Efeitos citotóxicos de anestesia local com lidocaína/ropivacaína em linhagens celulares de melanoma humano.

(1)

REVISTA

BRASILEIRA

DE

ANESTESIOLOGIA

PublicaçãoOficialdaSociedadeBrasileiradeAnestesiologia

www.sba.com.br

ARTIGO

CIENTÍFICO

Efeitos

citotóxicos

de

anestesia

local

com

lidocaína/ropivacaína

em

linhagens

celulares

de

melanoma

humano

Ding-Kun

Kang

∗

_,

_Li-Yan

_Zhao

_e

_Hong-Li

_Wang

LuoyangOrthopedic---TraumatologicalHospital,DepartmentofAnesthesiology,Luoyang,China

Recebidoem22defevereirode2015;aceitoem15deabrilde2015 DisponívelnaInternetem14desetembrode2016

PALAVRAS-CHAVE Lidocaína;

Ropivacaína; Citotoxicidade; Anestésicoslocaisdo grupoamino-amida; Linhagenscelulares demelanoma; Citometriadefluxo

Resumo

Justificativa:Osanestésicoslocais(ALs)sãogeralmenteconsideradoscomoseguros,mas cito-toxicidadefoirelatadaemváriosanestésicoslocaisusadosemsereshumanos,aqualnãoébem investigada.Nopresenteestudo,acitotoxicidadedelidocaínaeropivacaínaedacombinac¸ão delidocaínaeropivacaínafoiavaliadaemlinhagenscelularesdemelanomahumano.Melfalano, umagentealquilantedemostardanitrogenada,foiusadocomoumagentedecontroleparaa comparac¸ãodaatividadecitotóxica.

Métodos: Linhagens celulares de melanoma, A375 e Hs294T foram expostas por uma hora a concentrac¸ões diferentes dos agentes mencionados acima. A viabilidade celular após a exposic¸ãofoideterminadaporcitometriadefluxo.

Resultados: OsALs investigadosmostraram citotoxicidade prejudicial nas linhagens celula-res de melanoma estudadas dependente do tempo (p<0,001), da concentração (p<0,001) e do agente. Em ambas as linhagens de células A375 e Hs294T, níveis mínimos de viabilidade celular foram encontrados após 72 horas de exposição a esses agentes. Lido-caína a 2% provocou uma redução das células vitais para 10%±2% e 14%±2% em A375 e Hs294T, respectivamente, após 72 horas de exposição. Ropivacaína a 0,75% após 72 horasreduziu ascélulas viáveis para 15%±3% e25%±3%, em A375 eHs294T, respecti-vamente.Aviabilidadecelularmínimaapósexposiçãode72horasparaacombinaçãofoide 10%±2%e18%±2% emA375 eHs294T,respectivamente.A viabilidadecelularmínimaapós exposiçãode72horasaomelfalanofoide8%±1%e12±2,emA375eHs294T,respectivamente.

Conclusão:OsALstêmatividadecitotóxicaemlinhagensdecelularesdemelanomahumanode mododependentedotempo,daconcentrac¸ãoedoagente.Aapoptosenaslinhagenscelulares foimediadapormeiodaatividadedascaspases-3ecaspases-8.

∗_Autor_para_{correspondência.}

E-mail:kangdingkun63@gmail.com(D-K.Kang).

http://dx.doi.org/10.1016/j.bjan.2016.08.002

(2)

KEYWORDS Lidocaine; Ropivacaine; Cytotoxicity; Aminoamidelocal anesthetics;

Melanomacelllines; Flowcytometry

Cytotoxiceffectsoflocalanesthesiathroughlidocaine/ropivacaineonhuman

melanomacelllines

Abstract

Background: Localanesthetics(LAs)aregenerallyconsideredassafe,butcytotoxicityhasbeen reportedforseverallocalanestheticsusedinhumans,whichisnotwellinvestigated.Inthe presentstudy,thecytotoxicityoflidocaine,ropivacaineandthecombinationoflidocaineand ropivacaine were evaluated onhuman melanomacell lines.Melphalan, a nitrogenmustard alkylatingagent,wasusedasacontrolagentforcomparisonofcytotoxicactivity.

Methods:Melanomacelllines,A375andHs294T,wereexposedto1htodifferentconcentrations ofaboveagents.Cell-viabilityafterexposurewasdeterminedbyflowcytometry.

Results:Investigated LAsshoweddetrimentalcytotoxicity onstudiedmelanomacelllinesin time-(p<0.001),concentration-(p<0.001),andagentdependant. InbothA375andHs294T cell lines,minimum cellviability rateswere found after 72hof exposureto these agents. Lidocaine 2%causedareductionofvitalcellsto10%±2%and14%±2%inA375andHs294T, respectivelyafter72hofexposure.Ropivacaine0.75%after72hreducedviablecellsto15%± 3% and25%± 3%inA375andHs294T,respectively.Minimumcellviabilityafter72hexposuretothe combinationwas10%±2%and18%±2%inA375andHs294T,respectively.Minimumcellviability after72hexposuretomelphalanwas8%± 1%and12%± 2%,inA375andHs294T,respectively.

Conclusion: LAshavecytotoxicactivityonhumanmelanomacelllinesinatime-, concentration-and agent-dependant manner. Apoptosis inthe celllines was mediatedthrough activity of caspases-3andcaspases-8.

Introduc

¸ão

Pouco se sabe sobrea quimioterapia e os anestésicos em

geral. Em cenários perioperatórios e ambulatórios,

anes-tésicos locais são aplicados por via intra-articular.1 _Os

anestésicoslocaisdotipoaminoamidaexibemsuaatividade

principalmenteaobloquearaconduc¸ãodoimpulsode

axô-niosdonervodemodo reversível.Lidocaína eropivacaína

sãoanestésicoslocaisquepertencemàclassedas

aminoa-minas.Oprimeiroexibeatividadeantiarrítmica(classe-1b).

Em geral, osanestésicos locais (ALs) previnem oualiviam

a dor por meio de ligac¸ão a receptores em sítios

espe-cíficos dos canais de sódio (Na+₎ _nos _nervos _e _bloqueiam

amovimentac¸ão deíonsatravésdesses poros.As

proprie-dades clínicas de um AL sãodeterminadas tanto química

quanto farmacologicamente.2 _{Demonstrou-se} _que _os _ALs,

incluindolidocaína,aplicadostopicamenteforneceramum

bomcontroledadorempacientescomcânceroralouretal.

Lidocaínaeropivacaínasãoadministradasemconcentrac¸ões

de1,5%ou2%e0,5%ou0,75%,respectivamente,para

anes-tesiacirúrgica, comcardiotoxicidade e toxicidadeno SNC

reduzidas.1,3,4_Esses_ALs_são_amplamente_usados_no_controle

dadorempacientescomcâncerdecabec¸aepescoc¸opara

inibirmetástaseerecidivadetumoresereduziroestresse

cirúrgicoinduzidopelaatividadedascélulasNK(natural

kil-ler).Contudo,estudosinvitroeeminvivodemonstraram

citotoxicidadeem várias célulascultivadas.5,6 _Publicac_¸ões

anteriores relataram que a injec¸ão de uma dose única

de lidocaína a 1% pode ter atividade condrotóxica

signi-ficativa. A citotoxicidade de lidocaína em células-tronco

mesenquimais, em células orais e de tumores humanos e

células endoteliais dacórnea e fibroblastos dotendão do

manguito rotador foi relatada anteriormente.7---13

Ropiva-caína,umanestésicolocalaminoamidadeac¸ãoprolongada,

inibeo influxode íons de sódio reversivelmente e, dessa

forma, bloqueia a conduc¸ão do impulso nas fibras

ner-vosas. Relatou-se que ropivacaína demonstrou potencial

reduzido de toxicidade cardíaca e noCNS e que é usada

commaisfrequência em anestesia locale nomanejo das

doresdoparto edornopós-operatório.Alémdaatividade

anestésicalocal,relatou-setambémqueropivacaínainibiu

a agregac¸ão plaquetária e a atividade antibacteriana em

estudos in vitro. Também há relato da citotoxicidade de

ropivacaína em linhagens de célulasmesenquimais a uma

concentrac¸ão de 0,5%. A neurotoxicidade dos anestésicos

locais foi associada à apoptose.10,14---18 _Embora _os

anesté-sicos locais do tipo aminoamida sejam usados há muito

tempopara várias complicac¸ões, nãohá informac¸ão

ade-quada sobrea atividade citotóxica desses agentes, o que

requer estudo detalhado. A atividade citotóxica dos ALs

comumente usados em casos de melanoma ainda não foi

amplamenteestudada. Anossahipótese foique essesALs

aminoamidasregularmente usadostêm efeitos citotóxicos

emmelanomahumano,aformamaisletaldecâncerdepele,

deformaespecíficaparaoagente,otempoeadose.Neste

estudo,alémde avaliardiferentes concentrac¸õesdos ALs

mencionadosacima,investigamosacombinac¸ãodeambos

oscompostosparaavaliaropotencialcitotóxico.Oobjetivo

primáriodoestudo foiinvestigarseesses LAscomumente

usados têm efeitos citotóxicos em linhagens de células

de melanoma. Neste estudo, o efeito do pH dos ALs na

morte celularde linhagens de células demelanoma

tam-bémfoiavaliado.Otestedeatividadedascaspasesfoifeito

(3)

Melfalano, umagente mostarda alquilantenitrogenado, é

umquimioterápicoqueatuaporalquilac¸ãodeguaninados

nucleotídeosdeDNA.Relatou-sequemelfalanoécitotóxico

em várias linhagens celulares, incluindo demelanoma, e,

portanto,é usado como umagente padrãopara avaliaro

potencialcitotóxicoecomocomparador.19,20

Material

e

métodos

Material

Lidocaína, ropivacaína e melfalano (137-58-6; 98717-15-8

e 148-82-3, respectivamente) foramadquiridos da

Sigma--Aldrich,Alemanha.Todosessesmedicamentosereagentes

não tinham conservantes e foram dissolvidos em soluc¸ão

salinatamponada(pH7,0).Brometode

3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT) foi adquirido da Sigma

(SigmaChem.Ind.,St.Louis,MO,EUA).

Culturacelular

Células de melanoma maligno humano, linhagem A375,

foram adquiridas do Instituto de Biologia Celular,

Ins-tituto Xangai de Ciências Biológicas, Academia Chinesa

de Ciências, China. A linhagem celular foi cultivada em

meio de cultura Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM)

(LifeTechnologies,Carlsbad,CA,EUA).Alinhagemcelular

foi suplementada com 4mM de glutamina, o dipeptídeo

L-alanil-L-glutamina que impede a degradac¸ão e

acú-mulo de amônia em culturas tanto aderentes quanto de

suspensão, e soro fetal bovino a 5% (Life Technologies).

Célulasdemelanoma humano,linhagemHs294T,(Instituto

de Biologia Celular, China) foram cultivadas em meio de

cultura DMEM (Lonza, Basel, Suíc¸a) suplementado com

2mM glutamina (Life Technologies) e soro fetal bovino a

5%(Life Technologies). A linhagem celularde fibroblastos

dérmicoshumanosnormais(NHDF;Lonza)foicultivadaem

meiodeculturaMEM␣(Lonza),suplementadocom2mMde

glutamina(LifeTechnologies)esorofetalbovinoa10%(Life

Technologies).Ascélulasforamcultivadasatéaconfluência

etransferidasparaplacasdecultivode48poc¸os,48horas

antesdotratamentoexperimental.

Todososmeioscontinhamestreptomicina(0,1mg.mL---1_),

penicilina (100U.mL---1₎ _e _anfotericina _B _(0,25_g.mL---1₎

(Lonza).As célulasforamcultivadasa 37◦_C_em _atmosfera

húmidasaturadacom5%deCO2e95%dehumidaderelativa.

Análisedeapoptosecelularporcitometriadefluxo

Lidocaína e ropivacaína formam o grupo de ALs

aminoa-midas, mas diferem quanto à potência analgésica, início

de ac¸ão e durac¸ão da anestesia. Durante uma hora, as

células de melanoma foram expostas a 1mL de soluc¸ões

dos anestésicos locais com as seguintes concentrac¸ões:

0,03125%,0,0625%, 0,125%,0,25%, 0,5%,1%e 2% de

lido-caína;0,03125%,0,0625%,0,125%,0,25%,0,5%,e0,75%de

ropivacaína;melfalano(0,2%)e0,03125%,0,0625%,0,125%,

0,25%, 0,5% e 0,75% de uma combinac¸ão de

lidocaína--ropivacaína.Aconcentrac¸ãodoscompostostestadosvariou

de0,03125%a2%.Ascélulascontrolesforamtratadascom

sorofisiológiconormaldurante umahora.As soluc¸ões

tra-tadas que continham células demelanoma nãoaderentes

foram removidas e centrifugadas. Os sedimentos

celula-res formadosforamlavados em soluc¸ãosalina tamponada

e devolvidos aos respectivos poc¸os com meio de cultura.

Após 24 e 72horas, a viabilidadecelular foideterminada

por citometria de fluxo. Para determinar a influência do

pHsobreaslinhagensdecélulasdemelanomahumano,as

taxas de viabilidade foramanalisadas 24 e 72 horas após

uma hora de exposic¸ão à soluc¸ão salina com pH de 7,4;

7;6; 5e4.O seguinteprocedimentogeral foiusadopara

analisaraviabilidadedascélulasdemelanoma:ascélulas

A375(1×106_mL---1₎_foram_semeadas_em _placas_de_cultura,

deixadas a aderire colhidasapós tratamento com

ropiva-caínaelidocaínaecombinac¸ãodelidocaína-ropivacaínapor

24 horas. As célulascontrolesincluíram células coradase

células não tratadas (isto é, não tratadas com veículo).

Todo o processo foi feito em gelo. Em momentos

indivi-duais, o meio de cultura foi colhido, combinado com as

células em suspensão e centrifugadodurante 5minutos a

1.200rpmparaasseguraracoletadetodoomaterial

celu-lar.Ossedimentoscelularesforamsuspensosemtampãode

ligac¸ão(500␮L1×)aumadensidadedeaproximadamente

1×106_mL---1_._As_amostras_foram_incubadas_com_colorac_¸ão_de

AnexinaV-FITC(1_␮L)ePI(5_␮L)porexatamente5minem

temperaturaambientenoescuroeforamentãotransferidas

paratubosFACSde5mLeemseguidaamensurac¸ãofoifeita

comumcitômetroFACSCalibur(Becton Dickinson,EUA).A

fluorescênciadePI e V-FITCfoidetectada noscanais FL-1

(verde)eFL-2(vermelho),respectivamente,apóscorrec¸ão

paraasobreposic¸ãoespectralentreosdoiscanais. O

pro-grama CellQuest(Becton Dickinson,EUA)foi usadoparaa

análisedosdados.1

Ensaiodasatividadesdascaspases-3/8

Asatividadesdascaspases-3/8foramanalisadasem12,24e

72horasapósaexposic¸ãoaosanestésicoslocais,comouso

dekitsdeensaiocolorimétrico(KeygenCo.,China).As

célu-las(1×106_poc_¸o---1₎_foram_semeadas_em_placas_de_seis_poc_¸os

etratadascomdiferentesconcentrac¸õesdelidocaína,

ropi-vacaínaoumistura delidocaína eropivacaínae melfalano

por 12, 24 e 72 horas. A caspase-3 e a caspase-8

hidro-lisam o substrato peptídico(Ac-DEVD-PNA e Ac-IETD-PNA,

respectivamente),oquelevaàliberac¸ãodep-nitroanilida

(pNA).Aconcentrac¸ãodepNAécalculadadeacordocoma

absorbânciamedidaaumcomprimentodeondade405nme

curvadecalibrac¸ãocombasenassoluc¸ões-padrãodepNA.

Todososvaloresobtidosforamexpressosem pNA.mg---1 _de

proteínatotal.Além disso,todososvaloresobtidosforam

normalizadosparaaviabilidadedascélulascontroles.13

Análiseestatística

Cadaexperimentofoifeitoemtriplicadoeosdados

repre-sentativosforamregistrados.Anovasimplesfoiusadapara

medir os valores médios das comparac¸ões estatísticas.

A correlac¸ão das variáveis foi avaliada com análise de

correlac¸ãobivariada.Asdiferenc¸ascomp<0,05foram

(4)

120

A

B

100

80

60

40

20

0

0,250 0,125 0,0625 0,0325 Controle

Concentração de ropivacaína (%) Ropivacaína

Células viáveis (%) – 24 horas

120

100

80

60

40

20

0

0,750

0,500 Padrão Controle0,0325 0,0625 0,125 0,250

0,500 *

0,750 *

Padrão # #

#

*

Figura1 EfeitoderopivacaínasobreaviabilidadedascélulasA375demelanoma.Acurvadose-respostadacitotoxicidadede ropivacaínafoimensurada(A)24horase(B)72horasapósumahoradeexposiçãoacitometriadefluxo.(AeB)Concentrações deropivacaínaa0,50%e0,75%causaramumareduçãosignificativadaviabilidadecelularemcomparaçãocomocontrole(solução salina)eforamcomparáveiscomadoagentepadrão(melfalanoa0,5%)após24e72horas.Asbarrasrepresentamosvaloresmédios dosexperimentos,comoerropadrãocomobarrasdeerro(*_p_<_0,05;#_p_<_0,01).

foramdeterminadoscomtestesbicaudais.Aanálise

estatís-ticafoifeitacomoprogramaSPSS12.0.

Resultados

Análisedaviabilidadecelularcomouso decitometriadefluxo

Neste estudo, lidocaína, ropivacaína e a combinac¸ão

de lidocaína-ropivacaína apresentaram citotoxicidade

dependente da concentrac¸ão, do tempo e do agente em

células de melanoma humano (A375, Hs294T) e os

resul-tados obtidos foram comparáveis aos do melfalano, um

agente alquilante de mostarda nitrogenada, usado como

agente-padrãoparaacomparac¸ão(figs.1-6).

A exposic¸ão a concentrac¸ões elevadas de lidocaína e

ropivacaína resultou em reduc¸ão do número de células

viáveis observáveis. O tratamento com uma combinac¸ão

de lidocaína-ropivacaína a uma concentrac¸ão de 0,25% e

superiorcausouumdeclíniosignificativodecélulasviáveis

em ambasaslinhagens celulares A375 e Hs294T.A frac¸ão

120

A

B

100

80

60

40

20

0

Controle0,03250,0625 0,125 0,250

Concentração de lidocaína (%) Lidocaína

0,750 0,500

#

1,00 *

2,00 #

Padrão #

120

100

80

60

40

20

0

0,250 0,125 0,0625 0,0325 Controle

0,750 0,500

#

1,00 *

2,00 *

Padrão #

(5)

120

A

B

100

80

60

40

20

0

0,250 0,125 0,0625 0,0325 Controle

*

Concentração da combinação (%) (Lidocaína+Ropivacaína)

Lidocaína+Ropivacaína

0,500 #

0,750 *

Padrão #

120

100

80

60

40

20

0

0,250 0,125 0,0625 0,0325 Controle

#

0,500 *

0,750 *

Padrão #

Figura3 Efeitodacombinaçãodelidocaína-ropivacaínasobreaviabilidadedascélulasA375demelanoma.Astaxasdeviabilidade foramsignificativamentemenoresnacombinaçãodeconcentraçõesdelidocaínaeropivacaínasuperioresa0,25%eacimade24e 72horasapósotratamento.Asbarrasrepresentamosvaloresmédiosdosexperimentos,comoerropadrãocomobarrasdeerro (*_p_<_0,05;#_p_<_0,01;_controle,_soluc_¸ão_salina;_padrão,_melfalano_a_0,5%).

decélulasapoptóticas enecróticasaumentou.Viabilidade

mínima das células foi observada a uma concentrac¸ão

de 0,75% e as taxas de viabilidade a essa concentrac¸ão

foramde15%±2% (p<0,005)após24horas ede10%±2%

(p<0,005)após72horas,respectivamente(figs.3Ae3B).

Na linhagem de células A375, as concentrac¸ões de

ropi-vacaína a 0,50% e superiores causaram diminuic¸ões

significativasdaviabilidadeeaumentaram aapoptoseea

necrose,emcomparac¸ãocomasoluc¸ãosalina(controle)em

todososmomentosdeavaliac¸ãodoestudo(figs.1Ae1B).

Acitotoxicidadederopivacaínaaumentoudemodo

depen-dente da concentrac¸ão. Ropivacaína a 0,75% causou uma

reduc¸ão da viabilidade celular para 22%±3% (p<0,005)

após 24 horas e para 15%±3% (p <0,005) após 72 horas,

respectivamente.

Otratamentocomdiferentesconcentrac¸õesdelidocaína

tambémcausoudeclíniodaviabilidadecelulardalinhagem

A375 de formadependente da dose (fig. 2A e 2B).

Lido-caínaa0,75%esuperiorcausoureduc¸ãodecélulasvitaisda

linhagemA375easviabilidadesmínimasdascélulasforam

120

A

100

80

60

40

20

0

0,250 0,125 0,0625 0,0325 Controle

0,500 #

0,750 #

Padrão #

120

B

100

80

60

40

20

0

0,250 0,125 0,0625 0,0325 Controle

0,500 #

0,750 *

Padrão #

(6)

120

A

100

80

60

40

20

0,500 0,250 0,125 0,0625 0,0325 Controle

0,750 #

1,00 #

2,00 *

Padrão #

0

120

B

100

80

60

40

20

0,500 0,250 0,125 0,0625 0,0325 Controle

0,750 #

1,00 #

2,00 #

Padrão #

0

Figura5 EfeitosdalidocaínasobreaviabilidadedecélulasHs294Tdemelanoma.Otratamentocomconcentrac¸õesdelidocaína a0,75%esuperioresreduziudemodosignificativoaviabilidadeapós24e72horas.Asbarrasrepresentamosvaloresmédiosdos experimentos,comoerropadrãocomobarrasdeerro(*_p_<_0,05;#_p_<_0,01;_controle,_soluc_¸ão_salina;_padrão,_melfalano_a_0,5%).

de25%±2%(p<0,001)ede10%±2%(p<0,005)após24e

72horas,respectivamente.Melfalanofoiusadocomoagente

padrãoecausouumareduc¸ãodecélulasvitaispara10%±2%

(p<0,001)e8%±1%(p<0,001)após24e72horas,

respec-tivamente.

Resultados semelhantes foram obtidos em linhagens

celulares de melanoma Hs294T e confirmaram

adicional-mente o efeito citotóxico desses agentes em linhagens

celulares de melanoma (figs. 4-6). Neste estudo, a

linha-gem celular A375 foi maissensível aos anestésicos locais

emcomparac¸ãocomalinhagemcelularHs294T.Nalinhagem

celularHs294T,aexposic¸ãocomacombinac¸ãode

lidocaína--ropivacaínaa0,25%ousuperiorcausoucitotoxicidadeeas

taxasde viabilidademínima foramde 20%±2%(p<0,005)

e de 18%±2% (p<0,005) após 72 horas, respectivamente

(figs.6Ae6B).Otratamentocomconcentrac¸õescrescentes

delidocaínatambémdemonstroudeclíniodaviabilidadede

linhagenscelularesHs294T,deformadependentedadose.

Lidocaínaa0,75%esuperiorcausouumareduc¸ãodecélulas

vitaisda linhagemA375 e astaxas deviabilidade mínima

foramde23%±5%(p<0,005)ede14%±2%(p<0,001)após

24e72horas,respectivamente(figs.5Ae5B).

Aexposic¸ãoaoaumentodaconcentrac¸ãoderopivacaína

tambémcausou quedadaviabilidade celulardalinhagem

Hs294T. O tratamento com uma concentrac¸ão a 0,5% ou

superiorcausoureduc¸ãodecélulasvitaisdalinhagemeas

120

A

100

80

60

40

20

0

0,125 0,0625 0,0325 Controle

Concentração da combinação (%) (Lidocaína+Ropivacaína)

Concentração da combinação (%) (Lidocaína+Ropivacaína) Lidocaína+Ropivacaína

0,250 *

0,500 #

0,750 *

Padrão #

120

B

100

80

60

40

20

0

0,125 0,0625 0,0325 Controle

0,250 *

0,500 #

0,750 *

Padrão #

(7)

120

100

80

60

40

20

0

Dia 1

Células viáveis (%)

Dia 4 Efeito do pH sobre a viabilidade

da linhagem celular A375

Dia 7

120

100

80

60

40

20

0

Dia 1

pH 7,4 pH 7 pH 6 pH 5 pH 4

Células viáveis (%)

Dia 4

Efeito do pH sobre a viabilidade da linhagem c elular Hs294T

Dia 7

Figura7 EfeitosdopHsobreaviabilidadecelulardemelanoma.Aslinhagensdecélulas(A375eHs294T)nãoforamafetadasde formasignificativaapósumadeexposiçãoasoluçõessalinascompHde7,4;7;6;5e4após1,4e7dias,comcitometriadefluxo. Asproporçõesdecélulasviáveissãoexpressasemporcentagemdonúmerototaldecélulasnosdiferentesgruposdetratamento. Asbarrasrepresentamoerropadrãocomobarrasdeerro.

taxasdeviabilidademínima foramde32%±3%(p<0,001)

e de 25%±3% (p<0,005) após 24 e 72 horas,

respectiva-mente(fig.4Ae4B).Melfalano,agentecitotóxicopadrão,a

umaconcentrac¸ãode0,2%provocouumareduc¸ãodecélulas

vitaispara15%±2% (p<0,001)e para12%±2%(p<0,001)

após24e72horas,respectivamente.

EfeitodopHsobreacitotoxicidade

Aacidezdosanestésicoslocaispodeserumadascausasdo

efeitocitotóxico.Paraessaavaliac¸ão,asmesmaslinhagens

celulares foram tratadas com soluc¸ão salina com pH que

variouentre4e7,4.Aviabilidadedaslinhagens celulares

de melanoma (A375 e Hs294T) não foi afetada de forma

significativaapósumahoradeexposic¸ãoasoluc¸õessalinas

compHde4;5;6;7e7,4apósum,quatroesetediascom

ousodecitometriadefluxo.As proporc¸õesdeviabilidade

das células são mostradas como percentagem do número

total de células em diferentes grupos de tratamento

(figs.7Ae7B).

Análisedaatividadedascaspases-3/8

A apoptose é mediada por uma cascata de caspases ou

proteases específicas deaspartato de cisteína. Lidocaína,

ropivacaína e a combinac¸ão de lidocaína-ropivacaína

aumentaram de forma significativa a expressão das

cas-pases 3 e 8 ativadas de modo dependente do tempo na

linhagemcelularA375(figs.8Ae8B).Níveisdepicoforam

obtidosemtodososanestésicoslocaisimediatamenteapós

1,6

1,4

1,2

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

0 12 24

Tempo em horas Atividade da caspase-3

Atividade da caspase-3 (valor A)

72

1,6

1,4

1,2

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

0 12 24

Tempo em horas

Ropivacaína Lidocaína Lidocaína+Ropivacaína

Atividade da caspase-8

Atividade da caspase-8 (valor A)

72

(8)

12 horas. Em seus picos, todos os agentes apresentaram

níveis significativos maiores de gerac¸ão de caspase em

comparac¸ãocomogrupocontrole(p≤0,004).

Discussão

Os resultados do estudo sustentam a hipótese de que os

anestésicoslocaisaminoamidaavaliadostêmefeito

citotó-xicosobreaslinhagenscelularesdemelanomahumano.Os

anestésicos locais têmsido usados em anestesia dérmica,

raquianestesia, anestesia tópica e para aliviar a dor em

pacientescom câncer. Lidocaína e ropivacaínasão usadas

clinicamente em concentrac¸ão de 1,5% ou 2% e 0,5%

ou 0,75%, respectivamente, para anestesia cirúrgica.1,3

Relatou-se tambémque ropivacaína é menoscardiotóxica

e menos tóxica ao nervoso central do que lidocaína e

outros anestésicos locais comumente usados. De acordo

com um estudo farmacodinâmico de anestésicos locais,

ropivacaína tem um tempo de ac¸ão mais prolongado e

potência mais elevada, em comparac¸ão com lidocaína.

Alémdisso,ropivacaínatemumataxamaiorderecuperac¸ão

deparadacardíacaquedolidocaína.21_Contudo,_relatou-se

que lidocaína e ropivacaína têm atividade citotóxica.22

Estudos também relataram efeitos citotóxicos desses

anestésicoslocaisdeformadependentedadoseedotempo

sobre diferentes tipos de câncer.23---25 _Porém, _são _poucos

os estudos que avaliaram o efeito de lidocaína e

ropiva-caína,anestésicoslocaiscomumenteusados,emlinhagens

celulares de melanoma humano e isso nos impulsionou a

conduzir o presente estudo. Além disso, a avaliac¸ão da

combinac¸ãodedoisanestésicoslocaistambémfoifeitapara

investigaraac¸ão citotóxicasinergéticasobreaslinhagens

celulares demelanoma humano. Acombinac¸ãodamesma

classe deanestésicos locais, istoé, aminoamida, foi

des-providadequaisquerproblemascompatíveiseverificou-se

teratividadesinérgicaeoefeitocitotóxicodacombinac¸ão

foi comparável ao de melfalano. No entanto, no

pre-senteestudo,ropivacaínademonstrouatividadecitotóxica

quandocomparadacomsorofisiológiconormalemqualquer

concentrac¸ão,masfoimenoscitotóxicaquandocomparada

comlidocaína,acombinac¸ãoemelfalano.

Váriosestudosmostraramefeitoscitotóxicosde

diferen-tes concentrac¸ões de anestésicos locais após tempos de

exposic¸ão e de avaliac¸ão diferentes.7---13 _Em _comparac_¸ão

comumcenárioexperimentalidênticoemlinhagens

celula-resdecâncer,aslinhagenscelularesdemelanomahumano

forammaissensíveisaosanestésicoslocaisecausarammais

morte celular após tratamento com concentrac¸ões iguais

deanestésicoslocaisparaosmesmostemposdeexposic¸ão

edeavaliac¸ão.Apósa exposic¸ão aosanestésicoslocais, a

mortecelularimediatapodetersidocausadapornecrose,

enquantoaviabilidadedascélulasdiminuiudeforma

depen-dentedotempoaolongodeváriashoras.Estudospublicados

mostraramqueapermeabilidadeecitotoxicidadeda

mem-branaforammáximasquandoalipofilicidade,determinada

pelo coeficiente de partic¸ão octanol-água (logp), ficou

próximo de3.26,27 _Esse _achado _foi _{adicionalmente}

susten-tado por nosso trabalho no qual ropivacaína (logp=2,91)

e lidocaína(logp=2,56) mostraramefeitoscitotóxicos em

linhagens celulares de melanoma (A375 e Hs294T). Esse

resultadosugerequeacitotoxicidadedosanestésicoslocais

estámuitorelacionadacomapermeabilidadedesuas

mem-branas.

Aacidezdosanestésicoslocaispodeserumadascausas

dosefeitoscitotóxicoseparaavaliá-laasmesmaslinhagens

celularesforamtratadascomsoluc¸õessalinascompHque

variouentre4e7,4. Aavaliac¸ãodaviabilidadenão

apre-sentoudiferenc¸aem toda avariac¸ão de pH estudadae a

atividadecitotóxicadevidoàacidezdosanestésicoslocais

pôdeserexcluídanesteestudo(figs.7Ae7B).

A atividade das caspases foi avaliada para diferenciar

se apoptose ou necrose foi responsável pela atividade

citotóxica.13 _As _caspases _desempenham _um _papel

impor-tante na apoptose (morte celular programada), necrose

e inflamac¸ão. São amplamente classificadas pelo papel

que desempenham na apoptose (caspases 3, 6, 7, 8 e 9

em mamíferos) e na inflamac¸ão (caspases 1, 4, 5 e 12

em seres humanos). Além disso, as caspases envolvidas

na apoptosesão classificadas com base nomecanismo de

ac¸ão: caspases iniciadoras (caspases 8 e 9) e caspases

executoras (caspases 3, 6 e 7). Em célula apoptótica, a

caspase-3éativadaporviasextrínseca(ligandodemorte)

e intrínseca (mitocondrial).28,29 _Neste _estudo, _a _atividade

tanto da caspase-3 quanto da caspase-8 foi aumentada,

o que sugere o papel dessas caspases na regulac¸ão da

apoptose(figs.8Ae8B).

Neste estudo, o método foi desenhado para diminuir

emedir aproximadamentepossíveisdanoscelulares

iatro-gênicos com um cenário experimental em culturas de

monocamada. A exposic¸ão a anestésicos locais pode

pre-judicaraaderênciacelularaosdiscosdecultura.Portanto,

ascélulasnãoaderentesdoestudoforamlavadase

devol-vidas. O instrumento mais comumente usado para medir

aviabilidade celular é a citometria de fluxo e, portanto,

essefoioinstrumentousadoparaestimaraviabilidadecom

precisão.4,25,30

Os anestésicos locais aminoamida que usamos neste

estudo são amplamente usados para tratar irritac¸ão, dor

e prurido e são injetados como um anestésico

odon-tológico ou usados como anestésicos locais em cirurgia

de pequeno porte.31,32 _Os _anestésicos _locais _avaliados,

incluindo a combinac¸ão de lidocaína-ropivacaína, foram

maiscitotóxicos em concentrac¸ões mais elevadas do que

em concentrac¸ões menos elevadas. O estudo

investiga-tivo sugere que lidocaína, ropivacaína e combinac¸ão de

lidocaína-ropivacaína podem ser adicionalmente

investi-gadas para suas propriedades anticancerígenas para o

tratamentodepacientescommelanoma,vistoqueos

agen-tes quimioterápicos atualmente disponíveis têm efeitos

secundários devastadores.Descobrimos que acombinac¸ão

de lidocaína-ropivacaína, em particular, é tão citotóxica

como a de melfalano, umagente alquilantede mostarda

nitrogenada (10% vs. 8%, respectivamente; p<0,01). Os

anestésicos locais estudados podem ser adicionalmente

investigadosem combinac¸ão com outros agentes

antican-cerígenosououtrostiposdeanestésicoslocaisdeatividade

sinérgica sobre o melanoma e outroscânceres. Por outro

lado,combasenosresultadosdesteestudo,recomendamos

ousoembaixasconcentrac¸õesdosanestésicoslocaismenos

citotóxicoscomercialmentedisponíveis,comobupivacaína,

paraotratamentodedoenc¸asdapeleerelacionadasouo

usodeconcentrac¸õesdessesanestésicoslocaisdescobertas

(9)

Conclusão

A atividade citotóxica dos anestésicos locais aminoamida

investigados em linhagens celulares (A375 e Hs294T) de

melanomadependedaconcentrac¸ão,doagenteedotempo

de exposic¸ão. Dos anestésicos locais estudados,

ropiva-caínafoimenoscitotóxicaemcomparac¸ãocomlidocaínae

combinac¸ãodelidocaína-ropivacaína.Aapoptosenas

linha-genscelularesfoimediadaatravésdaatividadedacaspase-3

ecaspase-8.Aviabilidadecelularnãofoiafetadapelaacidez

dosanestésicoslocaisestudados.Esteestudotevealgumas

limitac¸ões.Apenasduas linhagenscelulares foram

investi-gadaseoestudofoiinvitro.Emboraoestudodêumaideia

daatividadecitotóxicadessesagentesemcenáriosinvitro,

paraconfirmaressaatividadeensaiosclínicosempopulac¸ão

humanasãonecessários.

Conflitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.

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