Os Rearranjos Somático dos Genes IGH, IGK e IGL

Na ontogenia das células B, verifica-se desde o início o rearranjo ordenado dos loci IGH, IGK e IGL que codificam as cadeias pesadas e leves das Igs (Figura 10). Estes genes, em contraste com os outros genes clássicos, não possuem um primeiro exão codificante funcional. Possuem múltiplos elementos no DNA germinal organizados como grupos de segmentos variáveis (V), de diversidade (D) (presente só no gene IGH), de junção (J) e uma região constante (C).

No genoma germinal, o locus IGH localizado na extremidade telomérica do cromossoma 14, na banda 14q32.3, é constituído por 76-84 sequências segmentares funcionais organizadas nos grupos V,D,J e C que definem a diversidade potencial da região variável da cadeia pesada e constituem repertório IGH. O grupo IGHV é constituído por 38-46 segmentos que por homologia (75% de nucleótidos homólogos) são organizados em seis famílias ou subgrupos IGHV1- IGHV6, o grupo IGHD é constituído 23 segmentos e o grupo IGHJ por 6 segmentos [163]. Os grupos IGHC são 9 (IGHM, IGHD, IGHG1-4, IGHA1-2 e IGHE), ocupam uma região mais centromérica em relação aos outros, e codificam as regiões constantes da cadeia pesada das diferentes classes Ig - IgM,D,G, A e E [164].

Figura 10 – Representação esquemática da organização genómica e do rearranjo somático dos loci IGH, IGK e IGL.

No genoma germinal o locus IGH é constituído pelos grupos de elementos segmentares VDJ e C. A formação de um gene funcional envolve uma recombinação ordenada J-DH seguida de VH- JDH pela seleção de um segmento de cada grupo e excisão do DNA somático dos segmentos não usados. Esta parte do gene codifica a região variável da IGH. A região constante é codificada pelo grupo IGHC. Células B imaturas e naives usam obrigatoriamente o IGHM ou IGHD para formar o BCR, células B maturas que fizeram as reações nos centros germinativos têm a capacidade de selecionar os segmentos constantes para as outras classes de Igs. O RNA mensageiro maturo IGH é constituído pela associação destes elementos incluindo uma sequência líder que possibilita a transcrição e a condução do péptido ao reticulo endoplasmático. Os locus da cadeia pesada IGK e IGL fazem uma recombinação ordenada primeiro dos alelos IGK e depois em caso de falha deste dos alelos IGL selecionando um segmento V e J dos respetivos grupos. A transcrição e tradução origina a cadeia leve que é associada à cadeia pesada formando as Igs expressas como BCR ou Acs. (Figura adaptada de Giudicelli V. et al, 2012 [165]) Rearranjos)Somá-cos)do)DNA Transcrição Tradução VH JH DH IGHC(M,D,G,E)A) Vκ/λ Dκ/λ C (VDJ)H C (VFJ)κ/λ C (LFVFDFJFC)H (LFVFJFC)κ/λ Imunoglobulina)ou)An-corpo Cadeia)Leve) IgL Cadeia) Pesada)IgH DNA) Germinal Rearranjo) DNA mRNA 5' 5' 5' 5' 5' 5' 3' 3' 3' 3' 3' 3' Locus)IGH:)14q32.3 Locus)IGK:)2p11.2)) Locus)IGL:'22q11.2)

Um primeiro exão funcional do gene IGH é estabelecido através da junção de um segmento VH, de um DH e de um JH [166]. Este processo é iniciado em ambos os genes IGH das células precursoras prepro-B, que através da atividade recombinase mediada pelas RAG, faz a junção de um segmento JH com um DH resultando uma sequência JDH [167]. O rearranjo completo VH-DJH é iniciado nas células pré-B, é iniciado num alelo e se não resultar um gene funcional, isto é, uma sequência com uma grelha de leitura, o outro alelo faz então a mesma recombinação [168, 169]. A formação de um exão VDJH leva à transcrição de um RNA processado de forma a ficar com o segmento IGHM (figura 10)

Da tradução, resulta uma cadeia pesada IGHμ expressa como pre-BCR. Tal como já referido, o pre-BCR sinaliza o sucesso da recombinação do gene da cadeia pesada Ig pela célula e induz o rearranjo de um gene da cadeia leve.

Os loci das cadeias leves IGK e IGL, fazem um rearranjo V-J para formar o primeiro exão do gene funcional que codifica a região variável da cadeia leve IGLs (Figura 11). O locus IGK está mapeado em 2p11.2, o grupo Vκ contém 76 segmentos e o grupo Jκ 5 segmentos, que podem ser usados para formar um exão VJκ. O locus IGL está localizado em 22q11.2, possui 56 segmentos Vλ e três clusters J-C funcionais usados para formar os rearranjos Vλ-Jλ [170]. O processo, tal como o da cadeia pesada, é ordenado e sujeito a uma intensa regulação por fatores regulam a acessibilidade das moléculas de recombinação às sequências de DNA destes genes [171]. Primeiro o rearranjo é feito num alelo IGK, se este se revelar não funcional é induzida a recombinação do segundo alelo. A recombinação dos alelos IGL é induzida se todas as possibilidades de formar um gene IGK funcional falharem.

A formação de um alelo produtivo da cadeia leve conduz à expressão de IgL que associadas às IgH formam o BCR das células B imaturas. Tal como já referido, as células que apresentam um BCR autoreativo entram em apoptose, anergia ou se lhe for possível, procedem a uma edição do BCR através de um novo rearranjo somático. As células que têm possibilidade de fazer um novo rearranjo primeiro têm de apagar do genoma o alelo que codifica a proteína autoreativa. Este mecanismo é feito sobre os alelos IGK através de dois tipos de recombinações. O primeiro é feito fazendo um rearranjo do VJκ formado até ao elemento de deleção Kappa (Kde) localizado a jusante, silenciando definitivamente o alelo ao eliminar o elemento Cκ. A segunda forma, elimina também este elemento, mas fazendo um rearranjo desde uma sequência sinalizadora de recombinação (RSS, Recombination Signal Sequence) intrónica próxima do Cκ até ao elemento Kde [172].

Durante os rearranjos são induzidas quebras na cadeia dupla de DNA pelo heterocomplexo dimérico RAG1/2 que reconhecem as sequências nucleotídicas RSS

[173]. As RSS são sequências de 7 e 9 pares de nucleótidos (heptâmero e nonâmero, respetivamente) altamente conservados e localizados em 3’ de cada segmento V, 5’ de cada segmento J e em ambos os flancos de cada segmento D. Uma sequência espaçadora de 12 ou 23 pares de bases não conservadas separam o heptâmero do nonâmero. Os segmentos dos genes a combinar, um apresenta um RSS com um espaçador de 12 bases, o outro é flanqueado por um RSS de 23 bases (regra conhecida por 12-23) [174]. Desta forma, os segmentos são rearranjados através de voltas invertidas que alinham as RSSs. O complexo RAG justapõe os dois segmentos, hidrolisa a ligação fosfodiéster entre as RSSs e os segmentos codificantes e usa os grupos 3’OH formados para uma transesterificação das cadeias opostas formando ‘ganchos’ que encerram as cadeias que contêm os segmentos [175]. A cadeia de DNA intermédia com os RSS em cada extremo é unida como um circulo de DNA constituindo o produto excisado (estes são os círculos de DNA com os sinais de junção que são quantificados como sjKRECS ou sjTRECS e permitem estimar a linfopoiese B e timopoiese, respetivamente [176, 177]). Nos extremos de cada cadeia com os segmentos codificantes, associa-se o complexo constituído pelas proteínas Ku70 e Ku80 [178] que promovem um processo que reúne as cadeias denominado de junção de terminais de DNA não homólogos (NHEJ, non-homologous end joining) [179]. O complexo Ku recruta uma proteína cinase dependente de DNA (DNA-PKcs) [178] e a proteína Artemis [180] que clivam o gancho das cadeias preferencialmente nas base terminais ou a 1-2 bases em 5´das bases terminais. Nesta última clivagem assimétrica forma-se uma cauda 3’ e são adicionados à cadeia 5’ nucleótidos palindrómicos [181]. Para além destas bases suplementares adicionadas aos segmentos, é gerada diversidade genética suplementar no gene IGH e nos loci TCR removendo bases pela ação de exonucleases ou pela adição aleatória de N- nucleótidos pela ação da deoxinucleotidil transferase terminal (TdT) expressa especificamente pelos precursores de células B e T [182]. Finalmente, o heterodímero Ku recruta um complexo constituído por XRCC4, DNA ligase IV e o fator Cernunnos (XLF), que estabelece as ligações moleculares entre nucleótidos dos dois segmentos codificantes [179, 183, 184]. Deste processo, resultam sequências genéticas únicas que, se estiverem em grelha de leitura, codificam a cadeia Ig e constituem o repertório estrutural primário de células B.

1.3.2.2. A Maturação Terminal das Células B Induzida pelas Respostas