NMR - Spektroskopische und spektrometrische Charakterisierung

2.4 Spektroskopische und spektrometrische Charakterisierung

2.4.4 NMR

Vierfach koordiniertes Ni(II)F430 mit quadratisch-planarem Ligandenfeld eignet sich als diamagnetische Spezies der Elektronenkonfiguration [Ar]3d⁸ (Low-Spin) für hoch- auflösende NMR-Methoden. Allerdings tendiert das Ni(II)-Zentrum sehr dazu, zusätz- liche axiale Liganden zu paramagnetischen fünf- oder sechsfach-koordinierten High- Spin-Komplexen anzulagern, welche aufgrund des raschen Ligandenaustausches bereits in sehr geringen Konzentrationen paramagnetische Verschiebungen und starke Linienverbreiterung im NMR induzieren. Die resultierenden kurzen T₂-Relaxationszei- ten machen es zudem unmöglich, 2D-Spektren wie HMBC aufzuzeichnen, welche auf dem Kohärenztransfer über kleine skalare Kopplungen beruhen. Bislang stellt 2,2,2- Trifluorethanol-d3 das einzig bekannte Lösungsmittel dar, welches ausreichende Po- larität mit geringer Nucleophilie verknüpft, um F430-Pentacarbonsäuren aus Methano- genen zu solubilisieren, ohne gleichzeitig einen Übergang Low-Spin → High-Spin des Ni(II) zu verursachen. Selbst nach mehrfacher Aufreinigung und Trocknung des verwendeten 2,2,2-TFE-d3 zeigen die NMR-Spektren für F430 eine deutliche Linienver-

MolaresVerhältnis Ni/S anhand von LA-ICP-MS-Auswertungen (Einzelbahn-Scans)

MolaresVerhältnis Ni/S anhand von HPLC-Integralen

Molekulargewicht der Einzelkomponenten

Probe A-C975.365 D-G1021.353 (entsprechend RohisolatNr. 2) 1905.287 2951.275 3-5905.287 6,7951.275 F1021.353

1.76 2.41 1.00

1.87 ±10 % (n = 7) 2.32 ±6 % (n = 14) 0.99 ±9 % (n = 4)

RohisolatNr. 2 - Pentamethylester RohisolatNr. 3 - Pentacarbonsäuren Komponente F aus RohisolatNr. 2 - Pentamethylester

E 1

CBA G

F D 764/53

Tab. I-5. Bestimmung des molaren Ni/S-Quotienten in der F430-Variante von Protein I.

breiterung verglichen mit den Signalen von F430-Pentamethylester in CD₂Cl₂ oder CD₂Cl₂:TFE-d3 [4:1]. Anfängliche Versuche mit Rohisolat Nr. 1 in 2,2,2-TFE-d3 zeigten nur breite Linien für F430 und dessen Variante, welche offensichtlich dieselbe Affinität zu nucleophilen Liganden in axialer Position aufweist. In Analogie zur erfolgreichen Strukturaufklärung an F430 aus methanogenen Archaea wurden die Rohisolate zuerst erschöpfend methyliert und anschließend sowohl die chromatographische Aufreini- gung als auch die NMR-Analyse schwerpunktmäßig auf der Basis der Pentamethyl- ester durchgeführt. Während F430Me₅ für Konzentrationen > 5 mM in CD₂Cl₂ hochauf- gelöste Spektren ergab, mußten die geringen Mengen der F430-Variante (< 1 µmol) in CD₂Cl₂:TFE-d3 [4:1] gemessen werden, um die Linienverbreiterung infolge verringerter Meßtemperatur sowie durch unvermeidbare Spuren an koordinierenden Nucleophilen zu unterdrücken. Von deren Verdrängung durch lipophile Verbindungen wie Hexade- cyltrimethylammoniumperchlorat nahm man Abstand, da die Signale der Alkyl-Substi- tuenten die Strukturaufklärung der F430-Variante behindern würden.

Obwohl die 80 nmol Reinsubstanz F aus Rohisolat Nr. 2 bereits ausreichten, um die Konstitution der F430-Variante zu erschließen, erfolgten die wesentlichen Schritte der Strukturaufklärung an Rohisolat Nr. 4 (siehe Abb. I-18). Konkret ließ das HPLC-Chro- matogramm nach Veresterung mindestens sechs Einzelsubstanzen erkennen (siehe Abb. I-19 b), wobei jeweils 500-600 nmol der beiden Hauptkomponenten D / F (m/z 1021) in CD₂Cl₂:TFE-d3 [4:1] gelöst mit Hilfe von Shigemi-Röhrchen analysiert wurden.

Die Identität der nur in geringen Mengen verfügbaren MeS-Nebenkomponenten E / G konnte man aus UV/VIS-Spektren, MALDI-TOF-Aufnahmen sowie NMR-Analysen der entscheidenden Molekülteile entnehmen. Die Komponenten A-C mit je m/z 975 wiederum wurden anhand von Koinjektionen mit F430Me₅ und dessen jeweiligen Epimeren zugeordnet.

Das 1D-¹H-NMR-Spektrum der methylierten Komponente D zeigte fünf CH₃O-Grup- pen in Übereinstimmung mit m/z 1021 und als Bestätigung, daß es sich bei der F430- Variante (m/z 951) ebenso wie bei F430 aus methanogenen Archaea (m/z 905) um eine Pentacarbonsäure handelt (siehe Abb. I-26 a). Ein Singulett bei 2.16 ppm (ca. 3H, teilweise überlappend mit anderen Signalen) mit der entsprechenden ¹³C-Linie (CH₃ gemäß MEd-HSQC) bei 12.9 ppm sprach für die Anwesenheit einer CH₃S-Funktion und bestätigte die Ergebnisse aus HiResMALDI-ICR-MS und LA-ICP-SF-MS (siehe Kapitel I 2.4.2; I 2.4.3). Die Methylsulfanyl-Protonen weisen im HMBC eine Kopplung

01234567ppm Abb. I-26. 1D-1H-NMR-Spektren: a) Komponente D aus Rohisolat Nr. 4 - Pentamethylester (m/z 1021) (600 MHz, CD2Cl2:TFE-d3 [80:20] v/v); b) entsprechende Pentacarbonsäure aus Rohisolat Nr. 3 (m/z 951) (600 MHz, TFE-d3).

a b

CHDCl2 CF3CHDOD H10 H4

{

5× CH3O– IMP

IMP IMP

CH3-2CH3-7

CH3S– H2-171 H5ReH5Si

H12H2-20 H17H19

CF3CD2OH

über drei Bindungen hinweg zu einem Methin-Kohlenstoff bei 51.0 ppm auf, der wiederum im HSQC über eine Bindung mit einem Proton bei 3.56 ppm korreliert. Zur Lo- kalisierung dieser Methin-Gruppe als Träger des MeS-Substituenten innerhalb des Hydrocorphin-Netzwerkes war es erforderlich, sämtliche ¹H- und ¹³C-Signale mittels DQF-COSY, TOCSY, Multiplicity-Edited HSQC und HMBC zu analysieren. Ausgehend von H4 und dem Spin-System H₂20-H19 mit ihren charakteristischen chemischen Ver- schiebungen gelang es, alle nicht-austauschbaren Protonen und alle Protonen-tragenden Kohlenstoffe in den Ringen A, B und C inklusive der Seitenketten zuzuweisen (siehe Tab. I-6 und I-7). Ein Vergleich der chemischen Verschiebungen und 2D-Korre- lationen von Komponente F (siehe Tab. I-8) mit den vollständig zugeordneten Spektren für F430Me₅ ergab klar, daß diese Regionen des hydrocorphinoiden Liganden in der F430-Variante un- verändert vorliegen, wie die blau eingefärbten Molekülbestandteile in Abbildung I-27 illustrieren. Die Position des CH₃S-Substituenten ließ sich wie folgt bestimmen (siehe Abb. I-28): H18 und H17 wurden aus Kreuzpeaks im DQF-COSY zugeordnet, wobei H17 (2.86 ppm) wiederum mit zwei geminalen Pro- tonen bei 2.48 / 1.92 ppm koppelt, und zwar mit H17¹‘ beziehungsweise H17¹‘‘. Betrachtet man das Proton bei 3.56 ppm in ³J_C,H-Kopplung zum MeS-Kohlen- stoff, so zeigt dieses mit H17¹‘‘ eine große und mit H17¹‘ eine kleine Kopplungs- konstante. Somit befindet sich der MeS-Rest in Position 17², und das Signal bei 3.56 ppm gehört zu H17². Eine Reihe von HMBC-Korrelationen bestätigte diese Par- tialstruktur im Cyclohexenon-Ring (siehe Abb. I-28 c und Tab. I-8), wonach beide H17¹- Protonen einerseits deutliche Konnektivität zu C18 zeigen und andererseits zusammen mit H17² in Korrelation zum Carbonylkohlenstoff C17³ stehen, welcher durch seinen charakteristischen Verschiebungswert von 192.4 ppm gekennzeichnet ist.

O Ni H HN

CH₃

H H₃C

OCH₃

CH₃O O N

H₂N O

CH₃O

O CH₃O

OCH₃

O H

H H

HH HH

H H

H H H

H H

A B

ClO₄

13 3

17²

20 10 5

Abb. I-27. 1D- und 2D-NMR-Studien am Pentamethyl- ester der F430-Variante (m/z 1021).

3.02.82.62.42.22.0

3.6

3.4

3.2

3.0

2.8

2.6

1 į H [ppm]

H8-H81’H8-H81’’

H21’’-H21’ H19-H18H19-H20

H17-H18H17-H171’’

H171’-H171’’ H121-H12 H172-H171’’

H21’-H21’’H82’-H82’’ H172-H171’

H17-H171’ į1H [ppm] į1H [ppm]

į1H [ppm]

10 C5-H5’C5-H5’’ C3-H3 C13-H13

CH3SC172-CH3SC172 CH3C7-CH3C7 CH3C2-CH3C2 mC31-H31’’C31-H31’ C131-H131’’C131-H131’

C81-H81’C81-H81’’ C32-H232 C82-H82’C82-H82’’

C132-H132’ C132-H132’’ C71-H71’ C71-H71’’

C21-H21’C21-H21’’

C20-H220 C18-H18 C17-H17

C12-H12

C171-H171’’C171-H171’ C121-H2121 C172-H172

C181-H2181

3 1

] m p p[ C

4.03.53.02.52.01.51.0 555045403530 C172-CH3S

C171-H172 C18-H220 C172-H171’’C172-H171’

C18-H2181 C17-H171’’

C18-H171’’ C17-H2181 194192190188 C173-H172

C1-H220 C173-H171’C173-H171’’

m 4.03.53.02.52.01.51.0

N O

Ni H HMeOOC

D 15

H H

H H S CH3

20 19 171173

18 18116

N O

Ni H HMeOOC

D 15

H H

H H S CH3

20 19 171 172173

18 181 172

3 1

] m p p[ C

DQF-COSYHMBC Abb. I-28. Entscheidende 2D-NMR-Ausschnitte und -Korrelationen für Komponente D aus Rohisolat Nr. 4 - Pentamethylester (m/z 1021) (600/150 MHz; CD2Cl2:TFE-d3 [80:20] v/v).− a) DQF-COSY; b) MEd-HSQC; c) HMBC.

ab c

Die Zuordnungen für Komponente F des methylierten Rohisolates Nr. 4 erfolgten auf der Basis derselben Arten von NMR-Spektren wie für Komponente D (siehe Tab. I-6, I- 7, I-9). Wiederum sind die Signale für alle Protonen und Protonen-tragenden Kohlen- stoffe in den Ringen A-C mit ihren Seitenketten fast unverändert zu F430Me₅ aus Me- thanogenen sowie Komponente D. Hinsichtlich dieses Isomeren der F430-Variante treten die markantesten Differenzen in den chemischen Verschiebungen für die Proto- nen und Kohlenstoffe des Cyclohexenon-Ringes auf. Bei Isomer F sind die beiden H17¹-Protonen praktisch isochron (2.22 ppm), erkennbar an einem einzigen Kreuz- peak zu H17 im DQF-COSY und einem der Multiplizität von CH₂ entsprechenden Si- gnal im MEd-HSQC (siehe Abb. I-29). Die Konnektivität im Cyclohexenon-Ring basiert auf HMBC-Kreuzpeaks zwischen CH₃S und C17², zwischen H17² / C17 / C17³ sowie zwischen H₂17¹ / C17³ / C16. Was die Komponenten F aus den Rohisolaten Nr. 2 und Nr. 4 anbelangt, so unterschieden sich die chemischen Verschiebungen an ausgewähl- ten Kernen wie H3¹, H5‘‘, H7¹‘‘, H8¹‘‘, H8²‘, H10, H13, H13², H17¹, H18 und H20 nur im Bereich von ± 0.012 ppm, so daß damit die Identität beider Reinsubstanzen feststeht.

Vergleicht man die NMR-Daten für die Pentamethylester mit m/z 1021 (siehe Tab. I-6, I-7), so besteht kein Zweifel, daß die beiden Komponenten D und F als 17²-MeS- F430Me₅ dieselbe Konstitution besitzen und somit Konfigurationsisomere in Position C17² darstellen.

Die absolute Konfiguration an allen stereogenen Zentren von F430 aus methanogenen Archaea wurde vor etlichen Jahren durch spektroskopische Studien am nativen Cofaktor und partialsynthetischen Derivaten sowie mittels hochauflösender Röntgen- strukturanalyse am Holoenzym in dessen inaktiver Ni(II)-Form detailliert aufgeklärt (siehe Abschnitte I 1.2.2, II 1.1). Wie bereits in Kapitel I 2.4.1 ausgeführt, sind die CD- Spektren von F430Me₅ und der veresterten Komponenten D / F (m/z 1021) praktisch deckungsgleich, so daß auch deren absolute Konfiguration in den Ringen A-C überein- stimmt. Aus diesem Grunde genügte es, aus den NMR-Spektren der 17²-Epimeren die relative Konfiguration an C17 und C17² abzuleiten, um die absolute Konfiguration am zusätzlichen stereogenen Zentrum 17² der F430-Variante (m/z 951) zu erschließen.

Konkret zeigte ein Kreuzpeak zwischen H19 und H17 im ROESY beider Komponenten D / F an, daß in Analogie zu F430Me₅ die Konfiguration an C17 unverändert 17S lautet.

Für Isomer D tritt das Signal von H17¹‘‘ im 1D-Spektrum klar unterscheidbar als Quar- tett mit drei großen Kopplungskonstanten von etwa 12.5 Hz hervor, jeweils mit H17 und

į1H [ppm]

į H [ppm] 1

1.61.71.81.92.02.12.22.32.42.52.62.72.82.93.03.13.23.3

15 20 25 30 35 40 45 50 į1H [ppm]

] m p p[ C

2.22.32.42.52.62.72.82.93.03.13.23.33.4

168 170 172 174 176 178 180 182 184 186 188 190 į1H [ppm]

] m p p[ C

N O

Ni H HMeOOC

D 15

H H

H H S CH3

20 19 171173

18 18116

N O

Ni H HMeOOC

D 15

H H

H H S CH3

20 19 171 172173

18 181 172

16 DQF-COSYHMBC

C5-H5 C3-H3

CH3SC172-CH3SC172 C31-H31’’C31-H31’ C131-H131’’C131-H131’

C81-H81’C81-H81’’ C82-H82’C82-H82’’ C71-H271

C21-H21’C21-H21’’

C20-H220 C18-H18

C17-H17

C12-H12

C171-H2171 C121-H2121 C172-H172

C181-H2181

1.82.02.22.42.62.83.03.23.4

2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 C16-H2171 C173-H172C173-H2171

H17-H18 H172-H2171

H17-H2171 H19-H18

H19-H220 Abb. I-29. Entscheidende 2D-NMR-Ausschnitte und -Korrelationen für Komponente F aus Rohisolat Nr. 4 - Pentamethylester (m/z 1021) (600/150 MHz; CD2Cl2:TFE-d3 [80:20] v/v).− a) DQF-COSY; b) MEd-HSQC; c) HMBC.

ab c

H17² zusätzlich zur geminalen Kopplung mit H17¹‘ (siehe Abb. I-30 a). Dies erfordert für H17, H17¹‘‘ und H17² eine quasi-triaxiale trans-trans-Anordnung und zusammen mit den beobachteten NOEs die Konfiguration 17²S sowie die in Abbildung I-30 b gezeigte Halbsessel-Konformation des Cyclohexenon-Ringes. Im Gegensatz zu früheren Mes- sungen an F430Me₅ in CD₂Cl₂ waren bei Isomer F die beiden 17¹-Protonen praktisch isochron, eventuell bedingt durch den 2,2,2-TFE-d3-Anteil im Lösungsmittel und die dadurch induzierte Konformationsänderung in der Region C15-C19. Eine zufällige Überlappung von Kreuzpeaks beobachtete man auch bei Isomer D, und zwar für die MEd-HSQC-Signale C8²-H8²‘‘ mit C17¹-H17¹‘, was jedoch Konfigurations- und Konfor- mationszuordnung nicht behinderte. Auf die Zugabe geeigneter Verschiebungsreagen- zien wie C₆D₆ wurde in diesen Fällen verzichtet, da das Shim-Prozedere bei ternären Lösungsmittelgemischen erhebliche Probleme mit sich bringt, zumal das Material der verwendeten Shigemi-Röhrchen ohnehin auf Chloroform-d geeicht ist.

Das H17²-Signal von Isomer F liegt als Triplett vor mit zwei kleinen Kopplungskon- stanten von etwa 3 Hz zu den beiden Protonen an H17¹ (siehe Abb. I-31 a), wobei im Gegensatz zu Isomer D kein NOE zwischen H17 und H17² erkennbar ist. Abbildung I- 31 b-d verdeutlicht unmittelbar die verbleibenden Kombinationsmöglichkeiten aus Kon- figurationen an C17² und Konformationen des Cyclohexenon-Rings, exklusive der bereits eindeutig geklärten sterischen Verhältnisse in Isomer D. Aufgrund ihres Verhaltens in chromatographischen Trennsystemen ist bekannt, daß es sich bei den Komponenten D und F um Diastereomere beziehungsweise Epimere in Position 17² handeln muß. Unter Berücksichtigung der Kopplungs- und NOE-Muster kommt somit für Isomer F nur die Konfiguration 17²R in Frage, mit der in Abbildung I-31 b gezeigten Halbsessel-Konformation des Ringsystems.

Auf dieser Grundlage blieb schließlich noch zu klären, welches der beiden pentame- thylierten Isomere D / F der nativen MeS-Pentacarbonsäure in Protein I entspricht. Das HPLC-Chromatogramm des unveresterten Rohisolates Nr. 3 zeigt zwei Hauptkompo- nenten 1 / 2 mit m/z 905 / 951 im Verhältnis 55:45 sowie mehrere Nebenkomponenten mit einem von beiden m/z-Quotienten (siehe Abb. I-20 b). Nach sorgfältigem Entsalzen wurde zunächst das gesamte Rohisolat Nr. 3 in TFE-d3 gelöst und mittels NMR analysiert (siehe Abb. I-18). Obgleich die Linien infolge verbleibender paramagnetischer An- teile ein wenig verbreitert waren und viele Kreuzpeaks in den 2D-Spektren überlappten, ergaben die DQF-COSY-, TOCSY- und HSQC-Aufnahmen, daß es sich

O H

18171 15173 S H

H H CH3

17 172

16181H H

131

14 13

starker NOE J = 12.6 Hz; schwacher NOE = 12.6 Hz; J schwacher

NOE

starker NOEschwacher NOE J = 5.8 Hz;

starker NOE

klein; J starker NOE

H171’’H172 H19 x

xx x H172 H171’H18 H20 H17

H17 H172H19

H171’’ 1.61.82.02.22.42.62.83.03.23.43.6ppm [ppm] 3.0 2.5 2.0

H17H171’H171’’ (sehr kleiner NOE, hauptsächlich COSY) H131’’H131’

CH3S- X X: Artefakte aus nahegelegener Spur von H19

(172S)-172-MeS-F430Me5-172 H17¹

E __ Abb. I-30. Entscheidende Kopplungsparameter und 2D-Korrelationen für Komponente D aus Rohisolat Nr. 4 - Pentamethylester (m/z 1021) (600 MHz, CD2Cl2:TFE-d3 [80:20] v/v).− a) 1D-1 H- und DQF-COSY-Ausschnitte; b) Cyclohexenon-Ring in Seitenansicht mitJ-Werten und NOE-Korrelationen; c) ROESY-Signale (tm = 300 ms) von H172 .

ab c

2.22.42.62.83.03.23.4ppm

3.0 3.2 3.4

3.0 3.2 3.4 3.36ppm3.383.40

H172

H172 H172 H17H17

H17

H18 H172

H171 ROESY DQF-COSY

3.3 Hz3.3 HzO H S

H H

H H CH3

H H

18 15

173 17 172

16181

gr J s os J=

3Hz

131

J=3

H172

starkerNOE

k J

lein;

tas

rk re O N E

171starkerNOE (172R)-172-MeS-F430Me5- (172S)-172-MeS-F430Me5-(172R)-172-MeS-F430Me5-

O H

S HH H

CH3 H H

18 171

173 17

172 16181 131

13H172 kleinesbis

m ittleres Jerwartet mittleresbis grossesJ undstarkerNOE erwartet

O H

H SH H

H H H

18 171

173 17

172 16181 131

H172 CH3

grosses Jerwartet schwacher NOE erwartet

mittleresbis grossesJ undstarkerNOE erwartet

172 H171 171 H172171 H172

E __ DE __ DE __ Abb. I-31. Entscheidende Kopplungsparameter und 2D-Korrelationen für Komponente F aus Rohisolat Nr. 4 - Pentamethylester (m/z 1021) (600 MHz; CD2Cl2:TFE-d3 [80:20] v/v).− a) 1D-1 H-, DQF-COSY- und ROESY-Ausschnitte (tm = 300 ms); b)-d) Kombination denkbarer Konfigurationen und Konfor- mationen am Cyclohexenon-Ring (Seitenansicht mitJ-Werten und NOE-Korrelationen).

a dc

bei den Hauptkomponenten um F430 sowie dessen 17²-MeS-Derivat handelt. Letzte- res entspricht dabei eindeutig dem Pentamethylester D mit der Konfiguration 17²S (siehe Abb. I-30 b). Durch sukzessive Anwendung zweier verschiedener Typen von HPLC- Säulen (Chromolith^® / Hypercarb^®) gelang es letztendlich, die MeS-Hauptkomponente aus Rohisolat Nr. 3 als freie Pentacarbonsäure rein darzustellen und deren Struktur unter Anwendung einer Vielzahl von NMR-Techniken aufzuklären: 1D-¹H, {¹H}−¹³C, 2D DQF-COSY, TOCSY, MEd-HSQC, HMBC, ROESY (t_m = 300 ms). Unabhängig von den ersten Messungen an der Rohmischung konnten Konstitution und Konfiguration der Hauptkomponente als (17²S)-17²-Methylsulfanyl-F430 bestätigt werden (siehe Tab. I- 10). Allerdings bereiteten die verbliebenen Spuren an paramagnetischem Ni(II) und die dadurch bedingte Verkürzung von T₂ beziehungsweise Linienverbreiterung im HMBC einige Schwierigkeiten (siehe Abb. I-26 b), so daß Konfigurations- und Konformations- analyse nicht so erschöpfend ausgeführt werden konnten wie für die Pentamethyl- ester-Derivate D / F der F430-Variante.

Atom

G (¹H)

(17²S)-17²- MeS- F430Me5 in CD₂Cl₂:TFE- d3 [80:20]

(17²R)-17²- MeS- F430Me5 in CD₂Cl₂:TFE- d3 [80:20]

F430Me5in CD2Cl2:TFE-

d3 [80:20]

(17²S)-17²- MeS-F430 in

TFE-d3

F430 in TFE- d3

H2¹" 2.58 2.57 2.58 2.64 2.60

H2¹' 2.79 2.79 2.77 2.79 2.73

CH₃-C2 1.06 1.06 1.06 1.11 1.08

H3 2.55 2.54 2.62 2.66 2.60

H3¹" 1.59 1.58 1.57 1.70 1.65

H3¹' 1.75 1.75 1.75 1.82 1.77

H3² 2.29 2.30 2.29 2.33 2.26

CH3O-C3³ 3.69 3.66

H4 4.38 4.37 4.39 4.51 4.45

H5" 1.42 1.39 1.45 1.51 1.48

H5' 1.81 1.81 1.82 2.00 1.95

H7¹" 2.41 2.41 2.38 2.53 2.49

H7¹' 2.46 2.47 2.45 2.55 2.49

CH3-C7 1.18 1.18 1.17 1.22 1.18

H8 2.79 2.78 2.78 2.89 2.86

H8¹" 1.95 1.95 1.97 2.03 2.18

H8¹' 2.24 2.23 2.24 2.31 2.26

H8²" 2.47 2.47 2.48 2.51 2.44

H8²' 2.58 2.58 2.57 2.61 2.56

CH3O-C8³ 3.73 3.71

H10 5.78 5.74 5.73 5.95 5.91

H12 3.07 3.08 3.07 3.17 3.13

H12¹ 2.78 2.81 2.75/2.71 2.80 2.67

CH₃O-C12² 3.66 3.65

H13 3.83 3.81 3.82 4.00 3.91

H13¹" 1.57 1.73 1.60 1.80 1.71

H13¹' 1.87 1.98 1.89 1.96 1.93

H13²" 2.17 2.25 2.15 2.11 2.09

H13²' 2.36 2.31 2.35 2.29

CH3O-C8³ 3.64 3.64

H17 2.86 2.94 2.73 3.00 2.83

Tab. I-6 a. ¹H-NMR-Daten für (17²S)-17²-MeS-F430Me₅, (17²R)-17²-MeS-F430Me₅ und (17²S)-17²- MeS-F430 sowie für F430Me₅ und F430 im Vergleich. Pentamethylester bei 600 MHz, Pentacar- bonsäuren bei 700 MHz, δ in ppm.

Atom

G (¹H)

(17²S)-17²- MeS- F430Me5 in CD2Cl2:TFE- d3 [80:20]

(17²R)-17²- MeS- F430Me5 in CD2Cl2:TFE- d3 [80:20]

F430Me5in CD2Cl2:TFE-

d3 [80:20]

(17²S)-17²- MeS-F430 in

TFE-d3

F430 in TFE- d3

H17¹" 1.92 2.22 1.77 2.01 1.78

H17¹' 2.48 2.09 2.62 2.19

H17² 3.56 3.35 2.63/2.53 3.66 2.63/2.58

CH3S-C17² 2.16 2.25 2.19

H18 2.53 2.50 2.46 2.51 2.38

H18¹ 2.54 2.51 2.56/2.49 2.51 2.45

CH3O-C18² 3.71 3.68

H19 3.51 3.47 3.51 3.60 3.55

H20 3.03 3.01 3.08/3.04 3.07 3.02

Tab. I-6 b. ¹H-NMR-Daten für (17²S)-17²-MeS-F430Me₅, (17²R)-17²-MeS-F430Me₅ und (17²S)-17²- MeS-F430 sowie für F430Me₅ und F430 im Vergleich. Pentamethylester bei 600 MHz, Pentacar- bonsäuren bei 700 MHz, δ in ppm.

Atom

G (¹³C)

(17²S)-17²- MeS- F430Me₅ in CD₂Cl₂:TFE- d3 [80:20]

(17²R)-17²- MeS- F430Me₅ in CD₂Cl₂:TFE- d3 [80:20]

F430Me₅in CD₂Cl₂:TFE-

d3 [80:20]

(17²S)-17²- MeS-F430 in

TFE-d3

F430 in TFE- d3

C1 187.8 187.6 188.3 190.2 190.3

C2 53.8 53.9 54.5 55.9 55.9

C2¹ 41.5 41.6 41.8 43.2 43.3

C2² 172.4 172.3 172.6 175.5 175.6

Me-C2 19.6 19.8 20.0 20.6 20.6

C3 42.7 42.6 43.3 45.1 45.4

C3¹ 19.6 19.6 20.1 21.7 22.1

C3² 31.7 31.8 32.3 34.4 35.2

C3³ 174.1 n. z.* 174.1 179.0 180.2

C4 64.5 64.6 65.2 66.7 66.9

C5 35.6 35.8 36.2 37.5 37.5

C6 91.6 91.4 92.0 94.2 94.1

C7 49.3 49.3 49.9 51.4 51.5

C7¹ 42.9 43.0 43.4 44.8 44.8

C7² 174.1 174.0 174.1 177.7 177.8

Me-C7 14.6 14.9 15.2 15.4 15.5

C8 56.2 56.1 56.7 58.4 58.5

C8¹ 21.5 21.7 22.1 23.6 24.0

C8² 31.9 31.9 32.5 34.3 35.1

C8³ 173.3 173.3 173.5 178.7 179.7

C9 176.7 176.2 176.7 179.3 179.3

C10 98.0 97.3 98.4 100.3 100.3

C11 169.4 169.4 169.7 171.5^# 171.8

C12 43.9 44.2 44.7 45.8 46.3

C12¹ 38.7 38.2 39.2 40.6 41.7

C12² 172.0 172.3 172.3 176.8 177.8

C13 49.5 48.9 50.0 51.7 51.5

C13¹ 29.8 28.5 30.2 30.8 31.1

C13² 31.2 31.1 31.7 32.6 33.0

C13³ 174.1 173.8 174.0 178.8 179.6

C14 178.5 n. z.* n. z.* 181.1 180.5

Tab. I-7 a. ¹³C-NMR-Daten für (17²S)-17²-MeS-F430Me₅, (17²R)-17²-MeS-F430Me₅ und (17²S)-17²- MeS-F430 sowie für F430Me₅ und F430 im Vergleich. Pentamethylester bei 150 MHz, Pentacar- bonsäuren bei 175 MHz, δ in ppm.

* nicht zugeordnet

# keine HMBC-Korrelationen; Zuordnung in Analogie zum 1D-¹³C-Spektrum

Atom

G (¹³C)

(17²S)-17²- MeS- F430Me₅ in CD₂Cl₂:TFE- d3 [80:20]

(17²R)-17²- MeS- F430Me₅ in CD₂Cl₂:TFE- d3 [80:20]

F430Me₅in CD₂Cl₂:TFE-

d3 [80:20]

(17²S)-17²- MeS-F430 in

TFE-d3

F430 in TFE- d3

C15 n. z.* 106.7 109.2 110.4^# 110.4

C16 n. z.* 170.7 172.8 173.6 174.8

C17 49.5 46.2 50.4 51.5 51.8

C17¹ 32.0 30.8 25.1 34.1 26.6

C17² 51.0 49.9 38.1 53.4 39.3

MeS-C17² 12.9 15.2 - 13.6 -

C17³ 192.4 189.9 196.2 195.2^# 199.6

C18 44.2 44.8 45.1 47.2 47.6

C18¹ 34.0 34.1 34.7 37.2 38.2

C18² 172.7 172.7 172.9 178.8^# 179.7

C19 62.6 62.6 63.3 64.7 65.2

C20 27.3 27.2 28.0 29.1 29.5

Tab. I-7 b. ¹³C-NMR-Daten für (17²S)-17²-MeS-F430Me₅, (17²R)-17²-MeS-F430Me₅ und (17²S)-17²- MeS-F430 sowie für F430Me₅ und F430 im Vergleich. Pentamethylester bei 150 MHz, Pentacar- bonsäuren bei 175 MHz, δ in ppm.

* nicht zugeordnet

# keine HMBC-Korrelationen; Zuordnung in Analogie zum 1D-¹³C-Spektrum

Proton DQF-COSY MedHSQC HMBC

H2¹" H2¹' C2¹(t) C1, C2, CH3-C2

H2¹' H2¹" C2¹(t) C1, C2, CH₃-C2

CH₃-C2 Me-C2 (q) C1, C2, C2¹, C2², C3

H3 H4, H3¹', H3¹" C3 (d) C3¹

H3¹" H3, H3¹', H3²', H3²" C3¹(t) C3

H3¹' H3, H3¹", H3²', H3²" C3¹(t) C3, C3², C3³

H3² H3¹', H3¹" C3²(t) C3, C3¹, C3³

CH₃O-C3³ CH₃O-C3³ (q) C3³

H4 H3, H5', H5'', H20 C4 (d) C1, C2, C6

H5" H4, H5' C5 (t) C4, C6

H5' H4, H5'' C5 (t) C4, C6

H7¹" H7¹' C7¹(t) C7, C7², CH₃-C7, C8

H7¹' H7¹" C7¹(t) C7², C8

CH3-C7 Me-C7 (q) C6, C7, C7¹

H8 H8¹', H8¹" C8 (d) C8¹, C8², C9

H8¹" H8, H8¹', H8²', H8²" C8¹(t) C8³ H8¹' H8, H8¹", H8²', H8²" C8¹(t) C7 H8²" H8^1', H8¹", H8^2' C8²(t) C8¹, C8³ H8²' H8¹', H8¹'', H8²" C8²(t) C8, C8¹

CH3O-C8³ CH3O-C8³(q) C8³

H10 C10 (d) C8, C9, C11, C12

H12 H10, H12¹, H13 C12 (d) C12²

H12¹ H12 C12¹(t) C11, C12², C13

CH₃O-C12² CH₃O-C12²(q) C12²

H13 H12, H13^1', H13¹" C13 (d) C12¹, C13¹, C13², C14

H13¹" H13¹', H13²', H13²" C13¹(t) C13³ H13¹' H13¹", H13²', H13²" C13¹(t) C14 H13²" H13¹', H13¹", H13²' C13²(t) C13¹, C13³ H13²' H13¹', H13¹", H13²" C13²(t) C13¹, C13³

CH3O-C13³ CH3O-C13³(q) C13³

H17 H17¹', H17¹", H18 C17 (d)

H17¹" H17, H17¹', H17² C17¹(t) C17, C18, C17², C17³

Tab. I-8 a. 2D-NMR-Korrelationen für (17²S)-17²-MeS-F430Me₅ in CD₂Cl₂:TFE-d3 [80:20] v/v.

Proton DQF-COSY MedHSQC HMBC

H17¹' H17, H17¹", H17² C17¹(t) C17², C17³ H17² H17¹', H17¹" C17²(d) C17¹, C17³, CH₃S-

C17²

CH₃S-C17² MeS-C17²(q) C17²

H18 H17, H19 C18 (d) C19

H18¹ C18¹(t) C17, C18, C18², C19

CH3O-C18² CH3O-C18²(q) C18²

H19 H18, H20 C19 (d)

H20 H4, H19 C20 (t) C1, C18, C19

Tab. I-8 b. 2D-NMR-Korrelationen für (17²S)-17²-MeS-F430Me₅ in CD₂Cl₂:TFE-d3 [80:20] v/v.

Proton COSY MEdHSQC HMBC

H2¹" H2¹' C2¹(t) C1, C2, CH3-C2

H2¹' H2¹" C2¹(t) C1, C2, CH₃-C2

CH₃-C2 Me-C2 (q) C1, C2, C2¹, C2², C3

H3 H4, H3¹', H3¹" C3 (d) C3¹

H3¹" H3, H3¹', H3²', H3²" C3¹(t) C3

H3¹' H3, H3¹", H3²', H3²" C3¹(t) C3, C3², C3³

H3² H3¹', H3¹" C3²(t) C3, C3¹, C3³

CH₃O-C3³ CH₃O-C3³(q) C3³

H4 H3, H5', H5'', H20 C4 (d) C1, C2, C6

H5" H4, H5' C5 (t) C4, C6

H5' H4, H5'' C5 (t) C4, C6

H7¹" H7¹' C7¹(t) C7, C7², CH₃-C7, C8

H7¹' H7¹" C7¹(t) C7², C8

CH3-C7 Me-C7 (q) C6, C7, C7¹

H8 H8¹', H8¹" C8 (d) C8¹, C8², C9

H8¹" H8, H8¹', H8²', H8²" C8¹(t) C8³ H8¹' H8, H8¹", H8²', H8²" C8¹(t) C7 H8²" H8¹', H8¹", H8²' C8²(t) C8¹, C8³ H8²' H8¹', H8¹", H8²" C8²(t) C8, C8¹

CH3O-C8³ CH3O-C8³(q) C8³

H10 C10 (d) C8, C9, C11, C12

H12 H10, H12¹, H13 C12 (d) C12²

H12¹ H12 C12¹(t) C11, C12², C13

CH₃O-C12² CH₃O-C12²(q) C12²

H13 H12, H13¹', H13¹" C13 (d) C12¹, C13¹, C13², C14

H13¹" H13¹', H13²', H13²" C13¹(t) C13³ H13¹' H13¹", H13²', H13²" C13¹(t) C14 H13²" H13¹', H13¹", H13²' C13²(t) C13¹, C13³ H13²' H13¹', H13¹", H13²" C13²(t) C13¹, C13³

CH3O-C13³ CH3O-C13³(q) C13³

H17 H17¹, H18 C17 (d)

H17¹ H17, H17¹, H17² C17¹(t) C17, C18, C17²,

C17³

Tab. I-9 a. 2D-NMR-Korrelationen für (17²R)-17²-MeS-F430Me₅ in CD₂Cl₂:TFE-d3 [80:20] v/v.

Proton COSY MEdHSQC HMBC

H17² H17¹ C17²(d) C17¹, C17³, CH3S-

C17²

CH3S-C17² MeS-C17²(q) C17²

H18 H17, H19 C18 (d) C19

H18¹ C18¹(t) C17, C18, C18², C19

CH3O-C18² CH3O-C18²(q) C18²

H19 H18, H20 C19 (d)

H20 H4, H19 C20 (t) C1, C18, C19

Tab. I-9 b. 2D-NMR-Korrelationen für (17²R)-17²-MeS-F430Me₅ in CD₂Cl₂:TFE-d3 [80:20] v/v.

Proton COSY MEdHSQC HMBC

H2¹" H2¹' C2¹(t) C2, C2²

H2¹' H2¹" C2¹(t) C2, C2², C3

CH₃-C2 Me-C2 (q) C1, C2, C2¹, C3

H3 H4, H3¹', H3¹" C3 (d) H3¹" H3, H3¹', H3²', H3²" C3¹(t)

H3¹' H3, H3¹", H3²', H3²" C3¹(t) C3³, C4

H3² H3¹', H3¹" C3²(t) C3, C3³

H4 H3, H5', H5'', H20 C4 (d)

H5" H4, H5' C5 (t) C4

H5' H4, H5'' C5 (t) C6

H7¹" C7¹(t)

H7¹' C7¹(t) C6, C7²

CH₃-C7 Me-C7 (q) C6, C7, C7¹, C8

H8 H8¹', H8¹" C8 (d) C9

H8¹" H8, H8¹', H8²', H8²" C8¹(t) H8¹' H8, H8¹", H8²', H8²" C8¹(t)

H8²" H8¹', H8¹", H8²' C8²(t) C8 H8²' H8¹', H8¹", H8²" C8²(t) C8³

H10 C10 (d)

H12 H12¹ C12 (d)

H12¹ H12 C12¹(t) C12²

H13 * C13 (d)

H13¹" H13¹', H13²', H13²" C13¹(t)

H13¹' H13¹", H13²', H13²" C13¹(t) C13³, C14 H13²" H13¹', H13¹", H13²' C13²(t) C13³ H13²' H13¹', H13¹", H13²" C13²(t)

H17 H17¹', H17¹", H18 C17 (d) H17¹" H17, H17¹', H17² C17¹(t)

H17¹' H17, H17¹", H17² C17¹(t) C16 H17² H17¹', H17¹" C17²(d)

CH₃S-C17² MeS-C17²(q) C17²

H18 H17, H18¹, H19 C18 (d) C18²

H18¹ H18 C18¹(t) C18

Tab. I-10 a. 2D-NMR-Korrelationen für (17²S)-17²-MeS-F430 in TFE-d3.

* H13 nach ca. 4 h in TFE-d3 vollständig durch D ausgetauscht

Proton COSY MEdHSQC HMBC

H19 H18, H20 C19 (d)

H20 H4, H19 C20 (t) C1

Tab. I-10 b. 2D-NMR-Korrelationen für (17²S)-17²-MeS-F430 in TFE-d3.

2.5 17

-Epimerisierung der MeS-Variante

Wie in Abschnitt I 2.3 dargelegt, unterschieden sich die Rohisolate Nr. 2-4 als Penta- carbonsäuren und im Falle von Nr. 2/4 auch als Pentamethylester signifikant im Ver- hältnis der 17²-Epimeren. Für die freien Säuren wurden folgende (17²S):(17²R)- Quotienten bestimmt: Nr. 2 → 46:54; Nr. 3 → 90:10; Nr. 4 → 74:26. Angesichts der aus- nahmsweise mehrtägigen Einwirkung starker Mineralsäure mit begleitender Neutrali- sationswärme bei Gewinnung von Rohisolat Nr. 2 lag es nahe, daß das (17²R)- Epimere ein Artefakt darstellt (siehe Kapitel I 4.2). Die sich anschließende Veresterung dieses Isolates bewirkte eine weitere (17²S):(17²R)-Konversion von 46:54 auf 23:77.

Bei konstanter H⁺-Konzentration (70 mM) im Methylierungsansatz konnte diese Um- wandlung durch Abkühlen (4 °C) auf 32:68 reduziert werden.

Aus Abbildung I-32 erkennt man unmittelbar, daß der MeS-Rest in α-Position zur Carbonyl-Gruppe des Cyclohexenon-Rings lokalisiert ist. Racemisierung oder − in diesem Fall − Epimerisierung unter Erhalt der Konstitution kann durch Spaltung und Neu- knüpfung von Kovalenzen unter anderem bei α-substituierten Carbonylverbindungen auftreten. Da dies jedoch an ein planares Zwischenprodukt in Form eines Enols beziehungsweise Enolates gekoppelt ist und das Gleichgewicht der Keto-Enol-Tautomerie in protischen, nucleophilen Lösungsmitteln mit geringer intramolekularer Stabilisierung stark auf der Seite des Ketons liegt, sind Säuren oder Basen als Katalysator obligato- risch (siehe Abb. I-33). Die HPLC auf Hypercarb^® in perchlorsaurer Lösung ermöglichte es nicht nur, die quantitative Zusammensetzung der Rohisolate zu analysieren, son- dern auch das thermodynamische Gleichgewicht zwischen (17²S)-17²-MeS-F430 und (17²R)-17²-MeS-F430 zu bestimmen. Ausgehend von praktisch reinem (17²S)-17²- MeS-F430 (> 99 %) wurden zunächst zwei Ansätze bei 50 °C für 3 h inkubiert, und zwar sowohl in 0.1 M HClO₄ (pH 1.0) als auch in 0.1 M KH₂PO₄-Puffer (pH 5.8). Die (17²S):(17²R)-Konversion im stark sauren Medium betrug 84:16, während in der gepuf- ferten Lösung immer noch > 97 % des (17²S)-Epimers vorlag. Entsprechende Versu- che in 20 % H₂SO₄ bei 4 °C ergaben 59 % des (17²S)-Epimers nach 3 d, 78 % nach 7 d und 80 % nach 16 d (siehe Abb. I-34). Letzterer Zahlenwert änderte sich auch nach weiteren 13 d Inkubationsdauer nicht mehr, so daß ein (17²S):(17²R)-Quotient von 1:4 dem thermodynamischen Gleichgewicht entspricht. Abbildung I-35 zeigt das zugrun- deliegende Diagramm für eine Reaktion pseudoerster Ordnung, dessen Graphen unter

den Voraussetzungen

(Gl. I-29)

mit

(Gl. I-30)

sowie einer Geschwindigkeitskonstanten k = 0.41 d⁻¹ folgender Gleichung gehorchen:

(Gl. I-31).

Die nach diesem Zeitraum beobachtete spurenweise Oxidation zu den entsprechenden F560-Derivaten sowie die in erheblichem Ausmaß eingetretene Epimerisierung in Position 12/13 zeigten für die (17²S)- und die (17²R)-Verbindung dieselbe Präferenz.

Was weiterführende Überlegungen zu der (17²R)-17²-MeS-Komponente als artifizi- elles, wenngleich thermodynamisch stabileres Epimer in enger Analogie zu 12,13-Di-

d 17( ²S) ---dt

– d 17( ²R)

---dt k₁(17²S) k ₁

– (17²R) –

= =

K k₁ k ₁

–

--- [17²R] 17²S

[ ]

---

= = und x ₁₇2

( )( )0 = 1

x(17²S)

k ₁

–

k₁ k ₁ + –

--- 1 k ₁ k₁ –k ₁

+ –

---

 – 

 e^–⁽^k¹⁺^k^–¹⁾^t +

N N

O Ni H HN

H O H₂N

O RO

H O RO

OR O

RO O H₃C S

A B

C D

13 3

10 20

17² 17¹ 17³ 17

15 19

N N

O Ni H HN

H O H₂N

O RO

H O RO

OR O

RO O H₃C S

A B

C D

13 3

10 20

17² 17¹ 17³ 17

15 19

Natives Stereoisomer:

R = H: (17²S)-17²-MeS-F430 R = CH₃: (17²S)-17²-MeS-F430Me₅

Thermodynamisch begünstigtes Stereoisomer:

R = H: (17²R)-17²-MeS-F430 R = CH₃: (17²R)-17²-MeS-F430Me₅

Abb. I-32. Pentamethylester der F430-Variante: absolute Konfiguration der Epimere in Position 17².

N O

Ni H H O

H H

H H S CH3

N OH

Ni H H O

H H

H H S CH3

D N O

Ni H H O

H H

H H S CH3

N O

Ni H H O

H H

H H S CH3

HHH

D N O

Ni H H O

H H

H H S CH3

HHH

+ H+ / H+ B

+ H+ 172 -MeS-F430 (172 R)-172 -MeS-F430

(172 S)-172 -MeS-F430 172 -MeS-F430 (Enol) 172 -MeS-F430 (Enolat)

+ H+ / H+ 15

20 19 171

18 182181

20 19 171

18 182181 15

20 19 171

18 182181

20 19 171

18 182181 172 15

20 19 171

18 182181 172

172

+

173

173 * Abb. I-33. Säure-/Base-katalysierte Epimerisierung der Methylsulfanyl-Variante von F430 in Position 172 .

Abb. I-34. Analytische HPLC auf Hypercarb^® 5 µm / HClO₄ in H₂O (pH 1.0) / MeCN: Epimerisierung von (17²S)-17²-MeS-F430 (1) zu (17²R)-17²-MeS-F430 (2) in 20 % H₂SO₄ / 4 °C nach 0 d (a), 3 d (b), 7 d (c), 16 d (d), 29 d (e).

1 1 1

2 2

epi-F430 anbelangt, so verdient die Arbeit von Fraser und Faibish (1995) einige Auf- merksamkeit. Daraus geht hervor, daß die axiale Präferenz von α-Substituenten im Cyclohexanon-Ring in folgender Reihe zunimmt: F− < CH₃O− < Cl− < Br− < CH₃S−.

Dies steht voll und ganz im Einklang mit dem Verlauf der säurekatalysierten Epimeri- sierung in Position 17² der F430-Variante (vgl. Mayr et al., 2008a).

No documento III Weitere Studien zur Wirkungsweise von F430 (páginas 107-133)