Os Loci do TCR, a Organização e Geração da Diversidade Estrutural

O TCR é um recetor heterodimérico de duas cadeias polipeptídicas ligadas por uma ponte dissulfídica, expresso especificamente pelos linfócitos T. As células T CD4+ e CD8+ expressam um TCR muito variável, constituído por uma cadeia a associada a uma β. Uma população minoritária de linfócitos T expressa um TCR menos variável, composto por uma cadeia γ e uma δ. Estas proteínas são o produto da expressão de 4 locus genéticos presentes em dois cromossomas. As cadeias a e δ são codificados pelos genes TRA e TRD localizados no cromossoma 14, em 14q11.2. A cadeia β é codificada pelo gene TRB localizado em 7q35 enquanto a γ é um produto do gene TRG presente no outro braço do cromossoma 7, em 7p15-p14 [214]. À semelhança dos genes que codificam as Igs, estes genes são constituídos por grupos de segmentos V(D)J separados no DNA germinal e portanto não funcionais [215].

O locus TRB prolonga-se por 620 kb e o repertório potencial é constituído por 40-48 segmentos TRBV associáveis por homologia em 23 famílias ou grupos TRBV1 a TRBV24 (o TRBV10 é um pseudogene). Com a exceção do segmento TRVB30 que está em orientação inversa e a jusante do grupo TRBC2, que, portanto, encerra em 3’ o locus TRB, todos os outros grupos estão a montante 5’ no sentido centromérico de um cluster D-J-C duplicado (Figura 12). A primeira parte do cluster contém seis grupos TRBJ, um TRBD e um TRBC1, a segunda parte contém oito TRBJ, um TRBD e um TRBC2. Todos estes grupos contribuem para formar o repertório da cadeia β do TCR [214, 216].

Durante o desenvolvimento tímico, os segmentos V(D)J que constituem os diferentes genes são reunidos num processo de junção somática combinatória (Figura 11). Os mecanismos moleculares de recombinação com deleção das sequências intermédias de DNA, mediados pelas RAGs e a junção de cadeias por NEHJ, tal como descrito na recombinação dos genes das Igs, são usados para formar os genes funcionais do TCR. Assim como no rearranjo IGH, também nos 4 loci TCRs, é adicionada diversidade genética adicional juncional, através da adição de P-nucleótidos e N- nucleótidos. Existe uma ordem cronológica para o rearranjo dos vários genes que codificam as cadeias do TCR, que é estabelecida pela regulação do acesso das RAG às várias sequências dos genes, por fatores do complexo E. O primeiro rearranjo é feito pelo locus TRD, seguido do TRG, se estes falham, as células procedem ao rearranjo TRB e por último do TRA [216].

Figura 11 – Organização genómica dos loci TRA, TRD e TRB e rearranjos somáticos combinatórios V(D)J para a expressão do TCRaβ .

No genoma germinal o locus TRB é constituído pelos grupos de elementos segmentares TRBV, TRBD, TRBJ e TRBC. A formação do gene funcional envolve uma recombinação iniciada sobre as sequencias RSS localizadas em 5´ de um segmento J e em 3’ de um D seguida do rearranjo com um segmento TRVB fazendo a junção VB-DJB que codifica os domínios variáveis da cadeia β do TCR. O gene TRB contém dois segmentos constantes C semelhantes constituídos por vários elementos conservados de ancoragem da cadeia e processamento de sinal. No locus TRA estão inclusos os elementos do locus TRD. As células comprometidas à linhagem T aβ fizeram anteriormente uma recombinação VDJ não produtiva dos alelos TRD, para a formação do alelo TRA fazem uma deleção completa dos genes TRD fazendo um rearranjo combinando as sequências δRec-ψJa. O fragmento de DNA excisado forma um circulo que contém sinal de excisão e é denominado de sjTREC, No DNA somático fica o sinal de codificação δRec-ψJa que é excisado para formar o rearranjo VA-JA como um segundo circulo denominado de cjTREC. As sequências resultantes são transcritas e processadas formando um RNAm maturo, que retira sequências intrónicas e coloca na grelha de leitura o segmento constante C, que codifica a região de reconhecimento dos coreceptores CD4 e CD8 e as regiões de ancoragem. L, sequencia líder; V, segmentos variáveis; D, segmentos de diversidade; J, segmentos de junção; C, região constante; H, sequência de conexão; Tm, região transmembranar; CT, região transmembranar; sj, sinal de junção; cj, junção codificante; TREC, círculo de excisão do recetor de células T. (Figura adaptada de Kuby, Immunology 5th Edition, 2012, complementada com informação de Van Zelm M. et al, 2011 [176])

O rearranjo combinatório V-J do gene TRA resulta na deleção dos genes TRD e envolve dois passos. No primeiro passo é realizado o rearranjo das sequências δRec e ψJα localizadas a montante e jusante do locus TRD. O resultado é um circulo de DNA excisado que contém as sequências de sinalização da junção denominado sjTREC (signal joint T cell recetor excision circle) e uma sequencia de codificação no

DNA$germinal:$Locus$TRA/D,$14q11.2$$ DNA$germinal:$Locus$TRB;$7q35$$ TCR$(heterodímero$αβ)$ Locus$TRA:$$ 1º$Deleção$locus$TRD$ 2º$Rearranjo$VOJ$do$locus$TRA$ Locus$TRB:$ 1º$Rearranjo$DOJ$ 2º$Rearranjo$VODJ L$VA1 L$VAn L$$VD DD JD CD 5' 3' L$VD3 JA CA CA L$VA1 L$VA2 L$VA JA JAn 5' 3' CDR3 L C H Tm CT (VJC)α (VDJC)β CDR3 JB JB DB L$VB1 L$VBn CB1 DB2 JB CB2 L$VB30 L$VB30 L$VB1 L$(VDJ)B CB1 DB2 _CB2 C H Tm CT DD JD CD sjTREC cjTREC V 5' 5' 5' 5' 3' 3' 3' 3' Transcrição$ Processamento$RNAm$ Tradução ψJα δRec J L$$VA/VD

DNA somático δRec-ψJα (Figura 12). O circulo de DNA formado neste rearranjo é normalmente quantificado nas células circulantes, como um marcador de células Taβ que fizeram a educação tímica [217, 218]. A segunda recombinação faz a junção combinatória VA-JA e produz um segundo circulo de DNA, contendo agora, a sequência de codificação δRecψJα (cjTREC).

Para a síntese da cadeia β é necessário o rearranjo combinatório VDJ do locus TRB, que é feito em dois passos consecutivos. O primeiro faz a junção de um segmento DB a um JB, o segundo junta um segmento variável VB ao rearranjo parcial DJB. O gene rearranjado é transcrito com um elemento C localizada a jusante como um pre-RNA mensageiro. Este transcrito primário é processado, de forma a originar um RNAm maturo traduzido como a cadeia polipeptídica β (Figura 12).

A região variável do TCR é constituída pelos domínios CDR1 e CDR2 codificados pelo segmento V que fazem o reconhecimento molecular das moléculas HLA. Um terceiro domínio CDR3 é codificado pelas sequências resultante da junção VJA e VDJB, é extremamente variável e faz a interação com o péptido Ag apresentado pela molécula HLA [216]. A análise da diversidade do CDR3 em termos de dimensão é um método de avaliar a diversidade do repertório TCR nas células T circulantes [219].

Os locus genéticos que codificam o TCR são sujeitos a exclusão alélica, o que implica que cada célula que fez o desenvolvimento tímico, expressa uma forma única do TCR. Durante o processo de ativação mediado por Ags ou outros é promovida a proliferação celular, o que expande o repertório clonotípico das células T [216].