Análise da Diversidade do CDR3 do TRB em Células T CD4 + e T CD8 +

Foi analisada a diversidade da região determinante da complementaridade (CDR3) da cadeia β do TCR (TCRB). Desta forma, é possível apreciar qualitativamente o repertório estrutural dos linfócitos T CD4+ _{e CD8}+ _{avaliando a ausência e/ou a} expansão de populações celulares clonotípicas, [309].

A metodologia usada implica a amplificação por PCR dos segmentos TRVB-TRCB com oligonucleótidos específicos para cada uma das famílias TRVB, a partir do cDNA derivado de RNA isolado de células T. O produto de amplificação é um segmento de DNA que contém os rearranjos VDJ do CDR3 expressos pelas células T. O produto desta reação é submetido a uma reação de extensão com um oligonucleótido comum, marcado com o fluorocromo fluoresceína (FAM). Os fragmentos de DNA resultantes dessa reação são separados por eletroforese capilar (CE). Da análise dos electroferogramas é possível calcular o tamanho (em pares de bases) dos diferentes fragmentos (picos) de CDR3, o número de picos de CDR3 analisar a clonalidade e distribuição (gaussiana ou não-gaussiana) dos picos na região CDR3, parâmetros que constituem a análise conhecida como spectratyping [309].

Tabela 7 – Sequências dos oligonucleótidos usados para a análise da diversidade do repertório TRB.

Família VB Sequências _{Alelos TRVB* Refs.}

VB1 CCG CAC AAC AGT TCC CTG ACT TGC TRBV9*01/02/3 [310]

VB2 GGC CAC ATA CGA GCA AGG CGT CGA TRBV20-1*03/04/05/06/07 [310]

VB3 CGC TTC TCC CTG ATT CTG GAG TCC TRBV28*01 [310]

VB4 TTC CCA TCA GCC GCC CAA ACC TAA TRBV29-1*01/02/03 [310]

VB5 AGC TCT GAG CTG AAT GTG AAC GCC TRBV5-5*03, 5-6*01, 5-7*01, 5-_8*01/02 [310]

VB6 CTC TGA AGA TCC AGC GCA CA(C/G) AGC TRBV7-8*01/03, 7-3*02/03/04/05, _7-4*01 **

VB7 CCT GAA TGC CCC AAC AGC TCT CTC TRBV4-1*01/02 [310]

VB8 CCA TGA TGC GGG GAC TGG AGT TGC TRBV12-3*01,12-4*01/2 [310]

VB9 CCT AAA TCT CCA GAC AAA GC TRBV3-1*01/02 [311]

VB11 TGC CAG GCC CTC ACA TAC CTC TCA TRBV25-1*01 [310]

VB12 AAA GGA GAA GTC TCA GAT TRBV10-1*02, 10-3*01/02/03/04 [312]

VB13 CAC TGC AGT GT(A/G) CCC AGG ATA TGA TRBV6-6*01/04/05, 6-8*01, 6-9*01 **

VB14 GGG CTG GGC TTA AGG CAG ATC TAC TRBV27*01 [310]

VB15 CAG GCA CAG GCT AAA TTC TCC CTG TRBV24-1*01 [310]

VB16 GCC TGC AGA ACT GGA GGA TTC TGG TRBV14*01/02 [310]

VB17 TCC TCT CAC TGT GAC ATC GGC CCA TRBV19*01/02/03 [313]

VB18 CTG CTG AAT TTC CCA AAG AGG GCC TRBV18*01 [313]

VB20 AGC TCT GAG GTG CCC CAG AAT CTC TRBV30*01/02/04/05 [312]

VB21 TCC AGC CTG CAA AGC TTG (A/G)G(A/G) _ACT TRBV11-1*01, _{2*01/02/03, 11-3*01/02/03} TRBV11- **

VB22 AAA GAG GGA AAC AGC CAC TCT G TRBV13*01/02 [314]

VB23 CGC TGT GTC CCC ATC TCT AAT C TRBV2*01/02/03 [314]

VB24 CAG TGA CCC TGA GTT GTT CTC A TRBV15*01/02/03 [314]

CB1 CGG GCT GCT CCT TGA GGG GCT GCG [310]

CB2 FAM-CAC AGC GAC CTC GGG TGG G [313]

*A homologia das sequências nucleotídicas dos primers foi revista com a ferramenta IMGT/V-Quest

(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/) [315, 316] de forma a identificar os alelos TRVB amplificados.

**Os primers VB6, VB13 e VB21 foram modificados de forma a apresentarem homologia completa com todos os alelos de cada uma destas famílias TRVB.

Para cada amostra foram preparadas 22 reações de PCR, cada uma combinando 0.3 mM de um primer com homologia específica para os alelos de cada uma das famílias de segmentos TRVB funcionais (VB1 a VB24) com 0.3 mM de um primer CB1 localizado no segmento constante do gene (as sequências e especificidades dos primers estão listados na tabela 7). A cada uma das reações foi adicionado 0.5 µl de

cDNA isolado das frações celulares enriquecidas e depletadas de células T CD4+ (que a partir de agora, no contexto da análise do CDR3 do TRB serão denominadas de fração T CD4+ e T CD8+). Os restantes componentes para cada reação de PCR foram, 1x tampão de PCR (Invitrogen), 1.5 mM MgCl2 e 200 uM DNTP’s (Promega, Madison, WI) e 2 UI de Taq Platinum (Invitrogen) num volume de reação total de 25 µl. O perfil térmico do PCR consistiu em 95ºC por 5 min., 40 ciclos de 95ºC por 15 seg., 60ºC por 30 seg. e 72ºC por 1 min. e finalmente uma extensão final de 72ºC por 30 min. num termociclador GeneAmp 9700.

As reações de extensão usaram 0.2 µM do oligonucleótido CB2 marcado com FAM, 3 µl de cada um dos 22 produtos amplificados, 0.5 x de tampão de PCR, 0.75 mM de MgCl2, 100 uM DNTP’s e 1 UI de Taq Platinum, num volume final de 10 µl. O ‘run-off’ foi feito com o seguinte perfil térmico, 95ºC 2min., 10 ciclos de 95ºC por 15 seg., 55ºC por 30 seg. e 72ºC por 30 min. e finalmente uma extensão final de 72ºC por 30 min. num termociclador GeneAmp 9700.

Os produtos fluorescentes obtidos foram preparados para a eletroforese capilar (CE) que usou 3 µl de cada reação, 5 µl de formamida desionizada (Applied Biosystems) e 0.2 µl do marcador de migração e dimensão dos fragmentos GeneScan 500 ROX (Applied Biosystems) desnaturados por 3 min. a 95ºC e incubados 5 min. no gelo. Os fragmentos de DNA foram injetados em condições ‘standard’ num sistema de CE ABI 3130XL Genetics Analyzer (Applied Biosystems) usando o polímero de separação POP7 (Applied Biosystems). Os electroferogramas obtidos foram analisados no software de análise de fragmentos GeneMapper 4.0 (Applied Biosystems) para a aquisição dos parâmetros da análise de spectratyping.

O spectratype de cada família TRVB foi classificado em relação aos seguintes fatores: - número de picos que se contíguos têm de estar espaçados 3 bases

- forma da distribuição Gaussiana ou não

- ausência de picos intermédios ou na distribuição de fragmentos

- frequência de cada pico de CDR3 de cada família TRVB calculada como: %VBn = (área pico VBn/ Σárea todos VB) X 100

- frequência total de cada família VB calculada como: %VB total = (Σárea todos picos VBn/ Σárea todos VB) X 100

Com base nestes parâmetros, foi adotada uma classificação qualitativa do perfil de distribuição das dimensões do CDR3 das várias famílias de segmentos TRVB; adaptando as metodologias de referências anteriores [309, 317-319]. Esta

classificação exposta na tabela 8, é indicativa da diversidade e complexidade do repertório clonotípico T CD4+ _{e T CD8}+ _{circulante, dos doentes no pós-transplante.}

Tabela 8 – Classificação dos ‘spectratypes’ obtidos para as várias famílias TRVB

Classificação Perfil Formato do Spectratype

PG Policlonal Gaussiano 6-10 picos separados de 3bp com picos dominantes ao centro da distribuição

PS Policlonal Distorcida 5 picos ou mais de 3 ausências de picos internos ou 1 pico superior a 40% da área total

PSS Policlonal Severamente Distorcida

5 picos ou mais com 1 ou 2 picos superiores a 75% da área total

OL Oligoclonal 2 a 4 picos

M Monoclonal 1 pico ou 1 pico ≥ 90% da área total

NE Não expresso