Carolina Polo Camargo da Silva1; Marcella Zampoli Troncarelli1; Alessandra Tata2; Katia Roberta Anacleto Belaz2; Marcos Nogueira Eberlin2; Sâmea Fernandes Joaquim1; Hélio Langoni1*
1Departamento Higiene Veterinária e Saúde Pública- Núcleo de Pesquisa em Mastites (NUPEMAS) FMVZ-UNESP, Botucatu-SP 1* Professor Titular. Disciplina de Zoonoses- DHVSP-FMVZ- UNESP/Botucatu, SP. Email: [email protected] Laboratório ThonMSon de Espectrometria de Massas- UNICAMP, Campinas- SP
Introdução: A mastite é a principal enfermidade da cadeia produtiva do leite. Impacta negativamente a economia, pela diminuição do rendimento industrial, bem como pela diminuição da produção. Sua etiologia é ampla, estando envolvidos patógenos contagiosos e ambientais. Entres os patógenos contagiosos está a Corynebacterium bovis (C.bovis), localizado na glândula mamaria, principalmente no canal do teto. Tem sido considerado por alguns autores como patógeno de menor importância, entretanto outros o consideram como relevante ao se avaliar a concentração de células somáticas (CCS) e a produção leiteira, além de haver a sua citação como causador de mastite clínica e não somente subclínica. Da mesma forma que para outros patógenos o diagnóstico é baseado na CCS, California Mastits Test (CMT) e exame microbiológico são importantes para o monitoramento da qualidade do leite em propriedades leiteiras. Há pesquisas que mostram o aumento na CCS, em casos de mastite subclínica com CMT positivos, além da diminuição da produção, quando se compara tetos negativos com seus homólogos positivos, com o isolamento em estado puro exuberante. Outros autores relatam o papel protetor do C.bovis para a glândula mamária, mantendo celularidade com níveis variáveis de polimorfonucleares capazes de proteger a glândula mamária quando do ataque de outro patógeno causador de mastite. Este fato que não tem sido observado no manejo de rebanhos quando se trabalha com monitoramento da ocorrência de mastites, pois tem se encontrado com frequência a sua associação com Staphyloccocus spp. e Streptococcus spp. Considerando- se os aspectos levantados e a importância de se conhecer a etiologia das mastites, o objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrência de Corynebacterium spp. em propriedade leiteira ao longo de 10 meses, bem como proceder a caracterização dos isolados por MALDI-TOF/ MS.
Material e métodos: Utilizou-se para monitoramento propriedade localizada em região central do estado de São Paulo, com 330 vacas em lactação/mês, na maioria puras de origem, ordenhadas três vezes ao dia, com média diária de 11000Kg de leite. Após processo de higiene e desinfecção, amostras de leite para cultivo microbiológico foram obtidas de acordo com o National Mastits Council (NMC), realizando-se o cultivo em meio de ágar- sangue ovino 8% e ágar MacConkey, com a incubação aeróbica por 72 horas, com observação diária do desenvolvimento microbiano a cada 24 horas, com visualização e caracterização dos isolados. Outros micro-organismos foram isolados (dados não apresentados). Às 48 horas, as colônias suspeitas de Corynebacterium spp. foram repicadas para meio de caldo-cérebro- coração (BHI) adicionando-se 1% de Tween 80. A seguir os isolados no total de 80 estirpes de Corynebacterium spp. foram criopreservados em glicerol (1:1), adicionando-se 500µ L de BHI com Tween-80 contendo o micro-organismo isolado, em 500µ L de glicerol estéril 40%, em tubos criogênicos estéreis, que foram mantidos em temperatura de congelamento (-20°C) até o momento da caracterização por MALDI-MS. Os isolados foram descongelados e
36 reisolados. Após reisolamento, procedeu-se a retirada de parte das colônias por raspagem da superfície do meio, cuidadosamente para evitar a presença de ágar, colocou-se em microtubos estéreis contendo 300 µL de água deionizada. Adicionou-se 900 µL de etanol (HPLC) para inativação bacteriana, homogeneizando-se. A seguir, procedeu-se a centrifugação à 1500g/3min, descartando-se o sobrenadante por inversão do microtubo. Realizou-se nova centrifugação, como anteriormente retirando-se o restante do etanol com auxilio de micropipeta. Após secagem do pellet/30 minutos a temperatura ambiente em baixo da capela química com aspirador ligado, adicionou-se solução de 70% de acido fórmico recobrindo-se o pellet (ao redor de 30 µL) para a lise bacteriana. A seguir, homogeneizou-se com auxilio de pipeta e em vórtex durante 2 minutos. Após adição dos 30 µ L de acetonitrila 100% e homogeneização em vórtex, centrifugou-se a 14000g por 3 minutos para separação do sedimento e células bacterianas e sobrenadante, contendo as proteínas, principalmente as ribossomais. Pipetou–se 1 µ L em placa específica (96 MSP; Bruker Daltonics , EUA), mantendo-se à temperatura ambiente para secagem por evaporação e a seguir, adicionou-se 1 µ L de solução matriz, composta de ácido alfa-ciano-4-hidroxi-cinâmico (CHCA) diluída em acetonitrila 50% e de ácido trifluoroacético 2,5%. Utilizou-se o aparelho espectrofotômetro de massa MALDI-TOF LT Microflex Bruker equipado com laser de 337 nm de nitrogênio no modo linear, controlado pelo programa computacional FlexControl 3.3 (Bruker Daltonics, EUA). Os espectros de massas foram coletados na faixa de massa de m/z 2.000-20.000 no modo positivo e analisados pelo programa MALDI Biotyper 3.0 (Bruker Daltonics, EUA) com as configurações padrão para obtenção da identificação do espécime bacteriano testado. O algoritmo utilizado pelo MALDI Biotyper confronta os espectros da amostra desconhecida com amostras referência contidas em banco de dados. O procedimento de análise leva em consideração as massas e as intensidades relativas dos espectros desconhecidos.
Resultados e Discussão: A análise dos resultados revelou 54 estirpes com elevada identidade com a amostra de C. bovis de referência, 25 com provável identidade e uma espécie não identificada.
Conclusão: Pode-se concluir que a técnica de espectrometria de massa por ionização e dessorção a laser assistida por matriz tempo de voo, pode ser utilizada na caracterização de C. bovis, podendo ser considerada de grande aplicabilidade na identificação de micro- organismos causadores de mastite.
37 Resumo 19 - POTENCIAL DETERIORANTE E TERMODÚRICO DE Fusarium
chlamydosporum ISOLADO DO LEITE CRU REFRIGERADO DA BACIA LEITEIRA