Exe cução da RT-PCR

O diag nó stico labo rato rial da infe cção pe lo vírus da g ripe pandé mica (H1N1) 2009 fo i e fe ctuado co m o kit de e xtracção co me rcial, Q IAam p Viral RNA Mini Kit (QIAGEN® , Ale manha) (ve r Ane xo s, tabe la 27). De aco rdo co m e ste pro to co lo , pre paro u-se o s re ag e nte s ne ce ssário s à re alização do te ste , co mo indica a tabe la 6.

Tabe la 6. Pre paração do s re ag e nte s.

Re age nte Pre paração

So lução AVL

Adicio no u-se 1 m L de tam pão AVE ao tubo co nte ndo RNA carrie r lio filizado . Disso lve u-se po r ag itação no vó rte x e transfe riu-se o c o nte údo para o frasco de tam pão AVL. Ho m o g e ne izo u-se no vó rte x e fize ram -se alíquo tas de 560 µL.

Tam pão AW 1 Adicio no u-se 25 m L de e tano l (96%) ao frasco co nte ndo 19 m L de tam pão AW1 co nce ntrado .

Tam pão AW 2 Adicio no u-se 30 m L de e tano l (96%) ao frasco co nte ndo 13 m L de tam pão AW2 co nce ntrado .

3.2.2.1. Tratam e nto das am o stras

A pro te ó lise das amo stras é re alizada e m co ndiçõ e s altame nte de snaturante s a te mpe raturas e le vadas e inclui a sua lise na pre se nça do tampão de e luição Buffe r AVE (QIAGEN® ) e da pro te inase K (QIAGEN® ), o s quais juntame nte , asse g uram a dig e stão das pro te ínas co ntaminante s pre se nte s e a inactivação de nucle ase s.

Este pro ce dime nto de stina-se ao pré -tratame nto de amo stras re spirató rias visco sas ante s da purificação de ácido s nucle ico s. As amo stras re spirató rias não visco sas não e xig e m qualque r pré -tratame nto , po de ndo se r usadas ime diatame nte co mo mate rial de partida para o pro to co lo de purificação .

No tratame nto das amo stras visco sas, pipe to u-se 40

μ

μ

De ixo u-se incubar durante 1 ho ra a 56º C no banho de ág ua para to rnar a amo stra fluída.

-39- 3.2.2.2. Extração e m co luna do RNA viral

Inicialme nte , adicio no u-se 140 µL de amo stra (tratada o u não , co nso ante a visco sidade ) a 560 µL da so lução AVL-RNA carrie r, ho mo g e ne izo u-se no vó rte x durante 15 se g undo s (ve r Ane xo s, tabe la 26).

Co lo co u-se 10 minuto s à te mpe ratura ambie nte para pro mo ve r a lise , inactivando as RNAse s e asse g urando o iso lame nto do RNA viral intacto .

Se g uidame nte fo i re alizada uma bre ve ce ntrifugação caso o tubo apre se nte dispe rsão de g o tas. Fo ram adicio nado s 560 µL de e tano l (96%) à amo stra, ag ito u-se e ce ntrifug o u-se durante 15 se g undo s.

Aplico u-se 630 µL da mistura num tubo “QIAamp Spin Co lumn” (co lunas de e xtracção ) inse rido num tubo co le cto r, co mo ilustrado na fig ura 12. Ce ntrifug o u-se a 8000 r.p.m., durante 1 minuto , para o bte r a lig ação do RNA à co luna, te ndo -se de scartado o tubo co le cto r co nte ndo o filtrado e co lo co u-se a co luna num no vo tubo co le cto r.

Figura 12. Pro ce dime nto de e xtracção de RNA viral utilizando um a co luna e o QIAam p Viral RNA Mini Kit® (QIAGEN) [73].

O RNA viral lig ado à co luna é lavado e m do is passo s de ce ntrifug ação curta para e liminar co ntaminante s. O uso de do is tampõ e s de lavag e m dife re nte s, AW1 e AW2, (ve r Ane xo s, tabe la 27) me lho ra sig nificativame nte a pure za do RNA e luído . As co ndiçõ e s de lavag e m o ptimizadas asse guram a co mple ta re mo ção do s co ntaminante s re siduais se m afe ctar o RNA lig ado .

Adicio no u-se 500 µL de Tampão AW1 (tampão de lavag e m - lavag e m A), ce ntrifug o u-se a 8000 r.p.m., durante 1 minuto . De scarto u-se o tubo co le cto r co m o filtrado e co lo co u-se a co luna num tubo co le cto r no vo .

-40-

Adicio no u-se à co luna 500 µL de Tampão AW2 (tampão de lavag e m – lavag e m B), ce ntrifugo u-se a 8000 r.p.m., durante 1 minuto . De scarto u-se o tubo co le cto r co m o filtrado e co lo co u-se a co luna num no vo tubo co le cto r.

Po r fim, para e luir o RNA, co lo co u-se a co luna “QIAamp Spin Co lumn” num tubo co le cto r no vo e adicio no u-se 60 µL de tampão AVE (ve r Ane xo s, tabe la 27), te ndo - se de ixado incubar durante 1 minuto à te mpe ratura ambie nte (para e luir o RNA da co luna para o tubo co le cto r). O tampão AVE é ág ua livre de RNase s que co nté m azida só dica 0,04% para e vitar o cre scime nto micro biano e po ste rio r co ntaminação co m RNase s.

Finalme nte , ce ntrifug o u-se a suspe nsão a 8000 r.p.m., po r 1 minuto , re co lhe u- se o e luído co m o RNA e xtraído e de scarto u-se a co luna de e xtracção . No caso da amplificação do RNA e xtraído não se r ime diata, e ste fo i g uardado a -80º C.

3.2.2.3. RT-PCR

O te ste labo rato rial re co me ndado pe la OMS para a de te cção qualitativa da infe cção pe lo vírus da g ripe pandé mica (H1N1) 2009 é a re acção e m cade ia da po lime rase de re tro transcrição e m te mpo re al (RT-PCR).

A re alização de ste mé to do fo i e fe ctuada utilizando o kit co me rcial, AgPath-ID® One Ste p RT-PCR (Applie d Bio syste ms, USA) (ve r Ane xo s, tabe la 28), se g undo o se guinte pro ce dime nto :

Marco u-se o s tubo s de micro ce ntrífug a (1,5 mL) para cada te ste (infA, swInfA, swH1 e RNase P).De te rmino u-se o núme ro de re acçõ e s (N) a co nfig urar para cada e nsaio . Se o núme ro de amo stras (n) incluindo o s co ntro lo s, varia e ntre 1 e 14, e ntão N = n + 1; se o núme ro de amo stras (n) incluindo o s co ntro lo s, fo r supe rio r a 15, N = n + 2. Os valo re s aqui apre se ntado s co rre spo nde m ao diag nó stico labo rato rial para uma amo stra (n=1). Pipe to u-se para cada um do s tubo s de micro ce ntrífug a ide ntificado , 24 µL de ág ua livre de nucle ase s, 50 µL de Maste r Mix e 4 µL de Enzyme Mix (ve r Ane xo s, tabe la 28), co mo ilustrado na fig ura 13.

Para cada um de ste s tubo s, junto u-se 2 µL do co njunto de prime r/so nda (ve r Ane xo s, tabe la 28) co rre spo nde nte .

Ce ntrifug o u-se durante 5 se gundo s para co le ctar o co nte údo no fundo do tubo e pre paro u-se a micro placa de 96 po ço s.

-41- Figura 13. Pre paração das m isturas re ag e nte s.

Dispe nso u-se 20 µL de cada mistura re ag e nte para o s po ço s da micro placa re pre se ntada na tabe la 7.

Tabe la 7. Co m po sição da m icro placa co m adição das m isturas re ag e nte s re fe re nte s a cada te ste .

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A InfA sw InfA sw H1 RNaseP

B InfA sw InfA sw H1 RNaseP

C InfA sw InfA sw H1 RNaseP

D

E

F

G

H

No s po ço s do s co ntro lo s ne g ativo s, pipe to u-se 5 µL de ág ua livre de nucle ase s e no s po ço s do s co ntro lo s po sitivo s, 5 µL do co ntro lo po sitivo , te ndo o cuidado de mudar de po nta a cada adição .

Ag ito u-se no vó rte x o s tubo s co nte ndo a amo stra co m o RNA e xtraído ante rio rme nte po r 5 se g undo s e ce ntrifug o u-se po r mais 5 se g undo s.

Pipe to u-se 5 µL da amo stra e m to do s o s po ço s re lativo s a e sta. O e sque ma da distribuição do s co ntro lo s e amo stras e stá ilustrado na tabe la 8.

24 µL de ág ua livre de nucle ase s 50 µL de Maste r Mix

-42-

Tabe la 8. Co mpo sição da m icro placa para a de te cção do vírus da g ripe A (H1N1)v 2009.

Ante s de inse rir a micro placa no apare lho , pro g ramo u-se no instrume nto ABI Prism 7300® (Applie d Bio syste ms® , USA) o s parâme tro s do ciclo té rmico indicando 45 ciclo s e um vo lume to tal de re acção de 25 µL cujas co ndiçõ e s e stão e nunciadas na tabe la 9.

Tabe la 9. Pro g ram ação da se ssão de trabalho no te rm o ciclado r ABI Prism 7300® (Applie d Bio syste m s).