A fe bre aco mpanhada de manife staçõ e s re spirató rias e sinto mas sisté mico s é de te rminante na distinção e ntre a influe nza e o utras infe cçõ e s re spirató rias. Po ré m, e ste s
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sinto mas não são suficie nte me nte e spe cífico s para um diag nó stico se g uro se m co nfirmação labo rato rial [53]. Uma ve z que o s sinais e sinto mas g ripais não são pato g no mó nico s, o diag nó stico clínico do s caso s e spo rádico s de g ripe po de m se r inviáve is [12]. Até à data, ainda não e stão dispo níve is as base s clínicas que dife re ncie m as g ripe s causadas pe lo vírus do tipo A, B o u C [12].
O suce sso na ide ntificação do pato g é nio influe nza – asso ciado a um quadro clínico e spe cífico - de pe nde do s pro ce dime nto s labo rato riais. Os mé to do s de diag nó stico s e xiste nte s apre se ntam dife re nças impo rtante s, no que co nce rne à sua se nsibilidade , e spe cificidade , de se mpe nho , facilidade e duração de e xe cução , custo s co m e quipame nto s e co nsumíve is, e dispo nibilidade (tabe la 3). À e xce pção da de te cção antig é nica dire cta atravé s de te ste s rápido s, o diag nó stico re que r uma capacidade labo rato rial so fisticada e a e xistê ncia de pe sso al e spe cializado .
Tabe la 3. Principais m é to do s usado s no diag nó stico do vírus influe nza [66].
Dive rsas me to do lo g ias de ide ntificação da influe nza (fig ura 7) e stão dispo níve is, no me adame nte as té cnicas de caracte rização g e né tica e antig é nica, o s te ste s de ELISA, a RT-PCR, a cultura viral o u o vo s e mbrio nado s (mé to do padrão ), a imuno fluo re scê ncia indire cta (IF) e o s TRDIs (Te ste s Rápido s para Diag nó stico da Influe nza) [66]. A caracte rização g e né tica e antig é nica do vírus é re alizada pe lo te ste de inibição da he mag lutinação (IH) e pe las té cnicas de bio lo g ia mo le cular, re spe ctivame nte .
Mé to do Te m po Utilidade Vantage ns De svantage ns
IF 2 – 4
ho ras
Diag nó stico de ro tina Vig ilância
Rapide z Micro scó pio de fluo re scê ncia Não se re cupe ra a e stirpe viral
ELISA
0,25 – 2 ho ras
Diag nó stico de ro tina Diag nó stico rápido
Rapide z
Labo rató rio básico Po uca dificuldade
Custo
Não se re cupe ra a e stirpe viral
Cultivo ce lular
2 – 7 dias
Vig ilância Te m o s vírus co m ple to Baixo custo
Labo rató rio e pe sso al e spe cializado De m o ra
RT-PCR
1 – 2 dias
Vig ilância Alta se nsibilidade Custo
Labo rató rio e pe sso al e spe cializado De m o ra
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Fig ura 7. Exame s de diag nó stico dispo níve is e m dife re nte s ambie nte s labo rato riais [66].
Ne ste trabalho e ntre a dive rsidade de té cnicas po ssíve is de se re m utilizadas no diag nó stico de infe cção re spirató ria fo ram usadas o e nsaio imuno e nzimático indire cto (ELISA) para de te cção da infe cção pe la influe nza A e / o u B e a té cnica de PCR, re acção e m cade ia da po lime rase co m transcrição re ve rsa (RT-PCR) para a de te cção do vírus pandé mico (H1N1) 2009.
2.1.1 2.1.Ensaio im uno e nz im ático indire cto (ELISA)
O e nsaio imuno e nzimático (ELISA) é uma té cnica bio química usada principalme nte na de te cção se ro ló g ica de antico rpo s o u antig é nio s na amo stra. Esta me to do lo g ia utiliza do is antico rpo s, um de le s e spe cífico do antig é nio e o o utro aco plado a um e nzima. Este se g undo antico rpo dá o no me ao e nsaio “lig ado à e nzima” e fo rma o substrato cro mo gé nico o u fluo ro g é nico que pro duzirá um sinal. A té cnica é uma fe rrame nta útil tanto na de te rminação das co nce ntraçõ e s do antico rpo no so ro , co mo na de te cção da pre se nça do antig é nio . O ELISA po de se r re alizado para de te ctar tanto a pre se nça do antig é nio co mo do antico rpo na amo stra. O kit Influe nza A/ B Ig G/ Ig M ELISA® da Ge nzyme Viro te ch® usado no pre se nte e studo co nstitui um e nsaio imuno e nzimático rápido e in vitro, de stinado à de te cção dife re ncial quantitativa e qualitativa de antico rpo s humano s co ntra o s vírus influe nza A e B no so ro .
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2.1.1 2.1.1. Princípio do te ste
O te ste ELISA indire cto (fig ura 8) base ia-se na inte racção antico rpo -antig é nio de te ctáve l pe la re acção e nzimática. Na re acção , o s antig é nio s purificado s e stão adso rvido s na supe rfície inte rna de cada po ço das micro placas (pro ce sso co nhe cido co mo se nsibilização ).
Durante a incubação inicial, o s antico rpo s e spe cífico s e xiste nte s na amo stra do do e nte lig am-se a e ste s antig é nio s imo bilizado s na fase só lida fo rmando um imuno co mple xo e pe rmane ce m re tido s apó s a prime ira lavag e m. As imuno glo bulinas não lig adas são re mo vidas co m PBS-Twe e n 20, so lução utilizada no s pro ce sso s de lavag e m. Po ste rio rme nte , um se g undo antico rpo co njug ado co m a e nzima pe ro xidase lig a-se ao s antico rpo s do do e nte pre se nte s na placa apó s a prime ira incubação . As imuno g lo bulinas não lig adas são no vame nte re mo vidas po r pro ce sso s de lavag e m co m PBS-Twe e n 20.
A re acção se ro ló g ica é visualizada, adicio nado substrato TMB (3,3’,5,5’- te trame tilbe nzidina) que pro duz uma substância co rada azul na pre se nça da pe ro xidase . Esta substância apó s a adição da so lução sto p muda para amare lo . A co lo ração amare la é quantificada apó s o blo que io da re acção e nzimática. A inte nsidade de sta co lo ração é pro po rcio nal à co nce ntração de antico rpo s e spe cífico s e xiste nte s na amo stra. Esta me to do lo g ia apre se nta e le vada uma se nsibilidade e e spe cificidade .
Fig ura 8. Re acção re lativa ao e nsaio im uno e nzim ático indire cto (ELISA) [67].
2.1.1 2.1.2. Avaliação do te ste
Na validação do te ste usam-se co ntro lo s, que pe rmite m a de te rminação se miquantitativa de antico rpo s IgG e Ig M e spe cífico s, cuja co nce ntração é calculada e m unidade s Viro te ch (VE). Variaçõ e s e m re sultado do mo do de re alização do te ste são co mpe nsadas pe lo mé to do de cálculo , se ndo co nse g uida uma e le vada re pro dutibilidade .
As amo stras são co nside radas po sitivas se o s valo re s de abso rvância fo re m supe rio re s a 10% do cut-o ff. As amo stras são ne g ativas para valo re s de abso rvância infe rio re s a 10% do cut-o ff. As amo stras co m um valo r de abso rvância infe rio r a 10% acima o u abaixo do cut-o ff fo ram co nside radas duvido sas.
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i) Co ntro lo de função do te ste :
a) Valo re s de OD (de nsidade ó ptica, do ing lê s o ptical de nsity)
O valo r OD do branco de ve se r <0,15. Os valo re s de OD do s co ntro lo s ne g ativo s de ve m situar-se abaixo do s valo re s de OD indicado s no ce rtificado de co ntro lo de qualidade . Os valo re s de OD do s co ntro lo s po sitivo s e do s cut-o ff de ve m situar-se acima do s valo re s de OD indicado s no ce rtificado de co ntro lo de qualidade (tabe la 4).
b) Unidade s Viro te ch (VE)
As unidade s Viro te ch (VE) são unidade s arbitrárias usadas na me dição da co nce ntração de antico rpo s me diante a té cnica de ELISA utilizando o kit Influe nza A/ B Ig G/ Ig M ELISA® da Ge nzyme Viro te ch®. As unidade s Viro te ch (VE) do s co ntro lo s cut-o ff são de finidas co mo 10 VE. As VE calculadas do s co ntro lo s po sitivo s de ve m situar-se de ntro das g amas indicadas no ce rtificado de co ntro lo de qualidade (tabe la 4). Se o s re quisito s (valo re s de OD e VE) não fo re m pre e nchido s, o te ste de ve se r re pe tido .
Tabe la 4. Ce rtificado de co ntro lo de qualidade do kit Influe nza A/ B Ig G/ Ig M ELISA® da Ge nzyme Viro te ch® .
IgG IgM
NEG CO POS NEG CO POS
- +/ - + - +/ - +
O D 450/ 620 nm
< 0,15 > 0,25 > 0,46 < 0,15 > 0,33 > 0,68
VE < 9 10 > 11 < 9 10 > 11
ii) Cálculo das unidade s Viro tech (VE)
As unidade s Viro te ch são calculadas a partir das de nsidade s ó pticas mé dias da amo stra e do cut-o ff. O cálculo das VE de ve se r re alizado atravé s das fó rmulas (fig ura 9). A e xtinção do valo r ze ro (450/ 620 nm) de ve se r subtraída de to do s o s co e ficie nte s de e xtinção .
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Na de te rminação do s antico rpo s IgM po de m o bte r-se muitas ve ze s, re sultado s que são falso s po sitivo s de vido à pre se nça do facto r re umató ide (RF) e / o u de antico rpo s Ig G e spe cífico s do micro rg anismo na amo stra. Po r co nse g uinte , o facto r re umató ide , basicame nte o antico rpo Ig M, co mpe te co m o s antico rpo s Ig G pe lo s me smo s sítio s de lig ação ao antig é nio , pro duzindo falso s po sitivo s quando o co njugado Ig M é adicio nado . Po r o utro lado , o e xce sso de Ig G po de pro mo ve r co mpe tição e ntre dife re nte s tipo s de imuno g lo bulinas, dando lug ar a falso s ne g ativo s. Po r e sta razão , é ne ce ssário subme te r as amo stras do s pacie nte s para a de te cção das Ig M a um pré -tratame nto co m adso rve nte . Este pré -tratame nto pro duz a imuno pre cipitação das Ig G e vitando de ste mo do , ambo s o s tipo s de inte rfe rê ncias.
O adso rve nte VIR-ELISA Ig G – RF - SORBENT® (Viro -Immun Labo r-Diagno stika GmbH, Ale manha) é utilizado no pré -tratame nto das amo stras do s pacie nte s. Ao faze r isto , o s antico rpo s Ig G e spe cífico s do ag e nte pato g é nico são re mo vido s, assim co mo o s Ig M-RF po ssive lme nte e xiste nte s.
2.1.1 2.2. Re acção e m cade ia da po lim e rase co m transcrição re ve rsa (RT-PCR)
A de te cção mo le cular do vírus influe nza é re alizada po r PCR e m te mpo re al, pre ce dida de transcrição re ve rsa. Esta re acção po ssui co mo mo lde inicial a mo lé cula de RNA e g e ra cDNA, a partir do s de so xirribo nucle o tíde o s trifo statado s. Apó s a o bte nção do cDNA, uma alíquo ta de sta amo stra de cDNA é utilizada na re acção de amplificação po r PCR. A re acção de amplificação e m te mpo re al, uma variante da re acção de PCR co nve ncio nal, re pre se nta um g rande avanço no s mé to do s mo le culare s de auxílio ao diag nó stico , particularme nte po r facilitar as tare fas de quantificação da e xpre ssão g é nica e m de te rminado te cido o u amo stra bio ló g ica.
2.1.1 2.2.1. Princípio do te ste
O mé to do base ia-se na de te cção de fluo re scê ncia, uma ve z que utiliza um co rante fluo re sce nte o u so nda marcada capaz de de te ctar a luz o riunda da re acção de amplificação . A utilização de so ndas fluo re sce nte s e spe cíficas para uma re g ião do DNA- alvo po ssibilita, atravé s da de te cção co m um so ftware info rmático , a visualização do aume nto da quantidade de DNA e m te mpo re al. Estas so ndas co nsiste m e m o lig o nucle ó tido s co m mo dificaçõ e s nas duas e xtre midade s, no me adame nte , um
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fluo ró cro mo re po rte r que e mite radiação (e xtre midade 5’) e um fluo ró cro mo que nche r (e xtre midade 3’) que abso rve a luz que o prime iro e mite , impe dindo a sua de te cção .
De ssa fo rma, o siste ma ó ptico do e quipame nto não é capaz de de te ctar a fluo re scê ncia no tubo de re acção . Po r o utro lado , se a re acção fo r capaz de g e rar pro duto s, a so nda irá hibridizar-se co m e sse alvo g e rado e ficará e xpo sta à actividade e xo nucle o tídica da po lime rase . Co mo co nse quê ncia, e ssa so nda se rá de g radada e o fluo ró cro mo ficará distante do que nche r que não se rá capaz de abso rve r a luz e mitida pe rmitindo a de te cção da fluo re scê ncia. A fluo re scê ncia e ve ntualme nte pro duzida pe la amo stra é de te ctada pe lo siste ma e o ciclo da re acção de PCR e m que a fluo re scê ncia da amo stra é de te ctada ine quivo came nte acima do ruído de fundo (backg ro und) é de no minado de Ct o u CP (cycle thre sho ld o u cro ssing po int). Assim, a cada e stímulo lumino so g e rado pe lo e quipame nto co rre spo nde rá uma se g unda e missão de luz pe lo fluo ró cro mo . Po rtanto , a e missão de luz se rá pro po rcio nal à quantidade de pro duto g e rado no tubo de re acção , que po r sua ve z, pro po rcio nal à quantidade inicial de alvo s da re acção de amplificação .
O te ste labo rato rial re co me ndado pe la Org anização Mundial de Saúde (OMS) para a de te cção qualitativa da infe cção pe lo vírus da g ripe pandé mica (H1N1) 2009 [68], co nhe cido co mo vírus da g ripe suína, é re alizado pe la té cnica da re acção e m cade ia da po lime rase de re tro transcrição e m te mpo re al (RT-PCR), de aco rdo co m o pro to co lo e stabe le cido pe lo Ce nte rs fo r Dise ase Co ntro l and Pre ve ntio n (CDC). Este te ste é multiprime r, po is inclui a utilização de um co njunto de o lig o nucle o tído s (prime rs) e so ndas marcadas (pro be s) para de te cção do vírus da g ripe suína, atravé s da amplificação de frag me nto s de ge ne s e spe cífico s. O pro to co lo do CDC pre co niza a re alização de quatro re acçõ e s de amplificação se paradas na me sma placa:
i) Re acção InfA - de te cta do g e ne M do vírus influe nza A unive rsal
ii) Re acção swInfA - de te cta o g e ne NP de to do s o s vírus Influe nza A de o rig e m suína
iii) Re acção swH1 - de te cta o g e ne HA e spe cífico para o vírus A/ H1N1 pandé mico
iv) Re acção RNase P – de te cta o g e ne da RNase P humana e se rve co mo co ntro lo inte rno da re acção para indicar uma e xtracção ade quada do ácido nucle ico da amo stra clínica.
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Em cada uma de stas quatro re acçõ e s, é e mpre g ue um par de iniciado re s se nso e antise nso (prime rs fo rward e re ve rse ) e uma so nda marcada co m fluo ró cro mo s. Este co njunto de prime rs e so ndas usado s na de te cção da influe nza A (H1N1) co nté m 12 se quê ncias (tabe la 5), e e stão de aco rdo co m o pro to co lo e stabe le cido pe la OMS intitulado “CDC pro to co l o f re altime RTPCR fo r swine influe nza A (H1N1)” [68].
Tabe la 5. Co njunto de prime rs e so nda usado s na tipag e m e subtipag e m do vírus influe nza A.
Nom e do s prim e rs e so nda Se quê ncia (5´ 3´ )
InfA Fo rward GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C
InfA Re ve rse AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA
InfA Pro be 1 TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG
SW InfA Fo rward GCA CGG TCA GCA CTT ATY CTR AG
SW InfA Re ve rse GTG RGC TGG GTT TTC ATT TGG TC
SW InfA Pro be 2 CYA CTG CAA GCC CA” T” ACA CAC AAG CAG GCA
SW H1 Fo rward GTG CTA TAA ACA CCA GCC TYC CA
SW H1 Re ve rse CGG GAT ATT CCT TAA TCC TGT RGC
SW H1 Pro be 2 CA GAA TAT ACA “ T” CC RGT CAC AAT TGG ARA A
Rnase P Fo rward AGA TTT GGA CCT GCG AGC G
Rnase P Re ve rse GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT
Rnase P Pro be 1 TTC TGA CCT GAA GGC TCT GCG CG
1 As so ndas TaqMan® são marcad as co m do is fluo ró cro m o s dife re nte s, um na e xtre m idade 5’ , o “ re po rte r” (6- carbo xifluo re sce ína- FAM) e o utro na e xtre m idade 3’ , o “ que nche r” , Blackho le Q ue nche r 1 (BHQ1) (Bio se arch Te chno lo g ie s, Inc., No vato , CA).
2 As so ndas TaqMan® são marcadas na e xtre midade 5’ c o m o fluo ró cro mo “ re p ó rte r” (6-carbo xifluo re sce ína- FAM) e que nche d inte rname nte a um re síd uo “ T” m o dificad o c o m BHQ 1, co m uma e xtre mid ade 3’ m o dific ad a p ara pre ve nir a e xte nsão da so nda pe la Taq po lime rase .