Giulia Soares Latosinski1; Tony Picoli2; Cristina Mendes Peter3; Samea Fernandes Joaquim4;
João Luíz Zani5
1Residente em Zoonoses e Saúde Pública, UNESP, Botucatu, SP. E-mail: [email protected]2Médico Veterinário, Doutorando do PPGV UFPel/Pelotas, RS. E-mail: [email protected]Residente em Saúde Coletiva, UFPel / Pelotas, RS. E-mail: [email protected] 4Residente em Zoonoses e Saúde Pública, UNESP, Botucatu, SP. E-mail: [email protected] 5Professor Adjunto do Departamento de Veterinária Preventiva, UFPel / Pelotas, RS. E-mail: [email protected]
Introdução: Na cadeia produtiva do leite, a mastite é a enfermidade que mais onera a produtividade e os rendimentos. Trata-se de uma enfermidade inflamatória da glândula mamária causada por diferentes micro-organismos, sendo as bactérias o principal agente causador. Dentre esses patógenos destacam-se os gêneros Staphylococcus spp., Streptococcus spp e Escherichia coli, que ao colonizarem a glândula mamária, provocam danos ao tecido e à sua secreção, alterando assim as características físico-quimicas, organolépticas e composicionais do leite, além dos gastos com medicamentos. Como método alternativo ao combate à mastite, os produtos naturais têm ganhado destaque nas pesquisas e, a própolis, uma resina natural produzida por abelhas, possui atividade antibacteriana descrita há décadas em diversas pesquisas. Assim, objetivou-se estudar o tempo de ação antibacteriana da própolis sobre bactérias causadoras de mastite.
Material e Métodos: As amostras de própolis verde foram trituradas, imersas em álcool etílico absoluto e mantido sob agitação por 48 horas a 37ºC. A solução, após filtração, foi rotaevaporada para obtenção do extrato que foi esterlizado em filtro hidrofóbico de 0,22 µm. O composto foi emusificado utilizando EUMULGIN® HRE-40 e diluído em água destilada estéril até a concentração de 25 mg/mL. Foram utilizadas 4 cepas de Staphylococcus aureus, 2 cepas de S. intermedius e 2 cepas de S. epidermidis; 3 cepas de Streptococcus agalatiae, 2 cepas de S. dysgalactiae e 2 cepas de S. uberis; e 3 cepas de Esherichia coli. Todas as bactérias utilizadas foram isoladas de leite de tanques resfriadores e caracterizadas adequadamente. Estas foram semeadas em meio de cultura Agar sangue ovino 5%, incubadas a 37°C por 24 horas, e as colônias resultantes foram suspensas em solução salina estéril a 0,85% até a turbidez 0,5 de McFaland (aproximadamente 1,5 x 108 bactérias/mL). Dois tubos contendo solução de própolis verde 25 mg/mL mais inóculo bacteriano foram incubados a 37ºC. Desses tubos foram coletadas amostras em 8 momentos e semeadas em triplicata: zero minutos (apenas suspensão bacteriana), 15 minutos, 30 minutos, 01 hora, 02 horas, 03, horas, 04 horas, 05 horas e 06 horas. Foram semeados 0,1 mL pela técnica pour-plate em placas contendo Agar PCA (Plate Count Agar). Após 24 horas de incubação, as placas foram submetidas a contagens de unidades formadoras de colônias (UFC). A análise estatística foi realizada mediante análise de variância com comparação entre médias pelo teste de Tukey, através do software BioEstat® versão 5.3.
32 Resultados e Discussão: A Figura 1 demonstra a queda nas contagens bacterianas em função do tempo de exposição ao extrato hidro-alcoólico de própolis verde. Em apenas 15 minutos de exposição, os Staphylococcus spp. foram inibidos em 46,03% ± 2,12%, Streptococcus spp. inibidos em 50,8% ± 2,38% e as contagens não diferiram estatisticamente (p>0,05), já E. coli teve inibição de 38,73% ± 1,98% de suas colônias e diferiu dos demais gêneros bacterianos estudados (p<0,05). As contagens de E. coli ainda diferiu dos demais gêneros nas contagens realizadas aos 30 minutos de exposição à própolis (p<0,01), 1 hora (p<0,01) e 2 horas (p<0,05). Estudos anteriores já demonstram a maior resistência de bactérias Gram negativas em relação às Gram positivas frente à diferentes extratos de própolis. Aos 30 minutos e 1 hora de exposição, as contagens de Staphylococcus spp. e Streptococcus spp. diferiram estatisticamente (p<0,05) com contagens menores de Streptococcus spp, demonstrando a maior sensibilidade desse gênero frente ao extrato de própolis verde, corroborando com a literatura já existente. Ao passar de 2 horas de incubação, o gênero Streptococcus spp. havia sido totalmente eliminado, restando apenas 0,03% ± 0,01% do inóculo inicial de Staphylococcus spp. e 8% ± 0,97% de E. coli. A bactéria Gram negativa ainda apresentou contagens após 3 horas de exposição (34,67 x 106 UFC/mL) e foi totalmente eliminada após 4
horas de exposição. Nota-se que houve inibição total dos micro-organismos, o que mostra um potencial de uso da própolis na atividade leiteira como desinfetante para pré-dipping ou mesmo desinfecção de equipamentos e tubulações. Em concentrações mais elevadas, o tempo de ação tende a ser inferior aos apresentados.
Figura 1. Contagens bacterianas em função do tempo de exposição ao extrto hidro-alcoólico de própolis verde (25mg/mL)
Conclusões: Conclui-se que o extrato hidro-alcoólico de própolis verde tem ação antibacteriana frente às bactérias estudadas potencial de uso na atividade leiteira como desinfetante e até mesmo tratamento após pesquisas mais aprofundadas.
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0 min 15 min 30 min 1 h 2 h 3 h 4 h
C o n ta g e m b a ct e ri a n a ( x 1 0 6U F C /m L) tempo de exposição Staphylococcus spp Streptococcus spp E. coli
33 Resumo 17 - DETECÇÃO MOLECULAR DE Mycoplasma spp. EM CASOS DE MASTITE BOVINA SUBCLÍNICA1.
MOLECULAR DETECTION OF Mycoplasma spp. IN CASES OF SUBCLINICAL BOVINE MASTITIS1.
amea Fernandes Joaquim2; Felipe de Freitas Guimarães3; Marcela de Pinho Manzi4; Giulia
Soares Latosinski5; Anelise Salina6; Helio Langoni7*
1Processo Fapesp: 2011/14135-0 2Residente em Zoonoses e Saúde Pública – FMVZ UNESP Botucatu [email protected] 3Doutor em Medicina Veterinária – FMVZ UNESP Botucatu [email protected] 4Doutoranda em Medicina Veterinária – FMVZ UNESP Botucatu [email protected] 5Residente em Zoonoses e Saúde Pública – FMVZ UNESP Botucatu [email protected] 6Doutoranda em Medicina Veterinária – FMVZ UNESP Botucatu [email protected] 7Professor Titular - Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ), Universidade Estadual Paulista (Unesp), Campus de Botucatu, Distrito de Rubião Junior s/n, Botucatu, SP 18618-970, Brasil. [email protected]
Introdução: O leite é um alimento imprescindível para todas as faixas etárias e há uma grande preocupação em assegurar a integridade e a sua qualidade intrínseca, assim como de seus derivados destinados ao consumo. O principal problema nos rebanhos leiteiros que afeta a qualidade desse produto, além de causar prejuízos econômicos é a mastite, que pode apresentar-se de duas formas distintas, clínica e subclínica. A forma subclínica caracteriza-se pela diminuição da produção leiteira, sem que sejam observados sinais visíveis do processo inflamatório na glândula mamária ou no leite, tais como edema, dor, calor e rubor, ou ainda, grumos e coágulos no leite. Para o tratamento ou destino adequado da vaca que apresenta mastite, seja na forma clínica ou subclínica, é necessário identificar os animais acometidos, assim como saber qual o agente, ou agentes causadores da doença, fato que orienta para as medidas de prevenção e controle. Dentre os patógenos responsáveis pela ocorrência dessa enfermidade estão as espécies do gênero Mycoplasma spp., destacando-se Mycoplasma bovis, o qual é o responsável pela maioria dos surtos de mastites nos rebanhos leiteiros. As características da enfermidade produzida pelas espécies do gênero Mycoplasma sp. é similar, porém ocorre variação no grau de severidade. Vacas em qualquer idade e estágio de lactação são susceptíveis à mastite com essa origem etiológica, inclusive as não lactantes. A literatura relata índices de incidência de 0,5 a 35% de mastite causada por Mycoplasma bovis em diversos países. No Brasil, a pesquisa desse agente, assim como de outras espécies de micoplasmas tanto nas mastites como em outras patologias são pouco frequentes. Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi a pesquisa de Mycoplasma spp. em casos de mastite bovina subclínica, pela reação em cadeia da polimerase (PCR).
Material e métodos: Foram avaliadas cinco propriedades do centro-oeste paulista, as quais continham no mínimo 50 vacas em lactação. Antes da ordenha e após o preparo do úbere, foram realizados os testes de Tamis, para detecção de mastite clínica, e o California mastitis test (CMT), para identificação de casos de mastite subclínica. Em todos os tetos que apresentaram reação a partir de 1+ no CMT foram coletadas amostras para análise e contagem de células somáticas, após rigorosa antissepsia com álcool iodado a 0,5%. Também foram coletadas amostras dos tanques das propriedades para a pesquisa de Mycoplasma spp. Inicialmente, foi realizada a extração de ácidos nucleicos do leite oriundo das amostras dos tanques das propriedades, esse procedimento foi realizado com o auxílio do kit comercial “Blood genomic Prep Mini Spin Kit” (GE Healthcare®), a amplificação do DNA de Mycoplasma spp. foi realizada utilizando os primers MGSO (5´ TGC ACC ATC TGT CAC TCT GTT AAC CTC 3´) e GPO-3 (5´ GGGAGC AAA CAG GAT TAG ATA CCC 3´), com produto amplificado de 270 pares de bases e o seguinte perfil de amplificação: cinco minutos
34 a 94°C, trinta e cinco ciclos de 94°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por 30 segundos e uma extensão final a 72°C por 10 min, utilizando o termociclador Mastercycler epgradient S (Eppendorf®). A visualização do material amplificado foi avaliada pela corrida eletroforética em gel de agarose a 1,5% adicionado de 0,192µL/mL de Nancy-520 (Sigma- Aldrich®). Em caso de positividade da amostra do tanque, as amostras individuais dos tetos também foram submetidas a extração de DNA para análise. As amostras individuais positivas para o gênero Mycoplasma foram submetidas à uma segunda PCR para a espécie Mycoplasma bovis, em que foram utilizados os seguintes primers: MBOr (5´ CCG TCA AGG TAG CAT CAT TTC CTA T 3´ ) e MBOf (5´CCT TTT AGA TTG GGA TAG CGG ATG 3´), com produto de 360 pares de bases, cujo perfil de amplificação foi: um ciclo de 94ºC por três minutos, trinta e cinco ciclos de 94ºC por um minuto, 60ºC por um minuto, 72ºC por um minuto e uma etapa final de 72ºC por três minutos.
Resultados e discussão: Somente o tanque da propriedade número 1 foi positivo para o gênero Mycoplasma pela PCR. Sendo assim, somente as amostras individuais positivas no CMT dessa propriedade foram avaliadas, portanto foram avaliados 496 tetos, distribuídos da seguinte forma: 15 tetos (3,02% do total) apresentavam mastite subclínica com reação de 1+ no CMT, 21 tetos (4,23%) apresentavam 2+ no CMT, enquanto que 60 (12,1%) eram 3+. Já 2 tetos (0,4%) foram classificados com mastite clínica. Ainda, 11 tetos (2,22%) eram perdidos e 7 (1,41%) estavam em fase colostral. Todas as amostras positivas no CMT tiveram o DNA extraído e duas delas foram positivas para o gênero Mycoplasma (2,08%), porém nenhuma das duas foi positiva para a espécie Mycoplasma bovis. A baixa prevalência encontrada no presente estudo corrobora com outras pesquisas em diferentes países, tais como: 5,4% na Grécia8, 1,5% na Bélgica9 e a ausência de positividade na Nova Zelândia10.
Conclusão: Com o presente estudo, conclui-se que há uma baixa ocorrência de Mycoplasma spp. em casos de mastite subclínica nas propriedades avaliadas, entretanto é oportuno a continuidade desses estudos, considerando-se a contagiosidade do agente e a elevada incidência em outros países.
Referências bibliográficas:
8Filioussis, G., Christodoulopoulos, G., Thatcher, A., Petridou, V., & Bourtzi-Chatzopoulou,
E. (2007). Isolation of Mycoplasma bovis from bovine clinical mastitis cases in Northern Greece. The Veterinary Journal, 173(1), 215-218.
9 Passchyn, P., Piepers, S., De Meulemeester, L., Boyen, F., Haesebrouck, F., & De Vliegher,
S. (2012). Between-herd prevalence of Mycoplasma bovis in bulk milk in Flanders, Belgium. Research in veterinary science, 92(2), 219-220.
10McDonald, W. L., Rawdon, T. G., Fitzmaurice, J., Bolotovski, I., Voges, H., Humphrey, S.,
... & McIntyre, L. (2009). Survey of bulk tank milk in New Zealand for Mycoplasma bovis, using species-specific nested PCR and culture. New Zealand veterinary journal, 57(1), 44-49.
35 Resumo 18 - A ESPECTROMETRIA DE MASSA POR IONIZAÇÃO E DESSORÇÃO À LASER ASSISTIDA POR MATRIZ TEMPO DE VOO (MALDI/ TOF-MS) NA IDENTIFICAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS CAUSADORES DE MASTITE.
MATRIX ASSISTED LASER DESORPTION IONIZATION TIME-OF-FLIGHT