Hochleistungs-Flüssigchromatographie

In den Bereichen von 1-10 bar / 10-40 bar / > 40 bar spricht man von Niederdruck- (LPLC) / Mitteldruck- (MPLC) / Hochdruckchromatographie (HPLC), wobei HPLC bes- ser als Abkürzung für Hochleistungs-Flüssigchromatographie dient, da die chromato- graphische Separation selbst nicht durch den Druck bedingt wird. Analytische Trennungen umfassen Substanzmengen von < 1 µg bis < 1 mg, präparative Ansätze von > 1 mg. Im Gegensatz zur isokratischen Elution nimmt im Gradientenmodus die Peakbreite nicht automatisch mit wachsender Retentionszeit zu. Allerdings erfordern chemisch unmodifizierte Phasen sehr zeitaufwendige Gleichgewichtseinstellungen, so daß Gradientenelutionen in der Regel an Umkehrphasen gebunden sind (vgl. Rücker et al., 2001: 440-466).

Term I der in Abbildung I-13 angeführten Fundamentalgleichung der Chromatogra- phie wird als Verzögerungsterm bezeichnet und dient zur Optimierung der k‘-Werte, wobei der später eluierende Peak ausschlaggebend ist. Bei diesem Wert handelt es sich ebenso wie bei dem Trennfaktor α um einen Index, unabhängig von apparativen Gegebenheiten (Säulendimensionen, Fluß). Beruht die Trennung überwiegend auf Ad- sorptionsvorgängen, so kann k‘ durch die Polarität der mobilen beziehungsweise durch die Aktivität der stationären Phase beeinflußt werden, bei Verteilungsvorgängen hinge- gen über die Temperatur. Optimale Werte für k‘ liegen im allgemeinen zwischen 2 und 10, während eine weitere Erhöhung eher die Analysenzeiten unnötig verlängert. Den Einfluß des Trennfaktors α auf die Auflösung beschreibt der Selektivitätsterm II, des- sen Wert mit steigendem α gegen 1 geht und sich durch Veränderung der chemischen Eigenschaften von stationärer und/oder mobiler Phase einstellen läßt. Für α ≈ 1 als Quotient aus zwei Retentionszeiten (k‘) kann auch bei höchster Trennleistung des Sy- stems (Term III) keine ausreichende Substanzseparation mehr erhalten werden. Se- lektivität beschreibt also den Abstand von Peakspitze zu Peakspitze, berücksichtigt jedoch im Gegensatz zur Bodenzahl nicht die Peakform. Der Dispersionsterm III wie- derum markiert den Einfluß der Trennleistung beziehungsweise der Säuleneffizienz auf die Auflösung. Für eine Verdopplung von R_S ausschließlich über N müßte die Säu- lenlänge vervierfacht werden, was aufgrund des damit verbundenen Druckanstiegs im System häufig nicht möglich ist. Diese Bodenzahl N gilt letzten Endes als Maß für die Verbreiterung der Substanzzone aufgrund von Diffusionsvorgängen und kann auf eine Säule unter definierten Bedingungen (theoretisch) oder auf eine retardierte Kompo- nente (effektiv) bezogen werden.

Am schwierigsten zu realisieren, wenngleich am effektivsten erfolgt die Maximie- rung von R_S über eine Änderung von α. In direkter Folge steht dann die Erhöhung der Dispersion durch verlängerte Säulen oder über verringerte Korngröße der stationären Phase bei konstanten Säulendimensionen und damit auch konstanter Retentionszeit.

Das „kαN“-Prinzip (siehe Abb. I-13) empfielt, zunächst für ausreichende Wechselwir- kungen zwischen Trennsystem und Probe zu sorgen und akzeptable Retentionszeiten einzustellen. Anschließend ist mit vertretbarem Aufwand eine möglichst gute Selektivi- tät zu erzielen. Scheint die Auflösung immer noch nicht zufriedenstellend, so muß die Peakform anhand der aufgelisteten Maßnahmen verbessert werden. Was die Wahl von Acetonitril oder Methanol anbelangt, so liefert Letzteres vor allem bei kleinen po-

Abb. I-13. Das „kαN-Prinzip“ zur Verbesserung der Auflösung am Beispiel der RP-HPLC (verän- dert nach Rücker et al., 2001: 402; Kromidas, 2006: 18).

Rs 0.25 k′

1 k′+

--- α–1 ---α N

⋅ ⋅ ⋅

Fundamentalgleichung = der Chromatographie:

{ { {

I II III

I Optimierung der Retention: 2 ≤ k' ≤ 10

♦ Stationäre Phase

♦ Eluentenzusammensetzung

♦ Temperatur

II Optimierung der Selektivität: 1.1 ≤ α ≤ 2.0

♦ Stationäre Phase

♦ wechselweiser Ersatz von MeCN durch MeOH

♦ Modifikatoren (z. B. n-BuOH / THF / HAc / Amine)

♦ Temperatur (im Regelfall ↓)

III Optimierung der Dispersion: N erhöhen

♦ Säulenlänge ↓

♦ Teilchengröße des Sorbens ↓

♦ Eluentenfluß ↑

♦ Temperatur ↑

♦ Injektionsvolumen ↓

♦ Elutionskraft des Probenlösungsmittels ↓

♦ Totvolumen der Apparatur ↓

laren Molekülen und stark hydrophoben Phasen für Mischungen gleicher Elutionskraft die bessere Selektivität, während die erhöhte Viskosität im Vergleich zu MeCN eine schlechtere Peakform bedingt. Außerdem driftet der pH-Wert nach Zugabe von MeOH stärker ins Alkalische als nach Zusatz von MeCN. Bei Temperaturerniedrigung treten die Eigenschaften der stationären Phase in den Vordergrund, wobei sich Enthalpie- wie Entropiedifferenzen stärker bemerkbar machen und somit die Selektivität steigt, während abnehmende Kinetik und Bodenzahl zu einer Peakverbreiterung führen. Die- se Maßnahme empfielt sich für solche Trennungen, in deren Verlauf dem sterischen Aspekt der Einzelkomponenten eine Schlüsselrolle zukommt. Eine Temperaturerhö- hung wiederum verringert die Retentionszeiten, senkt die Viskosität des Eluenten und infolgedessen den Rückdruck. Hinsichtlich der Probeninjektion ist es in jedem Fall rat- sam, größere Volumina einer eluentenähnlichen Lösung als kleinere Volumina mit stärkerer Elutionskraft aufzutragen.

Das „Subtraktions-Modell“ für die Selektivität in der RP-Chromatographie basiert auf fünf Typen von Molekül-Säulen-Wechselwirkungen: Hydrophobizität − Sterischer Wi- derstand − Wasserstoffbrückenbindung durch Säulen-Acidität − Wasserstoffbrücken- bindung durch Säulen-Basizität − Kationenaustauschaktivität der Säule. Bei Überprüfung an ca. 150 Substanzen und ebenso vielen Alkyl-Säulen konnten Reten- tion und Selektivität mit einer mittleren Treffergenauigkeit von ±1 % berechnet werden (vgl. Kromidas, 2006: 6-11, 16, 18, 20-22, 29 f., 334-336).

Sofern die Probenlösung im gewählten Fließmittel hinreichend aufkonzentriert wer- den kann, bereitet der Übergang vom analytischen in den präparativen Maßstab keine Probleme. Genügt ferner die optimierte Auflösung des gewählten Trennsystems, so läßt sich der Massendurchsatz durch gezielte Überladung markant erhöhen, wohinge- gen eine Überlastung der Säule unbedingt zu vermeiden ist. Neben den im vorherge- henden Abschnitt genannten Methoden zur Verbesserung von R_S kann man bei geringen Retardationsdifferenzen auch die Recycling-Chromatographie einsetzen.

Hierbei wird das Eluat nicht sofort abgeführt, sondern mit Hilfe spezieller Ventilschal- tungen an den Säulenanfang zurückgeleitet und so lange kreisförmig chromatogra- phiert, bis die Trennstufenzahl für die Separation der interessierenden Komponenten ausreicht, ohne auf verlängerte Säulen zurückgreifen zu müssen. Hat die Trennung un- ter isokratischen Bedingungen zu erfolgen, so greift man aufgrund des großen Zeitbe- darfs häufig auf die Säulenumschalttechnik zurück. Durch Kombination mehrerer

kurzer Säulen mit zwischengeschalteten Ventilen kann hierbei die „Säulenlänge“ je nach Trennverhalten der Substanzen während der Chromatographie geändert werden, was gerade in der Gaschromatographie vorteilhaft zum Einsatz kommt (vgl. Geckeler und Eckstein, 1987: 223-228).

Für die experimentelle Ausführung der vorliegenden Dissertation spielen zwei RP- Phasen eine dominierende Rolle: Chromolith^® und Hypercarb^® (siehe Kapitel I 4.7).

Selbst in einer ideal mit sphärischen Teilchen derselben Größe gepackten Säule be- trägt das Totvolumen mindestens 30 %. Um diesen Verlust an chromatographisch ak- tiven Zonen soweit als möglich zu verringern, kann man zum einen die Partikelgröße der stationären Phase bis zu einer technischen Untergrenze von etwa 2 µm verringern, was jedoch den Rückdruck stark erhöht, mit allen bekannten Verschleißerscheinungen hinsichtlich HPLC-Pumpe und Säulenmaterial. Vorteilhaft kommen in diesem Fall mo- nolithische Phasen zum Einsatz, für deren Herstellung flüssige Vorläufersubstanzen zu porösen Massen aus vernetzten Partikeln polymerisiert werden, wodurch sowohl der chemische Aufbau als auch der Durchmesser von Kanälen und Poren unabhängig voneinander kontrolliert werden können. Inzwischen ist auch eine Reihe organischer Ausgangsmonomere wie Styren oder Divinylbenzen bekannt, welche sich direkt in ge- eigneten Wandmaterialien polymerisieren lassen. Bezüglich Chromolith^® basiert diese Reaktion konkret auf der Hydrolyse und Polykondensation von Tetramethoxysilan in Gegenwart von Polyethylenglycol, Harnstoff sowie anderen Reagenzien unter Ausbil- dung kieselgelreicher und wäßriger Regionen. Nach Penetrieren der Wandstrukturen mit Alkalien und Trocknen bleibt dann ein schwammartiges Kieselsäure-Skelett mit ei- ner Oberfläche von 300 m² g⁻¹ zurück, gekennzeichnet durch Makro- (≈ 2 µm) und Me- soporen (≈ 13 nm), welche maximale Auflösung bei hohen Flußraten und minimalem Gegendruck gewährleisten (siehe Abb. I-14 a, b). Lediglich die geringe Toleranz der stationären Phase gegenüber Alkalien (pH-Stabilität: 2.0-7.5) sowie der Säulenwan- dung (Polyetherketone) gegenüber THF und DMSO schränken die Anwendbarkeit der Chromolith^®-RP-18e-Säulen ein (vgl. Jacoby, 2006; Merck, 2006).

Hypercarb^®-Medien bestehen zu 100 % aus sphärischen, porösen graphitisierten Kohlenstoff-Partikeln (PGC) mit planaren hexagonalen Schichten, ähnlich einem poly- zyklischen aromatischen Kohlenwasserstoff. Die Oberfläche ist kristallin, ohne Mikro- poren und hochreproduzierbar in der Herstellung sowie von gänzlich anderem Charakter als silicamodifizierte Phasen mit bürstenartiger Anordnung der Alkylliganden

(siehe Abb. I-14 c). Bei einer durchschnittlichen Porengröße von 250 Å und einer spe- zifischen Oberfläche von 120 m² g⁻¹ können über den gesamten pH-Bereich von 0-14 sowohl NP- als auch RP-Lösungsmittel verwendet werden, deren Klassifizierung aller- dings nicht auf den für Kieselgel-Materialien üblichen eluotropen Reihen beruht. Viel- mehr nimmt die Elutionsstärke wie folgt zu: MeOH ≤ MeCN ≈ 1,4-Dioxan <

MeCN:Isopropylalkohol [1:1] < MeCN:Isopropylalkohol [1:3] < THF ≈ DCM < Toluen ≈ Chloroform. Als kompetitive Modifikatoren zur Verringerung polarer Retention kommen Trifluoressigsäure oder Diethylamin in Frage. Im Gegensatz zu weitgehend anisotro- pen Silica-Phasen zeigt die Hypercarb^®-Oberfläche räumliche Selektivität mit der Mög- lichkeit, geometrische Isomere und andere eng verwandte Komponenten zu

Abb. I-14. Stationäre Phasen von RP-HPLC-Säulen. − a)-b) Chromolith^®-Makroporen und -Meso- poren; c) RP-18-Oberflächenstruktur im Vergleich zum porösen graphitisierten Kohlenstoff (PGC) des Hypercarb^®-Materials.

a b

c

inerte Oberfläche ohne funktionelle Gruppen

Stabilität im Bereich von pH 1-14 Hydrolyse der Organosilane

bei pH < 2

Auflösen der Kieselgel- Matrix bei pH > 9

separieren. Dabei herrschen im wesentlichen zwei Retentionsmechanismen vor, und zwar einerseits Dispersionseffekte zwischen Analyt und mobiler Phase beziehungs- weise zwischen Analyt und Graphitoberfläche, so daß t_R mit zunehmender Hydropho- bizität steigt. Andererseits beobachtet man Induktionseffekte, wodurch sich die Affinität des Analyten zur Materialoberfläche proportional zu dessen Polarität verhält, in starker Abhängigkeit von deren Kontaktfläche sowie von Art und Anzahl funktioneller Gruppen relativ zur Graphitschicht. So ermöglicht Hypercarb^® unter anderem auch die effektive Trennung von hochpolaren Kohlenhydraten und konstitutionsisomeren Nucleosidphosphaten (vgl. Ross und Ax, 2000; Thermo ELECTRON CORPORATION, 2004).

Polare Säuren können auf silicamodifizierten RP-Phasen meist nur in stark sauren Eluenten mit hohem Wasseranteil retardiert werden, wobei die erreichte Selektivität in der Regel bescheiden bleibt. Alternativ setzt man Ionenpaarreagenzien zu oder weicht gleich auf andere Trenntechniken wie Anionenaustausch-Chromatographie oder Hy- drophile Interaktionschromatographie (HILIC) aus, welche zwar individuelle Vorteile bieten, aber die Universalität der RP-Chromatographie keinesfalls erreichen. Die soge- nannte „Mixed-Mode“-Chromatographie hingegen setzt auf die Kombination von RP und schwachem Anionenaustausch (WAX) in einem geeigneten Selektor, welcher bei- spielsweise aus einer hydrophoben Alkylkette mit eingebetteten Sulfid- und Amidgrup- pen (hydrophile Domänen) sowie einem Chinuclidinyl-Rest (zyklisches tertiäres Amin:

pK_a ≈ 9.9) besteht. Diese RP/WAX-Phasen lassen sich multimodal betreiben und zur Auftrennung von polyfunktionellen Analyten (Bsp.: Gibberellinsäure) vorzüglich einset- zen. Während in diesem Fall der pH-Wert in einem gepufferten hydro-organischen Elu- enten den WAX-Prozeß steuert, findet bei Verwendung von > 60 % (v/v) Acetonitril anstelle von Methanol ein Übergang von einem RP-artigen zu einem HILIC-artigen Re- tentionsmechanismus statt (vgl. Bicker et al., 2008: 218 f.).