppe.

Beim Vergleich der ¹³C-Spektren für steigende D₂O-Konzentrationen fallen zwei Ar- ten von isotopenverschobenen Signalen ins Auge. Die C-Atome in Nachbarschaft des Amid-Protons zeigen einen Fraktionierungsfaktor von ca. 1, was in 75 % D₂O zu einem Intensitätsverhältnis „Unverschoben:Verschoben“ von 1:3 führt. Die entsprechende Relation für C(7‘) mit der SH-Gruppe sowie für das benachbarte C(6‘) lautet 5:6, wor- aus Φ_SL (CoB) berechnet werden kann, sofern man die Effekte von Relaxation und heteronuclearem NOE auf die ¹³C-Integrale eliminiert (siehe Tab. II-2). Um solche Stö- rungen auszuschließen, wurden die ¹³C-Spektren zuerst unter Standard-Breitband- entkopplung und dann mit der Inverse-Gated-Technik (Verzögerung: 5 s) gemessen.

Beide Spektren lieferten dasselbe Integralverhältnis für unverschobene zu verschobenen Signalen. Abbildung II-6 a verdeutlicht unmittelbar, daß neben der hauptsächli- chen β-Isotopenverschiebung das −CH₂SH- sowie das −CH₂SD-Signal parallel mit steigendem D-Anteil hochfeldverschoben werden. Aufgrund seiner näherungsweisen Proportionalität zum D-Gehalt des Lösungsmittels liegt nahe, daß dieser Effekt auf funktionellen Gruppen mit Φ ≈ 1 beruht und in direktem Zusammenhang mit Änderun-

SH H

+NH₄O O

+NH₄HO₃PO

3 1 2

2' 1'

4' 6'

Abb. II-5. Struktur des Diammoniumsalzes von N-7-Thioheptanoyl-O-phosphono-L-threonin (Co- enzym B).

gen in Wasserstoffbrückenbindungen / Solvatationshülle des Moleküls steht. Nahe der Mitte der Heptanoyl-Kette zeigen die Signale für C(4‘) und C(5‘) bezogen auf 1,4- Dioxan nur minimale Verschiebungen, so daß diese als interne Referenz für den Spek- trenvergleich dienen können. Aus den Integralen für −CH₂SH sowie −CH₂SD bei 50 / 75 Mol% D und 4.1 / 25 / 50 °C ließ sich Φ_SL (CoB) zu 0.44 ± 4.1 % (n = 6) berechnen.

Dabei traten bereits bei 25 °C durch H/DAustausch zwischen −SL und Lösungsmittel deutliche Linienverbreiterungen auf, infolgedessen die Signalintensitäten über Least Square Fitting der theoretisch simulierten Kurve eines Zwei-Spin-Austausches zwi-

Tab. II-2. ¹H- und ¹³C-NMR-Daten von Coenzym B in 100 % H₂O bei 4.1 °C; Deuterium-abhängige Hochfeld-Verschiebungen der ¹³C-Signale in H₂O:D₂O [25:75] bei 4.1 °C (600 / 150 MHz; δ in ppm,

∆δ in ppb, J in Hz).

Atom δ (¹H) δ (¹³C)

∆δ (¹³C);

Intensitätsrelation unverschoben:

verschoben

1 − 178.8 16; 1:3

2 4.27 (dt) 62.3

(J_C,P = 7.8)

91; 1:3

3 4.71 (qdd) 75.4

(J_C,P = 5.4)

9; 1:3

4 1.30 (d) 21.2 0

NH 8.17

(J = 8.9)

− −

1' − 180.2 91; 1:3

2' 2.39 (m); 2.35 (m) 38.8 53; 1:3

3' 1.63 (m) 28.1 9; 1:3

4' 1.34 (m) 30.5 0

5' 1.40 (quint) 29.9 0

6' 1.60 (m) 35.7 25; 5:6

7' 2.54 („q“)

(J = 7.7)

26.6 143; 5:6

SH 1.83

(J = 8.2)

− −

NH₄⁺ 7.16 (t) − −

26.45 ppm 26.50

26.55 26.60

26.65

100 % H

100 % D

50 % D

75 % D

2SH CH

2SD

2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 ppm

50 °C

25 °C

4.1 °C

CH₂SH CH

2SH

Abb. II-6. Bestimmung von Φ_SL für Coenzym B: a) ¹³C-NMR-Spektren von C(7') bei 4.1 °C und 0 / 50 / 75 / 100 Mol% D im Lösungsmittel, referenziert auf C(5'); b) ¹H-NMR-Signale von H₂C(7') und

−SH bei 4.1 / 25 / 50 °C und 100 Mol% H im Medium.

∆δ = 143 ppb a

schen unverschobenen und verschobenen Linien im gemessenen Spektrum bestimmt wurden, mit dem Populationsverhältnis als einem der Optimierungsparameter. Im Hin- blick auf die Konsistenz der berechneten Φ-Werte fand diese Technik auch Anwen- dung bei 4.1 °C sowie 50 °C, wobei sich das C(7‘)-Signal bei der letztgenannten Temperatur nahe dem Koaleszenzbereich befand. Anhand dieses Optimierungsproze- dere für die theoretische Zwei-Spin-Austausch-Linienform konnten auch die Aus- tauschgeschwindigkeiten nebst weiteren thermodynamischen Parametern abgeleitet werden. Für die durchschnittliche Lebensdauer τ eines Kerns in der magnetischen Um- gebung A / B und die Geschwindigkeitskonstante k gilt:

mit (Gl. II-20).

Auf dieser Grundlage ergaben sich für k folgende Werte: 2.3 s⁻¹ (4.1 °C), 14.1 s⁻¹ (25.0 °C), 66.5 s⁻¹ (50.0 °C). Dies entspricht 52.3 kJ mol⁻¹ für ∆H^# und −46.1 J mol⁻¹ K⁻¹ für ∆S^#.

Abbildung II-6 b zeigt in 100 Vol.% H₂O für eine Temperatur von 4.1 °C das SH-Pro- ton als Triplett bei 1.81 ppm mit deutlich reduzierter Intensität (0.6 H). Dies beruht auf SH-OH-Austauschreaktionen während der relativ langen Excitation-Sculpting-Pulsse- quenz, wodurch nicht-angeregte Protonen des Wassers in den Resonanzbereich der Thiol-Protonen gelangen. Bei 4.1 °C erscheint H₂C(7‘) als quartettoides Signal mit etwa identischen Kopplungskonstanten zu −SH (8.3 Hz) und zur vicinalen Methylen-Gruppe H₂C(6‘). Bei 25 °C wird das SH-Triplett nur noch teilweise aufgelöst und das H₂C(7‘)- Quartettoid befindet sich hinsichtlich der −SH-Kopplung nahe dem Koaleszenzbereich.

Bei 50 °C verschwindet das SH-Signal großenteils infolge von Austausch-bedingter Li- nienverbreiterung und H₂C(7‘) bildet ein scharfes Triplett. Aus diesen Betrachtungen kann wiederum die Austauschgeschwindigkeit abgeschätzt werden, da für den Koales- zenzbereich bei 25 °C mit ∆ν = 8.3 Hz der Zusammenhang k = 2.22 • ∆ν ≈ 18.4 s⁻¹ gilt, was recht gut zu den 14.1 s⁻¹ aus den ¹³C-Daten paßt. Mit steigender D₂O-Konzentra- tion verringert sich das SH-Integral, und da die zugrundeliegenden Spektren ohne Un- terdrückung des Lösungsmittel-Signals aufgenommen wurden, ergab sich bezug- nehmend auf ∫ H₂C(7‘) = 2H der Fraktionierungsfaktor Φ_SL (CoB) zu 0.42 ± 1.2 % (n =2).

τ_A⋅τ_B τ_A+τ_B ---

= k 1

---τ

Obwohl in Analogie zu den ¹³C-Spektren die Integration des SH-Protons bei Tempera- turerhöhung durch zunehmende Linienverbreiterung ungenauer wird, erkennt man klar die Tendenz zu einer Vergrößerung des Fraktionierungsfaktors, und zwar um ca. 7 % bei 50 °C relativ zu Φ_SL bei 4.1 °C.

Gleichermaßen erfolgreich war ein analoger Ansatz mit dem CoM-Natriumsalz in H₂O, H₂O:D₂O [50:50] und H₂O:D₂O [20:80] bei 500 MHz und 5.4 °C unter interner Re- ferenzierung auf das ¹H-NMR-Integral von H₂C(2). Abbildung II-7 zeigt deutlich, wie die Schärfe des SH-Signals mit steigendem D₂O-Gehalt wächst. Für Φ_SL berechnete sich wiederum ein Durchschnittswert von 0.43 ± 3.9 % (n = 2), und zwar unabhängig vom Zeitpunkt nach Herstellung der Lösungen (10 min / 6 d). Während die Integrale für die Methylen-Protonen in Position 1 und 2 bis in den Promille-Bereich identisch waren, be- trug das Integralverhältnis für H₂C(2)/SH in reinem Protiumoxid etwa 2.093 anstelle des erwarteten Wertes von 2.000.

S O

O O Na+ 1

2 Abb. II-7. 1D-1 H-NMR von Natrium-2-sulfanylethansulfonat (c) in H2O (a), H2O:D2O [50:50] v/v (b), H2O:D2O [20:80] v/v (d) (500 MHz, H2O/D2O).

a b c

Dioxan H2C1 H2C2 HS− Dioxan H2C1 H2C2 HS−

Dioxan H2C1 H2C2 HS−

No documento III Weitere Studien zur Wirkungsweise von F430 (páginas 184-192)