Influência da terapia celular mononuclear sobre a degeneração discal em coelhos.

(1)

SOCIEDADE BRASILEIRA DE ORTOPEDIA E TRAUMATOLOGIA

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Artigo

original

Influência

da

terapia

celular

mononuclear

sobre

a

degenerac¸ão

discal

em

coelhos

夽

Rodrigo

Caldonazzo

Fávaro,

André

de

Oliveira

Arruda,

Luiz

Roberto

Gomes

Vialle

e

Emiliano

Neves

Vialle

∗

PontifíciaUniversidadeCatólicadoParaná,HospitalUniversitárioCajuru,Servic¸odeOrtopediaeTraumatologia,Curitiba,PR,Brasil

informações

sobre

o

artigo

Históricodoartigo:

Recebidoem9defevereirode2016

Aceitoem18demarçode2016

On-lineem22dejunhode2016

Palavras-chave:

Colágeno

Discointervertebral

Terapiacelular

Histologia Coelho

r

e

s

u

m

o

Objetivo:Avaliarainfluênciadainjec¸ãodecélulas-troncomononuclearesautólogassobre

asalterac¸õeshistológicasdocolágenonoânulofibrosododiscointervertebralapóslesão

experimental.

Métodos:Foramsubmetidos32coelhosNewZealandapunc¸ãododiscosintervertebrais

lom-baresseguidadeinjec¸ãointradiscaldecélulasmononuclearesprovenientesdacristailíaca

versusinjec¸ãodesoluc¸ãosalinanosseguintesperíodostempo:doismesesapósalesão

(CT2MeSS2M),duassemanas(CT2SeSS2S),imediatamenteapósalesão(CTCPeSSCP)e

seminduziradegenerac¸ão(CTSPeSSSP).Apósdoismesesdaterapiacelular,osanimais

foramsubmetidosaeutanásiaeasalterac¸õesdocolágenonosdiscosintervertebraisforam

avaliadashistologicamente.

Resultados: Houvediferenc¸aestatisticamentesignificativanaCEAFentreosgruposCT2Se

SS2S(p=0,018).Essadiferenc¸adecorreudeumaumentodocolágenodotipoInogrupoSS2S

(56,7%)comparadocomoCT2S(13,28%).

Conclusão:Otratamentocomcélulasmononuclearesprecursorasmesenquimaisécapazde

reduzirasalterac¸õesnadistribuic¸ãodocolágenodotipoIeIIInoAFdediscosdegenerados

decoelhosatéduassemanasapósainduc¸ãodadegenerac¸ão.

Ltda.Este ´eumartigoOpenAccesssobumalicenc¸aCCBY-NC-ND(http://

creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Influence

of

mononuclear

cell

therapy

on

disc

degeneration

in

rabbits

Keywords:

Collagen

Intervertebraldisc

a

b

s

t

r

a

c

t

Objective:Theobjectiveofthisresearchwastoevaluatetheinfluenceofautologous

mono-nuclearstemcellsinjectionsonhistologicalchangesofcollageninthefibrousannulusof

theintervertebraldiscafterexperimentalinjury.

夽

TrabalhodesenvolvidonaPontifíciaUniversidadeCatólicadoParaná,HospitalUniversitárioCajuru,Servic¸odeOrtopediae

Trauma-tologia,Curitiba,PR,Brasil.

∗ _Autor_para_{correspondência}_.

E-mail:evialle@hotmail.com(E.N.Vialle).

http://dx.doi.org/10.1016/j.rbo.2016.03.007

(2)

Cellandtissue-basedtherapy Histology

Rabbit

Methods: 32NewZealandrabbitsweresubmittedtointervertebraldiscpuncture,followed

byintradiscalinjectionofmononuclearcellsfromtheiliaccrestversussalineinjectionin

thefollowingtimeperiods:twomonthsaftertheinjury(SC2MandSS2M),twoweeks(SC2W

andSS2W)immediatelyafterinjury(SCCPandSSCP),andwithoutinducingdegeneration

(SCSPandSSSP).Twomonthsaftercelltherapy,theanimalswereeuthanizedandcollagen

changesintheintervertebraldiscswerehistologicallyevaluated.

Results: There were significant differences in ELAF between SS2W and SS2S groups

(p=0.018).ThisdifferencewasduetoanincreaseintypeIcollageninSS2Wgroup(56.7%)

comparedtoSC2S(13.28%).

Conclusion: Treatmentwithmononuclearmesenchymalstemcellsreducedchangesinthe

typeIandIIIcollagendistributioninrabbitsAFdegenerateddiscsuptotwoweeksafterthe

inductionofdegeneration.

Ltda.ThisisanopenaccessarticleundertheCCBY-NC-NDlicense(http://

creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Introduc¸ão

A degenerac¸ão discal faz parte do processo de

envelheci-mentoecompreendeaperdadascaracterísticasestruturais,

biológicas e bioquímicas do disco intervertebral (DIV).1

Caracteriza-sepelaapresentac¸ãode célulasdisfuncionaise

um decréscimo dos seus componentes intracelulares, leva

à perda gradual de fluido intradiscal.2 _Isso _acarreta _uma

desidratac¸ão discal que inclui umacascata de fatores que

podemlevar asintomas e limitac¸ãofuncional. O principal

sintomadadegenerac¸ãodiscaléadorlombar.3

Aetiologiadadegenerac¸ãodiscal émultifatorial etanto

fatores ambientais quanto constitucionais exercem papéis

comvariáveisgrausdeimportância.4_Esforc¸o_físico,_má

pos-tura, obesidade, ocupac¸ão, cigarro, álcool e diabetes estão

envolvidos na etiologia da degenerac¸ão discal sintomática

(DDS).5

Adorlombaréasegundacausadeconsultamédicanos

EstadosUnidos. Emtodo omundo, cerca de 60 a80% das

pessoasterãodorlombarduranteavida.Segundodados

ame-ricanos,20bilhões dedólaresaoanosãogastosemcustos

diretosparatratamentodadorlombarcrônica;somadosàs

despesas indiretas, essevalor ultrapassaos 100bilhões de

dólares.6,7

A fim de amenizar esse quadro alarmante, diversas

estratégiasterapêuticastêmsido tentadas,incluindodesde

modalidadesnãoinvasivas–comomedicac¸ãoantinflamatória

efisioterapia–atéprocedimentoscirúrgicos,comoartrodese,

terapiaintradiscaleletrotérmicaesubstituic¸ãototaldodisco.

Entretanto,osmeiosterapêuticosatuaisdirecionam-seao

tra-tamentodossintomas,enãoàinterrupc¸ãoe/ourecuperac¸ão

do processo degenerativo.8 _Como _opc¸ões _de _aplicac¸ão _de

novastecnologias,diversosmodelosbiológicosdetratamento

têmsidopropostos.Pormeiodousodeelementoscelulares,

propõe-seaatuac¸ãodiretanamodulac¸ãodoprocesso

dege-nerativo,pormeiodaintroduc¸ãodecélulaspotencialmente

capazesdereconstruirotecidolesado.9

Apartirdeummodeloanimalpreviamenteestudadoe

vali-dadonessainstituic¸ãodeensino,10_o_objetivo_desta_pesquisa_é

avaliarainfluênciadainjec¸ãodecélulasmononucleares

autó-logassobreasalterac¸õeshistológicasdocolágenonoânulo

fibroso(AF)dodiscointervertebralapóslesãoexperimental.

Material

e

métodos

Os experimentos deste estudoforam feitosde acordocom

as normas e os princípios éticos do Colégio Brasileiro de

Experimentac¸ãoAnimal(Cobea).Osmétodosforambaseados

emestudospréviosfeitosnessainstituic¸ão10–12_e_nos

traba-lhosdeLipsoneMuir,13_Masuda_et_al.14_e_Rousseau_et_al.15

EstapesquisafoiaprovadapeloComitêdeÉticanoUsode

AnimaisdaPontifíciaUniversidadeCatólicadoParanásobo

n◦₃₇₇_e_foi_executado_de_acordo_com_as_normas_da_{Declarac¸ão}

deHelsinquedaAssociac¸ãoMédicaMundial.

Foram usados coelhos (Oryctolagus cuniculus), machos,

brancos,darac¸aNewZealand,entre2,5a3kg,comcercade

oitomesesdevida.

Apósoprocedimentoanestésicopadrão(10-12)oscoelhos

foramposicionadosemdecúbitolateraldireitoesubmetidos

aumalombotomiacomexposic¸ãodacolunalombarporvia

retroperitoneal(fig.1),expôs-seasuperfícieanteriorde5DIVs

lombaresconsecutivos(L2-L3aL6-L7).Ostrêsdiscos

experi-mentaisforampuncionadoscomagulha40X12mm(18G1

½

_),

emumaprofundidadede5mm,quepermaneceunointerior

doDIVpor5segundos(fig.2).

Figura1–Preparocirúrgico.

(3)

Tabela1–Distribuic¸ãodoscoelhosnosgruposinjetadoscomcélulas-tronco

Células-tronco

Grupo CT2M CT2S CTCP CTSP

Coelhos (n=14)

4 3 4 3

Discosintervenc¸ão (n=37)

12 9 7 9

Discoscontrole (n=60)

16 14 16 14

CT2M,injeçãodeCTapós2mesesdapunção;CT2S,injeçãodeCTapós2semanasdapunção;CTCP,injeçãodeCTnomesmomomentoda punção;CTSP,injeçãodeCTsempunção.

Figura2–Preparodaagulhaparaexecutarapunc¸ão. Delimitamosos5mmfinaisdeumade40x12mm

(18G1

½

₎_a_partir_de_seu_bisel_e_a_dobramos_no_formato_de_S

comointuitodepadronizaraprofundidadedaspunc¸ões.

Oprocessode isolamentoeobtençãodascélulastronco (CT)mononuclearesfoifeitopormeio dapunção-aspiração damedulaósseadacristailíacaefazpartedoprotocolo já desenvolvidoeconsolidadonessainstituiçãodeensino.16

Após coleta e isolamentodas células, elas foram

intro-duzidasno DIVdo animal com amesma técnica cirúrgica

anteriormente descrita. O material foi colocado no limite

superiordoDIVpreviamenteperfurado,com,noentanto,

agu-lhademenorcalibre13X4,5(26G

½

_)._Foram_feitos_exatamente

osmesmosprocedimentosnosanimaisquereceberamapenas

soluc¸ãosalina(SS)isotônica,injetou-seaquantidade

idên-ticaaodovolumecelular,obedeceu-seàsmesmascondic¸ões

citadas.

Foramusados32animaisdivididosemoitogrupos:quatro

gruposexperimentaisquereceberamcélulas-troncoequatro

gruposcontrolequereceberamsoluc¸ãosalina.

Osgruposforamdivididosdeacordocomoperíodoemque

ocorreuainjec¸ãodeCT:

- CT2M (quatro animais): transplante de células-tronco

mononuclearesautólogasapós doismeses dacirurgiade

induc¸ãodedegenerac¸ãodiscal;

- CT2S(quatroanimais):transplantedecélulas-tronco

mono-nucleares autólogas após duas semanas da cirurgia de

induc¸ãodedegenerac¸ãodiscal;

- CTCP(quatroanimais):transplantedecélulas-tronco

mono-nucleares autólogas imediatamente após a cirurgia de

induc¸ãodedegenerac¸ãodiscal.

Essa diferenciac¸ão periódica permitirá a análise crítica

comparativaquantoaoperíodomaisindicadodaimplantac¸ão

daterapiacelularfrenteaoprocessodegenerativo.

- CTSP(quatroanimais),grupoquerecebeuascélulas-tronco

mononucleares,masnãopassoupeloprocedimento

cirúr-gicodeinduc¸ãodedegenerac¸ãodiscal.

Damesmaforma,osanimaisquefizerampartedogrupo

controleforamsubdivididosdeacordocomopareamentoem

relaçãoaogrupoexperimentalereceberaminjeçãodesolução

salinaisotônica,da seguinteforma:SS2M(quatroanimais),

correspondenteaoCT2M;SS2S(quatroanimais),

correspon-denteàCT2S;SSCP(quatroanimais),correspondenteaCTCP

eSSSP(quatroanimais),correspondenteaCTSP.

Dos 32 coelhos, seis morreram durante o procedimento

cirúrgicoounopós-operatório.Assim,26coelhosforam

ana-lisadoshistologicamente,divididosconformeatabelas1e2.

Após oitosemanas da injec¸ão de material (CTs/soluc¸ão

salina isotônica)noDIV,oscoelhosforam sacrificadoscom

injec¸ão emdose excessivade pentobarbital (90mg/kg)e a

colunavertebralfoicoletadaparaanálisehistológica.

Apósoprocessamentodasamostrasobtidas,desidratadas

eencaixadasemblocosdeparafina,secc¸õesdeseismicrade

espessuraforamfeitas.Assecc¸õesforamcoradascomsirius

redparaaanálisedocolágeno.Atravésdomicroscópiocom

luz polarizada, foram observados os aspectos referentes à

disposic¸ãodecolágenonosDIVscomoaumentode20vezes.

De cada lâmina preparadacom umDIV, foram

fotogra-fadosseis camposdevisãopelosoftware DinoCapture®2.0

V1.2.7(AnMoElectronicsCorporation).Osseiscamposforam

pré-definidosparatodososdiscoseiniciamnacamadamais

periféricadaslamelasdoAF(fig.3).Essaconvenc¸ãopermite

umaamostrapanorâmicaeabrangentedaestruturadoAF.

As imagens foram processadas pelo software Image Pro

Plus®V.4.50 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD), que

permitequantificarospontosverdes(colágenotipoIII)e

ver-melhos dalamina (colágenodotipoI)eestratificá-loscom

suasrespectivaspercentagens(fig.4).

Resultados

No intuito de comparar os grupos e descobrir possíveis

diferenc¸as estatisticamente significantes entreeles,

avalia-mosindividualmentecadavariável:camadainternadoânulo

fibroso(CIAF);camadainternadoânulofibroso(CEAF)eânulo

fibroso(AF)comoumtodo.

Paracada variávelecadatipodecolágeno,emcadaum

(4)

Tabela2–Distribuic¸ãodoscoelhosnosgruposinjetadoscomsoluc¸ãosalina

Soluc¸ãosalina

Grupo SS2M SS2S SSCP SSSP

Coelhos (n=12)

3 2 4 3

Discosintervenc¸ão (n=35)

9 6 12 8

Discoscontrole (n=55)

15 10 17 13

SS2M,injeçãodesoluçãosalinaapós2mesesdapunção;SS2S,injeçãodesoluçãosalinaapós2semanasdapunção;SSCP,injeçãodesolução salinanomesmomomentodapunção;SSSP,injeçãodesoluçãosalinasempunção.

resultados de colágeno no grupo com aplicação de célula--tronco iguais aos resultados de colágeno no grupo com aplicaçãodesoluçãosalina.Nastabelas3-5sãoapresentadas

asestatísticasdescritivaseosvaloresdepdostestes

estatís-ticos.

QuandocomparamosaCIAFdosgruposinjetadoscomCT

comodosinjetadoscomSSnotamosquenãohouvediferenc¸a

estatisticamentesignificanteentreosgrupos(tabela3).

QuandocomparamosaCEAFdosgruposinjetadoscomCT

como dosinjetadoscom SSnotamosquehouvediferenc¸a

estatisticamente significante entre os grupos CT2S e SS2S

(p=0,018).Essadiferenc¸adecorreudeumaumentodo

colá-geno do tipo I no grupo SS2S (56,7%) comparado com o

CT2S (13,28%). Os valores de colágeno do tipo I e III e as

comparac¸ões dos grupos são demonstrados na tabela 4 e

figura5.

Quando comparamos o AF dos grupos injetados com

CT com o dos injetados com SS notamos que houve

diferenc¸aestatisticamentesignificanteentreosgruposCT2S

eSS2S(p=0,025).Novamenteessadiferenc¸adecorreudeum

aumentodocolágenodotipoInogrupoSS2S(76,1%)

compa-rado comoCT2S(53,32%).Osvaloresdecolágeno dotipoI

e III e as comparac¸ões dos grupos são demonstrados na

tabela5.

Discussão

A induc¸ão da degenerac¸ãodiscal foi estudadaa fundoem

outro brac¸o destalinha de pesquisa por meio de lâminas

coradas em hematoxicilina-eosina, fast-green e sirius red.10

No estudo em questão foram usadas lâminas obtidas da

Controle

Figura3–FerramentaDinoCapture.

(5)

CIAF

CEAF

Figura4–FerramentaImageProPlus.

Exemplodosoftwareafazeracontagemdepixelsemumafotografiadacamadainternadoânulofibroso(CIAF)edacamada externadoânulofibroso(CEAF).Sãotrêsinformac¸õesparacadaimagem:1–Onúmerodeobjetos;2–Aporcentagemde objetosocupadanaimageme3–Aporcentagemdaáreatotaldaimagem.

mesma espécie e populac¸ão de coelhos e a induc¸ão da

degenerac¸ão discal foi conduzida igualmente ao presente

estudo.Apadronizaçãodainduçãodadegeneraçãodiscalnos

coelhosdesteexperimentopormeio dométododepunc¸ão

comagulhafoi eficazereproduziu demaneirasemelhante

aos resultados de outros estudos que usaram a mesma

técnica.10,17–20

Grande parte dos estudos contemporâneos usa a

imuno-histoquímica para avaliar os diferentes tipos de

colágeno.1,21–23 _Como _podemos_notar, _os_precursores_nessa

Tabela3–Comparac¸ãoentreosgruposdefinidospelousodascélulas-troncoeosgruposdefinidospelousodasoluc¸ão salinanaCIAF

Variável Col Grupo n Média Mínimo Máximo DesvioPadrão Valordepa

CIAF I CT2M 12 73,37 2,39 98,65 29,18 0,286

SS2M 9 85,5 42,5 97,5 18,2

III CT2M 12 26,63 1,35 97,61 29,18 0,286

SS2M 9 14,5 2,5 57,5 18,2

I CT2S 9 93,36 88,93 98,33 3,28 0,157

SS2S 6 95,6 87,7 99,6 4,2

III CT2S 9 6,64 1,67 11,07 3,28 0,157

SS2S 6 4,4 0,4 12,3 4,2

I CTCP 7 96,61 92,56 99,56 2,40 0,800

SSCP 12 96,9 90,4 99,4 2,8

III CTCP 7 3,39 0,44 7,44 2,40 0,800

SSCP 12 3,1 0,6 9,6 2,8

I CTSP 9 91,16 78,09 98,52 6,07 0,149

SSSP 8 94,8 85,9 98,7 4,4

III CTSP 9 8,84 1,48 21,91 6,07 0,149

SSSP 8 5,2 1,3 14,1 4,4

Nota-sequenãohouvediferenc¸aestatisticamentesignificanteentreosgrupos.

Col,colágeno;CT2M,injeçãodeCTapós2mesesdapunção;CT2S,injeçãodeCTapós2semanasdapunção;CTCP,injeçãodeCTnomesmo momentodapunção;CTSP,injeçãodeCTsempunção;SS2M,injeçãodeSSapós2mesesdapunção;SS2S,injeçãodeSSapós2semanasda punção;SSCP,injeçãodeSSnomesmomomentodapunção;SSSP,injeçãodeSSsempunção.

(6)

Tabela4–Comparac¸ãoentreosgruposdefinidospelousodascélulas-troncoeosgruposdefinidospelousodasoluc¸ão salinanaCEAF

Variável Col Grupo N Média Mínimo Máximo DesvioPadrão Valordepa

CEAF I CT2M 12 25,85 1,24 68,87 19,58 0,201

SS2M 9 39,2 13,1 82,8 21,0

III CT2M 12 74,15 31,13 98,76 19,58 0,201

SS2M 9 60,8 17,2 86,9 21,0

I CT2S 9 13,28 2,72 20,99 6,55 0,018

SS2S 6 56,7 8,7 98,7 32,8

III CT2S 9 86,72 79,01 97,28 6,55 0,018

SS2S 6 43,3 1,3 91,3 32,8

I CTCP 7 14,91 6,38 29,11 8,16 0,063

SSCP 12 9,1 1,6 21,9 6,9

III CTCP 7 85,09 70,89 93,62 8,16 0,063

SSCP 12 90,9 78,1 98,5 6,9

I CTSP 9 12,05 2,29 36,52 10,54 0,773

SSSP 8 15,0 3,1 60,6 19,7

III CTSP 9 87,95 63,48 97,71 10,54 0,773

SSSP 8 85,0 39,4 96,9 19,7

Nota-sequehouvediferenc¸aestatisticamentesignificanteentreosgruposCT2SeSS2S(p=0,018).

a _Teste_não_paramétrico_de_{Kruskal-Wallis;}_p_<_0,05.

Tabela5–Comparac¸ãoentreosgruposdefinidospelousodascélulas-troncoeosgruposdefinidospelousodasoluc¸ão salinanoAF

Variável Col Grupo n Média Mínimo Máximo Desviopadrão Valordepa

Ânulofibroso comoumtodo

I CT2M 12 49,61 2,16 78,59 22,21 0,155

SS2M 9 62,3 27,8 88,9 16,1

III CT2M 12 50,39 21,41 97,84 22,21 0,155

SS2M 9 37,7 11,1 72,2 16,1

I CT2S 9 53,32 47,90 59,15 3,62 0,025

SS2S 6 76,1 48,2 97,4 17,5

III CT2S 9 46,68 40,85 52,10 3,62 0,025

SS2S 6 23,9 2,6 51,8 17,5

I CTCP 7 55,76 51,10 64,33 4,57 0,151

SSCP 12 53,0 48,6 60,7 3,5

III CTCP 7 44,24 35,67 48,90 4,57 0,151

SSCP 12 47,0 39,3 51,4 3,5

I CTSP 9 51,61 43,83 64,43 6,59 0,534

SSSP 8 54,9 45,5 79,5 11,1

III CTSP 9 48,39 35,57 56,17 6,59 0,564

SSSP 8 45,1 20,5 54,5 11,1

Nota-sequehouvediferenc¸aestatisticamentesignificanteentreosgruposCT2SeSS2S(p=0,025).

a _Teste_não_paramétrico_de_{Kruskal-Wallis;}_p_<_0,05.

área datam do fim dos anos 1990.1,21 _Essa _avaliac¸ão _tem

como principal vantagema suaespecificidade,no entanto,

emnossomeio,aindaéummétodocaro.Emnossoestudo,o

siriusredmostrou-seummétodosimplesebaratoparaavaliar

ocolágenodotipoIeIII.

Quantoaonúmerodecélulasinjetadosnotratamento,os

estudosatuaisnãoapresentamumpadrãodefinido.Alguns

sugeremqueocultivocelularéessencialparaosucessodo

tratamento, no entantoa maioria dosestudosnão discute

considerac¸õessobreonúmerocelularideal.Seriganoetal.22

indicaramqueadoseótimadecélulas-troncomesenquimais

(CTM)autólogasemcachorroséde1×106células.Noentanto,

Ghoshetal.23_sugerem_que_uma_dose_menor_de_0,1

×106pode

sermaiseficaz.Segundoosautores,umnúmeroexacerbado

decélulasnesseambientecombaixaofertanutricionalpode

levarascélulasacompetirpelosuplemento,oquepodeser

destrutivoparaoNPdevidoaoacúmulodecélulasmortase

produtosdedegradac¸ãocelular.23

Ainda nocultivocelular,aestimulac¸ãoda diferenciac¸ão

discogênica das CTMs também pode ser conseguida por

cocultura. As CTMspodemser cultivasdiretamentecom o

(7)

100%

90%

80%

70%

60%

50%

40%

30%

20%

Distr

ib

uição do colágeno em (%)

10%

0%

CT2M

p = 0,201 p = 0,018 p = 0,063 Grupos

p = 0,773 CT2S CTCP CTSP

SS2M SS2S SSCP SSSP

Col 3

Col 1

Figura5–Comparaçãopercentualdadistribuiçãodocolágenonacamadaexternadoânulofibroso(CEAF) entreosdiferentesgruposinjetadoscomcélulas-troncoecomsoluçãosalina.

Nota-sequehouvediferençaestatisticamentesignificanteentreosgruposCT2SeSS2S(p=0,018).Col1,colágenodotipo1; Col3,colágenodotipo3;CT2M,injeçãodeCTapós2mesesdapunção;CT2S,injeçãodeCTapós2semanasdapunção; CTCP,injeçãodeCTnomesmomomentodapunção;CTSP,injeçãodeCTsempunção.SS2M,injeçãodesoluçãosalinaapós 2mesesdapunção;SS2S,injeçãodesoluçãosalinaapós2semanasdapunção;SSCP,injeçãodesoluçãosalinanomesmo momentodapunção;SSSP,injeçãodesoluçãosalinasempunção.

derivadasdemedula ósseaecélulas doNP,foi visualizado

que elas se comunicam de uma maneira bidirecional que

resultaemumamelhorianofenótipodascélulasdoNPe

tam-bémnadiferenciac¸ão dascélulasCTM.24_Isso _sugere_que _a

implantac¸ãodasCTMs podeexercerefeitos parácrinos nas

células doNP degeneradas que residem no discoe ajudar

arestaurara func¸ãocelular discalnormal eoprocesso de

reparo.

Emnossotrabalhousamosascélulastronco

mononuclea-res.Levamosemconsiderac¸ãoofatodeseremobtidasapós

um processo mais simples do que as mesenquimais, pois

necessitamapenaspassarpordoisprocessosdecentrifugac¸ão

epelogradientededensidadeFicoll-Hypaque,aopassoqueas

CTMnecessitampassarporessesmesmosprocessoseapós,

ainda,pelaculturaeexpansãocelularporaproximadamente

14a16dias,apresentamassimcustosmaiselevadosecom

riscosmaioresdecontaminac¸ão.16

Ainjec¸ão de CTM ecélulas mononuclearesprecursoras

mesenquimais tipicamente é segura, ainda que tenha um

potencialparaformac¸ãodeosteófitosperiféricos,oquesugere

aimportânciadeumcarreador adequadoeseguroquando

injetamos células nessa região.25 _Nesse _sentido, _o

carrea-dorpodepermitiracélularecebercargasaxiais,importante

paraestimular asíntesede matrizextracelular einduzir a

diferenciac¸ãodasCTMsemoutroestímuloexógeno.26

Dife-rentescarreadorestêmsidousadosnaliteraturacomoalguns

hidrogéis26,27 _e _a _cola _de _fibrina.28 _Apesar _de _esses

estu-dosdefenderemousodeumcarreadorcelularnaaplicac¸ão

dascélulastronco,aliteraturaécontroversanessequesito.

Outrosestudosusamapenassorofisiológico29_ou,_até_mesmo,

nenhumcarreador.22_Em_nosso_estudo_usamos_o_meio_de

cul-turaMEMDcom20%desorobovinofetal,métodoquetambém

têmsidousadocomsucessonaliteratura.30

Naanálisedenossosresultados,aoexaminaroAFcomo

um todo, podemos notar uma diferenc¸a entre os grupos

que foram injetados dois meses após a punc¸ão. O CT2M

demonstrouumdiscretoaumentonocolágenodotipoIIIe

foidivididoem49,61%dotipoIe50,39%dotipoIII.OSS2M

demonstrou62,35%dotipo Ie37,65%dotipoIII. Podemos

observar que o grupo que recebeu as CT apresentou uma

divisãomaispróximadosgruposquenãoforaminduzidosa

degenerac¸ãodiscal,enquantoogrupodesoluc¸ãosalinateve

umaumentoexpressivonaproporc¸ãodocolágenodotipoI.

Essadesproporc¸ãodeu-senaCEAFeindicouumdesarranjo

naestruturadoAF.Noentanto,essadiferenc¸anãofoi

estatis-ticamentesignificante.

OmesmoaumentodocolágenodotipoInaCEAFenoAF

comoumtodopodeserobservadotambémnacomparac¸ão

dosgruposinjetadosduassemanasapósapunc¸ão.OCT2S

demonstrou 53,32% do tipo I e 46,68% do tipo III. O SS2S

demonstrou76,15%dotipoIe23,85%dotipoIII.Maisumavez

podemosobservarqueogrupoquerecebeuasCTapresentou

umadivisãomaispróximadosgruposquenãoforam

induzi-dosàdegenerac¸ãodiscal,enquantoogrupodesoluc¸ãosalina

teveumaumentoexpressivonaproporc¸ãodocolágenodotipo

1, novamenteàcusta da CEAF.Na análiseestatística

nota-mosquehouvediferenc¸aestatisticamentesignificantetanto

naCEAF(p=0,018)comonoAF(p=0,025).

NossosdadossugeremqueaterapiacomCT

mononucle-aresfoicapazderemodelarasalterac¸õescausadaspelalesão

causadapelapunc¸ãoporagulhaquandoasCTsãoinjetadas

apósduassemanas,masnãoobteveomesmoêxitoquando

injetadas após dois meses.Mesmo queos dados doCT2M

tenhamsidomaispróximosdosgruposquenãoforam

indu-zidos àdegenerac¸ãodiscal doque osdados doCT2S,essa

(8)

Noentanto,quandocomparamososgruposqueforam

inje-tadossimultaneamentecomapunc¸ão, oCTCPdemonstrou

55,76%dotipoIe44,24%dotipoIII.JáoSSCPdemonstrou53%

dotipoIe47%dotipoIII.Aquiencontra-seamaior

incompa-tibilidadederesultados,umavezqueeraesperadoqueoSSCP

demonstrassedegeneraçãocomumamudançanaproporção

entreocolágenonotipoIeodotipoIIIapósapunc¸ão.Isso

sugerequealesãocausadanosdiscosdoSSCPcicatrizou.

Aocompararos gruposinjetadossemapunc¸ão,oCTSP

demonstrou51,61 do tipo I e48,39% do tipo III. Enquanto

o SSSP demonstrou 54,9% do tipo I e 45,10% do tipo III.

Entreessesgruposnotamosquenãohouvegrandediferenc¸a,

comoera esperado,umavezqueelesnãoforam induzidos

àdegenerac¸ãopelapunc¸ão.Naanáliseestatísticanãohouve

diferenc¸aestatisticamentesignificanteentreosgrupos.Esses

dadosindicamqueasCTMnãoalteramaestruturado

colá-genoemdiscosinjetadossemdegenerac¸ãodiscal.

Conclusão

Otratamentocomcélulasmononuclearesprecursoras

mesen-quimaisécapazdereduzirasalterac¸õesnadistribuic¸ãodo

colágenodotipoIeIIInoAFdediscosdegeneradosdecoelhos

atéduassemanasapósainduc¸ãodadegenerac¸ão.

Conflitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresses.

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f

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c

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s

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