DISSERTAÇÃO PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM BIOQUÍMICA APLICADA

i DISSERTAÇÃO PARA O BTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE

EM BIO Q UÍMICA APLICADA

Sílvia Cristina Sardinha Camacho

Orie ntado r: Pro fe sso r Do uto r Mig ue l Âng e lo Alme ida Pinhe iro de Carvalho Co -o rie ntado r: Do uto ra Paula Luísa Fe rnande s

ii FICHA CATALO GRÁFICA

REFERÊNCIA BIBLIO GRÁFICA

Camacho , S.C.S. 2012. Estudo se ro ló g ico no co mpo rtame nto do vírus influe nza A e B na po pulação do Arquipé lag o da Made ira. Disse rtação (Me strado e m Bio química, Espe cialidade e m Bio química Aplicada), Unive rsidade da Made ira, Po rtug al, 133 pp.

Camacho , Sílvia Cristina Sardinha

Estudo sero ló gico no co m po rtam e nto do vírus influe nza A e B na po pulação do Arquipélago da Made ira.

Sílvia Cristina Sardinha Camacho – Funchal, 2012. 123 pp., 33 figuras, 35 t abelas

Orie ntado r: Pro fe sso r Do uto r Migue l Âng e lo Alme ida Pinhe iro de Carvalho Co -o rie ntado r: Do uto ra Paula Luísa Fe rnande s

Disse rtação (me strado ) – Unive rsidade da Made ira – Me strado e m Bio química Aplicada

iii Quando fo r de sco be rto o re mé dio pre ve ntivo co ntra a g ripe ,

as g e raçõ e s futuras nunca mais po de rão no s e nte nde r. Gripe é uma das triste zas o rg ânicas mais irre cupe ráve is, e nquanto dura.

Te r g ripe é ficar sabe ndo de muitas co isas que , se não fo sse m sabidas, nunca pre cisariam te r sido sabidas. É a e xpe riê ncia da catástro fe inútil, de uma catástro fe se m trag é dia. É um lame nto co varde que só o utro gripado co mpre e nde . Co mo po de rão o s futuro s ho me ns e nte nde r que te r g ripe no s e ra uma co ndição humana? So mo s g ripado s, futurame nte suje ito s a um julgame nto se ve ro o u iró nico .

iv NO RMALIZAÇÃO ADO PTADA

Esta disse rtação e stá de aco rdo co m as no rmas e stabe le cidas:

Re fe rê ncias: adaptado de Inte rnatio nal Co m m itte e o f Me dical Jo urnals Edito rs (Vanco uve r).

Abre viaturas do s título s do s pe rió dico s de aco rdo co m List o f Jo urnals inde xe d in Inde x Me dicus (1992).

v BHQ 1 - (do ing lê s, b lac k ho le q ue nc he r-1)

CC - Ce ntro s Co labo rado re s (do ing lê s, Co llab o rating Ce ntre s)

CDC - Ce ntro s de Co ntro lo e Pre ve nção de Do e nças (do ing lê s, Ce nte rs fo r Dise ase Co ntro l and Pre ve ntio n)

CES - Co m issão de Ética para a Saúde

CLSI - Instituto de Padrõ e s Clínico s e Labo rato riais (do ing lê s, Clinic al and Lab o rato ry Standards Institute)

CNG - Ce ntro Nacio nal da Gripe

CNI - Ce ntro s Nacio nais de Influe nza (do ing lê s, Natio nal Influe nz a Ce ntre s) CP - Cro ssing po int

cRNA - Ácido ribo nucle ico co m ple me ntar

Ct - Cyc le thre sho ld

DGS - Dire cção -Ge ral da Saúde

ECDC - Ce ntro Euro pe u de Co ntro lo e Pre ve nção de Do e nças

ELISA - Ensaio im uno e nzim ático indire cto

FAM - 6-carbo xifluo re sce ína

HA - He mag lutinina

IAV Vírus influe nza A

IBV Vírus influe nza B

IF - Im uno flo re scê ncia indire cta

IgG - Im uno g lo bulina G

IgM - Im uno g lo bulina M

IH - Te ste de inibição da he mag lutinação

IMC - Índice de m assa co rpo ral INE Instituto Nacio nal de Estatística

INSA - Instituto Nacio nal de Saúde Dr. Ricardo Jo rg e

IRA - Infe cçõ e s Re spirató rias Ag udas

LRE - Labo rató rio s de Re g ulação Esse ncial (do ing lê s, Esse ntial Re g ulato ry Lab o rato rie s) M1 - Pro te ína de m atriz

M2 - Pro te ína do canal ió nico

m RNA - Ácido ribo nucle ico m e nsag e iro

NA - Ne uram inidase

NEP - Pro te ína de e xpo rtação nucle ar

NLS - Sinais de lo calização nucle ar

vi O MS - Org anização Mundial de Saúde (do ing lê s, Wo rld He alth O rg aniz atio n)

O NSA - Obse rvató rio Nacio nal da Saúde

O RF - Fase s de le itura abe rta (do ing lê s, o pe n re ading frame) PA - Pro te ína acídica

PB1 - Pro te ína básica 1 da po lim e rase

PB2 - Pro te ína básica 2 da po lim e rase

PCR - Re acção e m cade ia da po lime rase

PRV - Pro g ram a Re g io nal de Vacinação

r.p.m . - Ro taçõ e s po r m inuto

RAM - Re g ião Autó no m a da Made ira

RF - Facto r re um ató ide

Rn - Sinal fluo re sce nte

RNA - Ácido ribo nucle ico

RNP - Ribo nucle o pro te ína

RT-PCR - Re acção e m cade ia da po lime rase co m transcrição re ve rsa

SESARAM - Se rviço de Saúde da Re g ião Autó no m a da Made ira, E.P.E.

-ssRNA - Ácido ribo nucle ico de cade ia sim ple s de po laridade ne g ativa (do ing lê s, po sitive -se n-se sing le -strande d RNA)

TMB - 3, 3’, 5, 5’ – te tram e tilbe nzidina

TRDIs - Te ste s Rápido s para Diag nó stico da Influe nza

VE - Unidade s Viro te ch

vRNA - Ácido ribo nucle ico viral

vii As infe cçõ e s re spirató rias de e tio lo g ia viral co nstitue m um pro ble ma alarmante de Saúde Pública, se ndo re spo nsáve is pe lo e le vado e co nstante aume nto do s índice s de mo rbimo rtalidade re g istado s no Mundo asso ciado s ao vírus influe nza.

O pre se nte e studo te ve co mo o bje tivo avaliar a pre valê ncia do s antico rpo s Ig G e Ig M e m so ro s de ute nte s co m re quisiçõ e s para análise s se ro ló g icas ao vírus influe nza A e B. Os ute nte s fo ram ate ndido s e ntre 1 de Abril de 2009 e 30 de Abril de 2011. Outro o bje ctivo fo i de te rminar a e pide mio lo g ia do vírus pandé mico A (H1N1) 2009 no s indivíduo s co m sinto mato lo g ia de gripe durante o pe río do e ntre Julho de 2009 e Julho de 2010 utilizando a té cnica de RT-PCR e m amo stras de e xsudado (o u aspirado ) naso faríng e o .

Te ndo po r base o unive rso de amo strag e m de 981 indivíduo s, co nstato u-se que 10,7 e 8,2% da po pulação analisada apre se nta valo re s po sitivo s de antico rpo s Ig M e Ig G indicativo s de infe cção pe lo vírus influe nza A e B, re spe ctivame nte .

Co nstato u-se , també m, que e ntre o s 1934 indivíduo s subme tido s a pro ce dime nto s de diag nó stico labo rato rial para a de te cção de infe cção pe lo vírus pandé mico A (H1N1) 2009, ce rca de 747 (38,6%) e stavam infe ctado s.

Ve rifico u-se que , a po pulação mais jo ve m fo i mais susce ptíve l à infe cção pe lo vírus influe nza A (H1N1) 2009. Isto dife re da típica é po ca de g ripe sazo nal, na qual as pe sso as mais ido sas e stão mais pro pe nsas a to rnare m-se infe ctadas e a de se nvo lve r do e nça g rave po r influe nza A e / o u B.

A pre valê ncia de g ripe na RAM é re duzida – um do s aspe cto s plausíve is que justifique m e sta afirmação po de rá de ve r-se às caracte rísticas g e né ticas da po pulação da RAM e studada. Embo ra se ja de e le vada re le vância salie ntar que o Pro g rama Re g io nal de Vacinação (PRV) da RAM te m alcançado re co nhe cime nto nacio nal e inte rnacio nal de vido às e xce le nte s taxas de co be rtura vacinal, fruto da atitude e ntre cidadão s e pro fissio nais de saúde .

viii Re spirato ry infe ctio ns o f viral e tio lo g y are an alarming pro ble m in te rms o f Public He alth and it is re spo nsible fo r the hig h and incre asing o f mo rbidity and mo rtality rate s re co rde d in the wo rld asso ciate d with the influe nza virus.

The pre se nt study aime d to e valuate the pre se nce o f Ig G and Ig M antibo die s in patie nts se rum with re que sts fo r viral se ro lo g y analysis ag ainst influe nza A and B. The patie nts we re atte nde d be twe e n April 1, 2009 and April 30, 2011. Ano the r aim was to de te rmine the e pide mio lo g y o f the pande mic virus A (H1N1) 2009 o f individuals with sympto ms o f influe nza during the pe rio d be twe e n July 2009 and July 2010 by RT-PCR in sample s o f naso pharyng e al e xudate (o r aspirate d).

The 981 sample s analyze d allo w us to co nclude that 10.7 and 8.2% o f the studie d po pulatio n o f Made ira sho ws co nce ntratio ns o f po sitive Ig M and IgG antibo die s indicating the infe ctio n by influe nza A and B, re spe ctive ly.

It was fo und also that amo ng 1934 individuals unde rg o ing diag no stic labo rato ry pro ce dure s fo r de te ctio n o f infe ctio n with pande mic virus A (H1N1) 2009, abo ut 747 (38.6%) we re infe cte d. It was o bse rve d that the yo ung e r po pulatio n was mo re susce ptible to infe ctio n with influe nza A (H1N1) 2009. This diffe rs fro m a typical influe nza A se aso n, in which o lde r pe o ple g e ne rally be co me infe cte d and de ve lo p se rio us illne ss fro m influe nza A and / o r B.

The pre vale nce o f influe nza in the RAM is re duce d – o ne o f the plausible justificatio ns o f this claim may be due to ge ne tic characte ristics o f the studie d po pulatio n o f RAM. Altho ug h it is e xtre me ly impo rtant to no te that the Re g io nal Pro g ram o f Immunizatio n o f RAM has achie ve d natio nal and inte rnatio nal re co g nitio n due to the e xce lle nt co ve rag e rate s, re sult o f the attitude amo ng citize ns and he alth pro fe ssio nals.

ix

Ficha catalo g ráfica ii

No rm alização ado ptada iv

Lista de acró nim o s e unidade s v

Re sum o vii

Abstract viii

Índice ix

Capítulo 1. Enquadram e nto do pro je cto e o bje ctivo s 1

1.1. Justificativas 1

Capítulo 2. Re visão biblio g ráfica 3

2.1. O vírus 3

2.1.1. Classificação 3

2.1.2. Mo rfo lo g ia 4

2.1.3. Mate rial ge né tico 4

2.1.4. Ciclo de re plicação 7

2.1.4.1. Adso rção do vírus influe nza à cé lula ho spe de ira 7 2.1.4.2. De se mpaco tame nto das ribo nucle o pro te ínas virais (vRNPs) e transpo rte para o

núcle o

8

2.1.4.3. Transcrição (pro dução de vm RNA) 9

2.1.4.4. Re plicação do ge no m a viral 10

2.1.4.5. Expo rtação das RNPs do núcle o 14

2.1.4.6. Pro dução das pro te ínas 14

2.1.4.7. Empaco tame nto do vírus 14

2.1.4.8. Budding e libe rtação de no vo s vírus 15

2.1.5. Estrutura antigé nica 16

2.1.5.1. He m ag lutinina 16

2.1.5.2. Ne uram inidase 17

2.1.6. No m e nclatura 17

2.1.7. Variação antig é nica 20

2.1.8. Epide m io lo g ia 21

2.1.9. Pato g e nia e pato lo g ia 22

2.1.10. Manife staçõ e s clínicas e co mplicaçõ e s 23

2.1.11. Te rapia e pro filaxia 23

2.1.12. Diag nó stico 25

2.1.12.1. Ensaio im uno e nzim ático indire cto (ELISA) 27

2.1.12.1.1. Princípio do te ste 28

2.1.12.1.2. Avaliação do te ste 28

2.1.12.2. Re acção e m cade ia da po lime rase co m transcrição re ve rsa (RT-PCR) 30

x

3.1. Am o strage m 33

3.1.1. Ide ntificação das am o stras 33

3.1.2. Co lhe ita das am o stras 33

3.1.2.1. De te cção da infe cção pro vo cada pe lo vírus influe nza A e influe nza B 33 3.1.2.2. De te cção da infe cção pro vo cada pe la g ripe A (H1N1) 2009 34

3.2. Mé to do s 35

3.2.1. Te ste ELISA 35

3.2.2. Exe cução da RT-PCR 38

3.2.2.1. Tratame nto das am o stras 38

3.2.2.2. Extracção e m co luna do RNA viral 39

3.2.2.3. RT-PCR 40

3.3. Análise e statística e e xplo rató ria do s dado s 42

Capítulo 4. Análise e inte rpre tação dos re sultado s 44

4.1. De te cção da infe cção pro vo cada pe lo vírus influe nza A e influe nza B 44

4.1.1. Taxa de pre valê ncia 49

4.1.2. Caracte rísticas de mo g ráficas 49

4.1.2.1. Estrutura e tária 50

4.1.2.2. Estrutura se xual 54

4.1.3. Distribuição g e o g ráfica 58

4.1.4. Distribuição te m po ral 60

4.1.5. Manife staçõ e s clínicas 62

4.1.6. Infe cçõ e s co nco m itante s 64

4.2. De te cção da infe cção pro vo cada pe la g ripe A (H1N1) 2009 65

4.2.1. Taxa de pre valê ncia 66

4.2.2. Caracte rísticas de mo g ráficas 67

4.2.2.1. Estrutura e tária 67

4.2.2.2. Estrutura se xual 69

4.2.3. Distribuição te m po ral 70

Capítulo 5. Discussão 72

5.1. Infe cção pe lo vírus influe nza A e B 72

5.1.1. Pre valê ncia 76

5.1.2. Caracte rísticas de mo g ráficas 78

5.1.2.1. Estrutura e tária 78

5.1.2.2. Estrutura se xual 82

5.1.3. Distribuição g e o g ráfica 85

5.1.4. Distribuição te m po ral 88

5.1.5. Manife staçõ e s clínicas 89

5.2. Infe cção pe lo vírus pandé m ico A (H1N1) 2009 91

xi

5.2.2.2. Estrutura se xual 95

5.2.3. Distribuição te m po ral 97

5.2.4. Vacinação 99

Capítulo 6. Co nside raçõe s ge rais e pe rspe ctivas futuras 100

6.1. Co nside raçõ e s g e rais 100

6.2. Pe rspe ctivas futuras 101

Capítulo 7. Ag rade cim e nto s 103

Capítulo 8. Re fe rê ncias biblio g ráficas 105

Capítulo 9. Ane xo s 118

9.1. Ensaio im uno e nzim ático indire cto (ELISA) 118

9.1.1. Co nte údo e co m po sição do kit de te ste de ELISA 118 9.1.2. Esque ma de re alização do te ste influe nza A/ influe nza B ELISA Ig G/ Ig M 119 9.2. Re acção e m cade ia da po lime rase co m transcrição re ve rsa (RT-PCR) 119 9.2.1. Co nte údo e co m po sição do kit usado para a e xtracção de RNA viral do vírus da g ripe

A pandé m ica (H1N1) 2009 119

9.2.2. Co nte údo e co mpo sição do kit usado na RT-PCR do vírus da g ripe A pandé m ica

(H1N1) 2009 120

9.3. Estatística 121

-1-

1. ENQ UADRAMENTO DO PRO JECTO E O BJECTIVO S

As Infe cçõ e s Re spirató rias Agudas (IRA) de e tio lo g ia viral co nstitue m um pro ble ma alarmante de Saúde Pública, se ndo re spo nsáve is pe lo co nstante incre me nto do s índice s de mo rbimo rtalidade re g istado s no Mundo [1] asso ciado s – ape sar do s inúme ro s se ro tipo s de vírus re spo nsáve is po r e stas infe cçõ e s ao vírus influe nza. Tal situação de ve -se , e m parte , à sua e le vada transmissibilidade e ntre indivíduo s, -se m re spe itar faixas e tárias. A dive rsidade de ag e nte s e tio ló g ico s justifica que as IRAs re pre se nte m, indubitave lme nte , um do s maio re s pro ble mas da saúde pública mundial [1].

Numa pe rspe ctiva e pide mio ló g ica, a g ripe co ntinua a co lo car grande s de safio s so ciais, clínico s e e co nó mico s, ape sar do s pro g re sso s ve rificado s na sua co mpre e nsão [2]. De facto , e xiste muita info rmação dispo níve l so bre a histó ria, e strutura e pato g é ne se do s vírus influe nza, e mbo ra co ntinue a se r impo ssíve l pre ve r quando e o nde surg irá a pró xima pande mia [2]. Ne stas circunstâncias, a ne ce ssidade de ide ntificar e co ntro lar rapidame nte e ste s ag e nte s pato g é nico s particularme nte pe rig o so s, de te rmina o s e sfo rço s de se nvo lvido s na mo nito rização e vig ilância das e stirpe s e m circulação [3].

O pre se nte e studo , re alizado no âmbito do Me strado de Bio química Aplicada, fo i de se nvo lvido na Se cção de Se ro lo g ia do Labo rató rio de Pato lo g ia Clínica do Ho spital Dr. Né lio Me ndo nça. Ne sta se cção re aliza-se o diagnó stico se ro ló g ico da infe cção pro vo cada pe lo vírus influe nza A e B, co m re curso a té cnicas de e nsaio imuno e nzimático (ELISA), imuno flo re scê ncia (IF) e a re acçõ e s e m cade ia da po lime rase se g uidas po r transcriptase re ve rsa (RT-PCR).

1.1.JUSTIFICATIVAS

-2-

Se g undo a Org anização Mundial de Saúde (OMS), as e pide mias anuais de influe nza infe ctam - e m paíse s de se nvo lvido s - ce rca de 10 a 20% da po pulação saudáve l, aume ntando as taxas de ho spitalização (asso ciada à do e nça fe bril) o u e m caso s e xtre mo s, re sultando na mo rte do indivíduo . Este de sfe cho o co rre e m co nse quê ncia de uma pne umo nia primitiva de spo le tada pe lo vírus influe nza e / o u po r infe cçõ e s bacte rianas o po rtunistas.

De ste mo do , e spe ra-se que e ste e studo co nstitua um co ntributo iné dito so bre o te ma na Re g ião Autó no ma da Made ira (RAM), pre e nche ndo as lacunas e xiste nte s ne sta áre a de inve stig ação .

Ne ste co nte xto , o principal o bje ctivo de ste pro je cto é avaliar a pre valê ncia do vírus influe nza A e B numa amo strag e m po pulacio nal made ire nse . Para tal, re co rre u-se às té cnicas de ELISA e RT-PCR para quantificar e ide ntificar o s ag e nte s e tio ló g ico s causado re s da do e nça nas amo stras que e ntraram na Se cção de Se ro lo g ia do Labo rató rio de Pato lo g ia Clínica do Ho spital Dr. Né lio Me ndo nça, e ntre Abril de 2009 e Abril de 2011.

Os o bje ctivo s e spe cífico s de ste e studo fo ram o s se guinte s:



Estudar a distribuição da infe cção nas dife re nte s faixas e tárias;



Analisar a distribuição da infe cção de aco rdo co m o se xo ;



Estudar a distribuição g e o g ráfica do vírus da g ripe na RAM;



Avaliar a sazo nalidade e o s pico s de pre valê ncia do vírus;



Inve stig ar o s tipo s de sinto mas mais fre que nte s;



Ide ntificar e quantificar o s tipo s de vírus influe nza;



Avaliar a mo rbilidade e mo rtalidade na co munidade ;

-3- 2. REVISÃO BIBLIO GRÁFICA

O vírus influe nza, po pularme nte de sig nado “vírus da g ripe ” é o principal re spo nsáve l po r uma das do e nças mais antig as e co muns co nhe cidas pe lo Ho me m. As prime iras de scriçõ e s de infe cção pe lo vírus influe nza o co rre ram po r vo lta do sé culo 5 a.C.. Hipó crate s re lato u caso s de uma do e nça re spirató ria que , co m uma duração de alg umas se manas, fo i re spo nsáve l pe la mo rte de indivíduo s po te ncialme nte infe ctado s.

Estão datadas e do cume ntadas, pe lo me no s, trê s pande mias (1918, 1957 e 1968), durante o sé culo XX [6,7]. Em 1918 o co rre u uma pande mia causada pe lo subtipo H1N1 que fico u co nhe cida co mo a g ripe e spanho la. Em 1957, o vírus H1N1 de sapare ce u, te ndo surg ido e ntre tanto um no vo vírus, o subtipo H2N2, re spo nsáve l pe la de no minada g ripe asiática. O surg ime nto do subtipo H3N2 e m 1968 de spo le to u uma no va pande mia co nhe cida co mo a g ripe de Ho ng Ko ng [8]. A prime ira fo i caracte rizada co mo a pio r pande mia da histó ria, cuja mo rtalidade ating iu e ntre 50 a 100 milhõ e s de indivíduo s [7]. Esta pande mia fo i re fe re nciada co mo "O maio r ho lo causto mé dico da histó ria", e stimando -se que te nha sido re spo nsáve l pe la mo rte de tanto s indivíduo s quanto o s que fale ce ram aquando do surg ime nto da pe ste ne g ra o u da Prime ira Gue rra Mundial [9].

2.1. O vírus

2.1.1. Classificação

O ag e nte e tio ló g ico da g ripe é o vírus influe nza, Myxo virus influe nz ae, um me mbro da família Ortho myxo viridae. Os vírus influe nza são classificado s no s tipo s A, B e

“ (…) um a infe c ção viral q ue afe c ta princ ipalm e nte o nariz, g arg anta, b rô nq uio s e , o c asio nalm e nte , o s pulm õ e s.

(…) é transm itida fac ilm e nte de pe sso a para pe sso a atravé s de g o tíc ulas e partíc ulas pe q ue nas pro duz idas q uando as pe sso as infe c tadas to sse m o u e spirram ” .

OMS, Org anização Mundial de Saúde

“ As e le vadas taxas de m utaç ão e a fac ilidade de disse m inaç ão do vírus c o nduz iram ao suce sso e pide m io ló g ic o do vírus, re spo nsáve l po r 3 a 5 m ilhõ e s de c aso s de do e nça g rave e pe la m o rte de 250.000 a 500.000 pe sso as e m to do o m undo , anualm e nte ”.

OMS, Org anização Mundial de Saúde

“ (…) a g ripe c o ntinua a c o lo c ar g rande s de safio s so c iais, clínic o s e e c o nó m ic o s, ape sar do s im e nso s pro g re sso s ve rificado s no c o nhe c im e nto asso c iado às c iê nc ias da saúde ”.

-4-

C, atravé s das dife re nças antig é nicas e ntre duas das suas pro te ínas e struturais, no me adame nte a pro te ína de matriz (M1) e a nucle o pro te ína (NP). Re ssalve -se que ape nas o s tipo s A e B tê m re le vância clínica e m humano s [10]. Os vírus influe nza B e C não e stão dividido s e m subtipo s [10], o que não suce de co m o vírus influe nza A, cujo s subtipo s variam e m função das caracte rísticas de duas g lico pro te ínas, de signadame nte he mag lutinina (HA) e ne uraminidase (NA) - pre se nte s na supe rfície do e nve lo pe lipídico [10].

O vírus influe nza A fo i iso lado pe la prime ira ve z e m 1933, e nquanto o tipo B iso lo u-se e m 1940 e o tipo C e m 1950 [11].

2.1.2. M o rfo lo g ia

Do po nto de vista mo rfo ló g ico , as partículas virais da influe nza são e sfé ricas, apre se ntando um diâme tro de 80 a 120 nm [12]. São ple o mó rficas, po de ndo te r fo rmas e sfé ricas o u filame nto sas. As pro je cçõ e s e xte rio re s da supe rfície do vírus, visíve is na fig ura 1, co rre spo nde m a duas g lico pro te ínas distintas, a HA e a NA. A supe rfície e xte rio r do vírus é pro te g ida po r um e nve lo pe lipídico .

Fig ura 1. Esque ma da e strutura do vírus influe nza A [13].(PB2: pro te ína básica 2 da po lime rase ; PB1: pro te ína básica 1 da po lime rase ; PA: pro te ína ácida da po lime rase ; HA: he mag lutinina; NP: nucle o pro te ína; NA: ne uram inidase ; M: pro te ína de matriz; NS: pro te ína não -e strutural; M1: pro te ína e strutural; M2: pro te ína do

canal ió nico ).

2.1.3. M ate rial g e né tico

-5-

maio r para o mais pe que no , e mbo ra o se u ve rdade iro arranjo de ntro do virião e sfé rico se ja de sco nhe cido .

Este s se g me nto s co dificam de z pro te ínas, no me adame nte o s po lipé ptido s de po lime rase (PB2, PB1 e PA), as g lico pro te ínas de supe rfície (HA e NA), a nucle o pro te ína (NP), a pro te ína de matriz (M1), a pro te ína do canal ió nico (M2), a pro te ína anti-inte rfe rão não e strutural (NS1) e a pro te ína de e xpo rtação nucle ar (NEP) [15].

Cada se g me nto e stá fo rte me nte asso ciado à NP fo rmando uma nucle o cápside he lico idal o u ribo nucle o pro te ína (RNP). A cada se g me nto de RNP (RNA + NP) e stá asso ciado um co mple xo po lime rase co nte ndo trê s po lipé ptido s: PB2, PB1 e PA. O co mple xo de RNA viral (vRNA), da NP, e das trê s pro te ínas da po lime rase de sig na-se co mple xo da ribo nucle o pro te ína viral (vRNP) [16].

Trê s se g me nto s, no me adame nte PB1, PB2 e PA, co dificam as pro te ínas que fo rmam o co mple xo po lime rase . O ge ne da pro te ína básica 2 (PB2), co m 2277 nucle ó tido s na re g ião de co dificação das pro te ínas no se g me nto 1, o g e ne da pro te ína básica 1 (PB1), co m 2271 nucle ó tido s no se g me nto 2 e o g e ne da pro te ína acídica (PA), co m 2148 nucle ó tido s no se g me nto 3 [13]. O prime iro se g me nto de RNA co difica a pro te ína PB2. A PB2, alé m de pe rte nce r ao já re fe rido co mple xo po lime rase , actua durante o início da transcrição de mRNA viral ao re co nhe ce r e lig ar-se à e strutura c ap de mRNA da cé lula ho spe de ira de fo rma a usar e sse mRNA co mo prim e r para a transcrição de mRNA viral [17].

O se g me nto 2 de RNA co difica a pro te ína PB1. A PB1 re pre se nta a transcriptase , a qual catalisa a adição de nucle ó tido s durante a e lo ngação do transcrito de RNA. A pro te ína PA co nstitui uma o utra parte do co mple xo po lime rase juntame nte co m PB2 e PB1, se ndo co dificada pe lo se g me nto 3 e é e sse ncial para a re plicação do g e no ma viral; co ntudo , a sua função não é ainda co nhe cida [17].

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No se g me nto 5 é co dificada a nucle o pro te ína (NP cujo g e ne te m 1494 nucle ó tido s). A pro te ína é transpo rtada para o núcle o da cé lula ho spe de ira, o nde se lig a e e ncapsida o RNA viral [10].

O sé timo se g me nto co difica duas pro te ínas que são transcritas co line arme nte : as pro te ínas de matriz M1 (g e ne co m 756 nucle ó tido s) e M2 (g e ne co m 291 nucle ó tido s). A M1 é a pro te ína mais abundante do virião influe nza e fo rma um invó lucro pro te cto r à vo lta das nucle o cápside s virais de ntro do e nve lo pe lipídico . No inte rio r da cé lula ho spe de ira, é e nco ntrada no cito plasma e no núcle o . A M1 não te m actividade e nzimática co nhe cida, e mbo ra se acre dite se r re le vante na iniciação da mo ntag e m de no vo s vírus. A pro te ína M2 é o utra pro te ína inte g ral da me mbrana que se rve ig ualme nte co mo sinal de transpo rte para a supe rfície ce lular. Funcio na co mo um canal de pro tõ e s, co m o intuito de co ntro lar o pH do co mple xo de Go lg i durante a sínte se de HA, po ssibilitando de sta fo rma, a acidificação do inte rio r do virião e co nse que nte libe rtação das RNPs apó s a e ntrada do vírus na cé lula ho spe de ira [10].

O se g me nto 8 é o me no r se g me nto do g e no ma viral e co difica duas pro te ínas: a pro te ína anti-inte rfe rão não e strutural (NS1) (g e ne co m 690 nucle ó tido s) e a pro te ína de e xpo rtação nucle ar (NEP) (g e ne co m 363 nucle ó tido s), po ste rio rme nte co nhe cida co mo NS2. Estas pro te ínas são abundante s na cé lula ho spe de ira, mas a NS1 não se e nco ntra no virião . Ambas as pro te ínas tê m funçõ e s na re plicação e e xpre ssão viral, e mbo ra e stas não se jam co mple tame nte co nhe cidas até à data. No e ntanto , sabe -se que a NS2 quando asso ciada à matriz é re spo nsáve l pe lo transpo rte do co mple xo RNP do núcle o para o cito plasma, e nquanto a NS1 afe cta o transpo rte , tradução e splic ing de RNA [13].

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Tabe la 1. Principais funçõ e s das pro te ínas re sultante s do s transcrito s do s 8 se g m e nto s do g e no m a

do vírus influe nza [18].

Se g m e nto de RNA

De sig nação da prote ína

Tam anho (nº de nucle ótidos)

Pe so m ole cular da prote ína (KDa)

Tam anho (nº de

am inoácidos) Função

1 _PB2 2277 85,7 759 Sub unidade de lig ação ao

c ap

2 _PB1 2271 86,5 757 _{Sub unidade de e lo ng ação}

3 _PA 2148 84,2 716 Sub unidade impo rtante na

re plicação do g e no ma

4 _HA 1698 61,5 566 Me de ia a ade são do vírus às

cé lulas

5 _NP 1494 56,1 498 Co nd uz à o rde nação

he lico id al d a nucle o c ápside

6 _NA 1407 50 469 _{Libe rtação do s vírus}

7 M1 756 27,8 252 Pro te ína e strutural

M2 291 11 97 Canal ió nico no e nve lo pe

8 NS1 690 26,8 230

Transpo rte d o RNA ce lular, splic ing e trad ução

NS2 363 14,2 121 _{Funç ão de sco nhe c ida}

2.1.4. Ciclo de re plicação

2.1.4.1. Adso rção do vírus influe nz a à cé lula ho spe de ira

A adso rção o co rre po r lig ação e spe cífica de uma pro te ína do virião (anti-re ce pto r) a um co nstituinte da supe rfície ce lular (re ce pto r). As mo lé culas anti-re ce pto ras po de m se r pro te ínas, g e ralme nte glico pro te ínas (mo lé culas e spe cíficas) o u g lico lípido s (me no s e spe cífico s). Quando as partículas víricas da influe nza e ntram e m co ntacto co m a cé lula ho spe de ira te nde m a lig ar-se ao s g rupo s te rminais do ácido N-ace til ne uramínico (ácido siálico ) do s re ce pto re s ce lulare s atravé s da HA [19].

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Fig ura 2. Esque m a ilustrativo do ciclo de re plicação do vírus influe nza [21].

2.1.4.2. De se m paco tam e nto das rib o nucle o pro te inas virais (vRNP) e transpo rte

para o núcle o

Os e ve nto s que o co rre m apó s a pe ne tração do vírus de sig nam-se po r de se mpaco tame nto . Ne ste , o capsíde o é re mo vido e o g e no ma viral é e xpo sto , g e ralme nte so b a fo rma de um co mple xo nucle o pro te ico . No caso do s vírus que são re plicado s no núcle o , o g e no ma e stá fre que nte me nte asso ciado à NP, de ve ndo se r transpo rtado atravé s da me mbrana nucle ar. O capsíde o é transmo vido ao lo ng o do cito e sque le to , de sde o sítio de e ntrada até ao po ro nucle ar. Ne sse mo me nto , o RNA viral é libe rtado para de ntro do núcle o co m a de sinte g ração do capsíde o vazio [16].

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cito plasma. Po r fim, o e ndo sso ma funde -se co m um liso sso ma, o nde o s re sto s virais são de struído s [22].

As ribo nucle o pro te ínas (RNPs) são libe rtadas do e ndo sso ma quando o pH e ndo sso mal diminui até 5,0, activando o s canais ió nico s virais (as pro te ínas M2), re spo nsáve is pe lo transpo rte do s pro tõ e s para o inte rio r da partícula vírica, pro mo ve ndo o de se mpaco tame nto , atravé s da de stabilização as pro te ínas de matriz (M1) [16]. As pro te ínas víricas M1 so fre m e ntão mudanças co nfo rmacio nais, se guidas pe la disrupção das inte racçõ e s M1 – vRNP e re arranjo s co nfo rmacio nais na he mag lutinina. As me mbranas viral e e ndo sso mal funde m-se e as vRNPs individuais são libe rtadas para o cito plasma ce lular [16].

A impo rtação para o núcle o atravé s do po ro nucle ar é me diada po r sinais de lo calização nucle ar (NLS), re alizado pe las NP. As partículas virais incapaze s de se fundir co m a me mbrana, a e xe mplo do s viriõ e s co m de fe ito no s canais de iõ e s M2, são de g radado s no s liso sso mas [16].

2.1.4.3. Transcrição (Pro dução de vm RNA)

O pro ce sso de transfe rê ncia da info rmação e spe cífica do RNA viral para o RNA me nsag e iro (mRNA) é de sig nado po r transcrição . Co ntrariame nte à maio ria do s vírus RNA de se nso ne g ativo , no s quais a sínte se de mRNA o co rre no cito plasma, a transcrição do g e no ma do s vírus influe nza o co rre no núcle o das cé lulas infe ctadas [23]. Os vírus co m po laridade ne g ativa po ssue m uma RNA po lime rase para sinte tizar mRNA.

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trifo sfatado de g uanina que se lig a à e xtre midade 5’ do mRNA. O frag me nto c ap 5’ funcio na co mo prim e r na sínte se do RNA viral de se ntido po sitivo , re alizada pe la PB1, até e nco ntrar o sinal e xiste nte no RNA viral que de te rmine a po liade nilação . A po liade nilação do mRNA viral é po uco vulg ar. O sinal de po liade nilação é uma se quê ncia de 5-7 uridinas na e xtre midade 3’ do RNA viral, a qual é re pe tidame nte co piada até se o bte r ce rca de duze nto s A [26]. Findo e ste pro ce sso , o mRNA viral é libe rtado po ssuindo um c ap do mRNA ce lular e uma cauda po liade nilada.

2.1.4.4.Re plicação do g e no m a viral

Trê s tipo s de RNA viral são sinte tizado s no núcle o ce lular. São e le s o 1) mRNA viral de po laridade po sitiva (mRNA), 2) o RNA g e nó mico viral (vRNA) de po laridade ne g ativa, e 3) o RNA co mple me ntar (vcRNA) de po laridade po sitiva [16] (fig ura 3).

Fig ura 3. Re lação e ntre o RNA ge nó m ico (vRNA), o m RNA e o vcRNA do vírus influe nza [27].

Uma ve z e stabe le cida a sínte se de mRNA, parte do RNA sinte tizado é de dicada à pro dução de có pias de se ntido po sitivo de to do o g e no ma viral, co nhe cida co mo RNA co mple me ntar (vcRNA) [23].

A re plicação do g e no ma viral o co rre atravé s de um pro ce sso re pre se ntado po r do is passo s. Prime irame nte , uma có pia de se ntido po sitivo do vRNA (cRNA) é pro duzida, dado que o s transcrito s mRNA são có pias inco mple tas do vRNA e , subse que nte me nte , não po de m se r usadas co mo substrato s para a sínte se g e nó mica [28]. De sta fo rma, a sínte se de vRNA o co rre atravé s de um cRNA inte rme diário que , po r sua ve z, é usado co mo matriz para pro duzir mais RNA g e nó mico (vRNA)(-), e nquanto que o s vRNAs re ce nte me nte re plicado s são usado s para a pro dução de mais vm RNAs e cRNAs [29]. Co ntrariame nte ao mRNA, a sínte se de cRNA e nvo lve uma iniciação se m prim e r e uma le itura do sinal de po liade nilação para pro duzir có pias inte iras de vRNA te m plate [23].

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mo le culare s e nvo lvido s e o se u pape l na re g ulação da sínte se de RNA viral. Ino po rtuname nte , o me canismo de sínte se de cRNA, um co mpo ne nte me no r mas crucial na sínte se to tal de RNA viral, ainda não é co nhe cido [23]. To das e stas re acçõ e s são catalisadas pe lo co mple xo RNA po lime rase , e mbo ra as funçõ e s de cada subunidade nas dife re nte s e tapas do pro ce sso se jam distintas. O co mple xo RNA po lime rase é re spo nsáve l tanto pe la transcrição co mo pe la re plicação do vRNA g e nó mico [29], e xistindo apro ximadame nte 30 a 60 có pias de sta po lime rase po r vírus. O co mple xo é co mpo sto po r 3 pro te ínas (PB1, PB2, e PA), de sig nadas co le ctivame nte pro te ínas P (P de po lime rase ). A de no minação atribuída à PB1, PB2 e PA de riva das co ndiçõ e s e m que e stas pro te ínas fo ram iso ladas, se ndo que A re fe re -se a ácido e B a base . A transcrição do RNA e nvo lve as pro te ínas PB1 e PB2 e a re plicação do ge no ma re que r as subunidade s PB1 e PA do co mple xo RNA po lime rase [16].

A sínte se do RNA re que r quatro pro te ínas virais: as trê s subunidade s da RNA po lime rase e a pro te ína de lig ação NP [23]. A actividade do co mple xo po lime rase é be m co nhe cida, durante a transcrição do s se g me nto s vRNA, e mbo ra as funçõ e s das pro te ínas PB1 e PB2 e ste jam me lho r caracte rizadas do que as de PA.

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de finição da g ama de ho spe de iro s [26]. A pro te ína PB1, a maio r das duas pro te ínas básicas, co dificada pe lo se g me nto 2, actua co mo a ânco ra do co mple xo po lime rase , co nte ndo sítio s de lig ação inde pe nde nte s para a PB2 e PA, se ndo ig ualme nte capaz de lig ar-se à NP [23].

Aplicaçõ e s de cro ss-linking co m ultra-vio le ta tê m sido amplame nte utilizadas na análise da actividade de lig ação da PB1 e co rro bo ra o se u pape l ce ntral na função po lime rase . Se gundo um e studo re alizado , o po lipé ptido fo i e nco ntrado e m e stre ita asso ciação co m o s nucle ó tido s acre sce ntado s à e xtre midade 3’ do prim e r durante a iniciação e e lo ngação da transcrição do mRNA [23], funcio nando co mo uma RNA-po lime rase / RNA de pe nde nte na catálise da e lo ng ação da cade ia de RNA [26]. Este s dado s fo rne ce m e vidê ncias de que PB1 é de facto re spo nsáve l pe la adição se que ncial do s nucle ó tido s, durante o alo ng ame nto da cade ia de RNA. A PB1 é uma e ndo nucle ase re spo nsáve l po r iniciar a transcrição e a re plicação lig ando -se às e xtre midade s 3’ e 5’ do RNA viral (vRNA) e do RNA co mple me ntar (cRNA), re spe ctivame nte [26]; fo rmando o s amino ácido s 508 a 522, o sítio activo [35, 23].

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transcrição e na re plicação do g e no ma viral, dado que a po lime rase não co nse gue usar e fe ctivame nte to do o g e no ma viral co mo matriz. Co nco mitante me nte , a NP e stá implicada na re gulação do switc h e ntre a transcrição e a re plicação do g e no ma [23]. Expe riê ncias e vide nciaram a lig ação e ntre NP durante o alo ng ame nto das cade ias [16]. A adição de NP durante a sínte se das no vas cade ias, fo rma o sinal de po liade nilação não re co nhe cido o co rre ndo , a sínte se de to do o se g me nto do g e no ma viral. As pro te ínas NP pro mo ve m també m a iniciação da transcrição se m prim e r e blo que iam a sínte se de mRNAs virais [16]. A acumulação de NP no núcle o induz o ciclo re plicativo do vRNA. Ne sta situação tanto na pro dução do cRNA co mo no vRNA não é ne ce ssário um prim e r (lo g o não inte rvé m a PB2), co me çando a subunidade PB1 a po lime rização da cade ia co mple me ntar, o nde há suce ssivame nte a adição de NP à cade ia e m cre scime nto [16]. A NP é fo sfo rilada, e stando o padrão de fo sfo rilação de pe nde nte das cé lulas ho spe de iras e re lacio nado co m a gama de ho spe de iro s do vírus [17].

Adicio nalme nte , a NP é o alvo principal da re spo sta cito tó xica po r parte do s linfó cito s T do ho spe de iro , g e rado s apó s a infe cção po r to do s o s subtipo s de influe nza [17].

No vírus influe nza A e B, de z pro te ínas re sultam da e xpre ssão do s g e ne s no s o ito se g me nto s do g e no ma [15], do s quais se is co dificam uma pro te ína viral, e o s re stante s do is co ntê m duas fase s de le itura abe rta (e m ing lê s o pe n re ading fram e, ORF), co dificando alte rnadame nte as pro te ínas M1 e M2 e as pro te ínas NS1 e NS2 [16]. A sínte se de RNA o co rre no núcle o po ssibilitando o splic ing dife re ncial o bse rvado e m do is do s mRNA [27] (fig ura 4). Os se g me nto s 7 e 8 co dificam, cada um, duas pro te ínas de vido ao splic ing. A M2 e a NS2 são o s pro duto s splic e d e g e ralme nte são e nco ntrado s e m muito me no r abundância que M1 e NS1 [19].

-14- 2.1.4.5. Expo rtação das RNPs do núcle o

Os mRNAs virais sinte tizado s são e xpo rtado s do núcle o para o cito plasma via po ro s nucle are s, num pro ce sso auxiliado pe las pro te ínas M1 e NS2 [19]. Ape nas as vRNPs de se nso ne g ativo são e xpo rtadas do núcle o [19].

2.1.4.6. Pro dução das pro te ínas

Ne sta fase as pro te ínas PB2, PB1, PA, NP, NS1, NS2, e M1 são pro duzidas no cito plasma ce lular [16]. A sínte se das pro te ínas M2, HA e NA é re alizada po r ribo sso mas lig ado s às me mbranas do re tículo e ndo plasmático . Po ste rio rme nte e stas pro te ínas se rão inse ridas no re tículo e ndo plasmático , g lico siladas e transpo rtadas para o apare lho de Go lg i [25]. To do s o s o utro s mRNAs vão se r traduzido s po r ribo sso mas cito plasmático s.

As pro te ínas PB2, PB1, PA e NP são impo rtadas para o núcle o o nde catalisam to da a sínte se de cRNA (+) e po ste rio rme nte de vRNA (-), ambas sinte tizadas so bre a fo rma de vário s frag me nto s de nucle o cápside s [25]. Uma ve z sinte tizadas no vas cade ias de vRNA, e ntram para a via de sínte se de no vo s mRNAs. As pro te ínas M1 e NS1 são ig ualme nte transpo rtadas para o núcle o .

2.1.4.7.Em paco tam e nto do vírus

Apó s a re plicação do RNA viral e a sínte se das suas pro te ínas, e stas mo lé culas ag rupam-se no núcle o da cé lula ho spe de ira para fo rmar co mple xo s de vRNPs [16] que mig ram para a me mbrana ce lular. É o re sultado da lig ação das pro te ínas PB1, PB2, PA, NP e NS2 de no vo ao s vRNAs.

As mo lé culas de M1 lig am-se a no vo s RNAs virais fo rmando o s co mple xo s M1-vRNP [16], e catalisam o transpo rte das vRNPs para o cito plasma induzindo a parag e m da sínte se de no vo s mRNAs virais. As mo lé culas de NS2 pro mo ve m a e xpo rtação nucle ar das no vas vRNPs para o cito plasma. As M1 també m inibe m a impo rtação do s co mple xo s de vRNP, impe dindo as re cé m-sinte tizadas vRNPs asso ciadas à pro te ína M1 de re to rnar ao núcle o [16]. As pro te ínas HA, NA e M2 são transpo rtadas para a supe rfície da cé lula se ndo inco rpo radas na me mbrana plasmática, fo rmando po ste rio rme nte o e nve lo pe . As nucle o cápside s víricas asso ciadas às pro te ínas M1 e NS2 são transpo rtadas para a supe rfície ce lular asso ciando -se às re g iõ e s da me mbrana plasmática que co nté m as pro te ínas virais [25].

-15- 2.1.4.8. Budding e lib e rtação de no vo s vírus

Apó s o abando no do núcle o , o vírus fo rma partículas víricas e sai da cé lula. Co mo a influe nza é um vírus e nve lo pado , utiliza a me mbrana plasmática da cé lula ho spe de ira para fo rmar as partículas víricas que sae m da cé lula e vão infe ctar as cé lulas vizinhas [19].

O pro ce sso de abando no das cé lulas inicia-se co m a inte racção e ntre o s co mple xo s vRNP-pro te ína M1 e as caudas cito plasmáticas das g lico pro te ínas M2, HA, e NA, e stabe le ce ndo uma lig ação e ntre o s co mpo ne nte s do inte rio r do vírus e as pro te ínas da me mbrana [18]. Este pro ce sso co nduz à fo rmação de um bro to no lo cal de mo ntag e m - a me mbrana apical das cé lulas e pite liais po larizadas [16]. Este bro to se para-se da me mbrana ce lular o co rre ndo a libe rtação de um virião no me io e xtrace lular. A mo ntag e m das pro te ínas víricas e o RNA pro duz no vo s vírus que se libe rtam da cé lula infe ctada atravé s da inco rpo ração (“b udding”) da me mbrana plasmática da cé lula infe ctada, pe rmitindo , co nse que nte me nte , a dispe rsão do s vírus re cé m-sinte tizado s para as cé lulas vizinhas.

Alg umas análise s mutacio nais e de de le ção de mo nstraram que a cauda de M2 é e xtre mame nte impo rtante na fo rmação de partículas víricas [19]. A M1, pre se nte so bre a bicamada lipídica, é impo rtante no passo final de fe cho e inco rpo ração (“b udding”) da partícula vírica [19]. A ne uraminidase viral pe rmite a libe rtação do vírus da cé lula ho spe de ira.

A clivag e m do s re síduo s de ácido siálico das g lico pro te ínas e g lico lipído s co nstitui um passo de te rminante que de ve rá o co rre r pre viame nte à saída das partículas víricas re cé m-sinte tizadas atravé s da me mbrana plasmática [24]. A NA re mo ve e nzimaticame nte e ste s re síduo s te rminais do ácido siálico da e strutura glicana na supe rfície da cé lula infe ctada, pro mo ve ndo a libe rtação do s no vo s vírus e a sua dispe rsão para as cé lulas vizinhas não infe ctadas. Se m e ste pro ce sso , a partícula vírica não se rá libe rtada pe la me mbrana plasmática [19].

-16- 2.1.5. Estrutura antig é nica

Duas classe s de antig é nio s e xiste m no s vírus influe nza: o s inte rno s e o s supe rficiais. A NP e a M1 são so bre tudo , antig é nio s inte rno s e spe cífico s de cada tipo de influe nza, e nquanto o s antig é nio s supe rficiais são co nstituído s pe la he mag lutinina e ne uraminidase .

2.1.5.1. He m ag lutinina

O principal antig é nio de supe rfície do vírus é um tríme ro co m e xtro são de 135 Å de co mprime nto fo ra do e nve lo pe [41]. Cada mo nó me ro co nsiste e m duas subunidade s lig adas po r uma po nte dissulfídrica, a HA1 e a HA2 [42], pro duzidas durante a infe cção pe la clivag e m do pre curso r bio ssinté tico , HAO [41]. Esta clivag e m g e ra a re g ião carbo xil-te rminal de HA1 e a amino -xil-te rminal da HA2, de xil-te rminanxil-te s na actividade de fusão co m a me mbrana, co mo co nse quê ncias do carácte r infe ccio so do vírus [41].

Este s ho mo tríme ro s fo rmado s durante a maturação co nsiste m numa haste e numa e xtre midade g lo bular, cujo g ló bulo é co nstituído pe la HA1 e co mpre e nde o lo cal de lig ação ao s re ce pto re s da cé lula ho spe de ira, assim co mo , a maio ria do s alvo s antig é nico s da mo lé cula. A haste é fo rmada pe la HA2 e parte de HA1 e co nté m a se quê ncia hidro fó bica transme mbranar e uma ânco ra cito plasmática. A HA e stá anco rada à me mbrana viral via C-te rminal da subunidade HA2 [42].

As cade ias HA1 e ste nde m-se de sde a base da mo lé cula, atravé s de uma haste fibro sa, até à re g ião distal da me mbrana que co nté m o s sítio s de lig ação do re ce pto r e o s sítio s de lig ação do s antico rpo s de ne utralização da infe ccio sidade [41].

-17-

Figura 5. Estrutura m o no m é rica da he m aglutinina de influe nza A [43, 44].

2.1.5.2. Ne uram inidase

A NA é uma g lico pro te ína de me mbrana inte g ral tipo II co m actividade e nzimática que é vital para a dispe rsão do vírus pe las cé lulas ho spe de iras [45]. A NA co m 469 amino ácido s te m pe lo me no s, cinco po ssíve is sítio s de g lico silação [45].

A NA é no rmalme nte uma pro te ína ho mo te tramé rica e m fo rma de co gume lo e po ssui actividade N-ace til-ne uramino sil-g lico hidro lase [45]. Esta pro te ína po de se r dividida e m quatro re g iõ e s principais, incluindo uma cauda hidro fílica curta amino -te rminal, um do mínio transme mbranar hidro fó bico , uma haste e uma cabe ça g lo bular que co nté m o sítio activo da e nzima [45].

O se g undo antig é nio mais impo rtante da supe rfície do vírus hidro lisa o s ácido s siálico s te rminais do s sialo g licano s. A NA pro mo ve a libe rtação de no vo s vírus a partir da cé lula ho spe de ira infe ctada [46]. A NA po de pro mo ve r a ade são do vírus às cé lulas e pite liais re spirató rias humanas [47]. A de g radação da mucina no tracto re spirató rio pe la NA viral po de e xpo r o s re ce pto re s do ho spe de iro e pro mo ve r a lig ação do vírus [45].

2.1.6. No m e nclatura

As pro prie dade s antig é nicas das duas g lico pro te ínas de me mbrana do vírus influe nza, a HA e a NA e stão na base da classificação do s vírus influe nza A [48,49]. Os subtipo s de he mag lutinina e de ne uraminidase são usado s para classificar as dife re nte s linhag e ns do vírus influe nza do tipo A e as co mbinaçõ e s que re sultam e m dife re nte s g amas de ho spe de iro s e de virulê ncia [24].

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Estudo s de imuno difusão pe rmitiram ide ntificar a e xistê ncia de 16 subtipo s de HA se ro lo g icame nte distinto s, o s quais dife re m e ntre si na co nstituição amino acídica, de no minado s co mo H1 a H16 e 9 subtipo s antig é nico s de NA, de no minado s N1 a N9, o s quais são se ro lo g icame nte distinto s [50]. Esta classificação antig é nica é base ada nas re acçõ e s co m so ro s hipe rimune s anti-HA e anti-NA e fo i re fo rçado pe la se que nciação do s g e ne s virais para HA e NA [49]. Co mparaçõ e s das se quê ncias també m indicam uma subdivisão das HAs e m do is grupo s principais e cinco clade s, co mo se po de o bse rvar na fig ura 6, as quais são a H11, H13 e H16, a H8, H9 e H12, a H1, H2, H5 e H6, a H3, H4 e H14 e a H7, H10 e H15 [51]. Os no ve subtipo s de NA també m fo rmam do is g rupo s se m qualque r re lação g e né tica ó bvia co m o s g rupo s de HA [51].

Figura 6. Filo g e nia do s 16 subtipo s de HA (A) e do s 9 subtipo s de NA (B) [52].

As e stirpe s do vírus influe nza de te ctadas nas várias re g iõ e s do glo bo são classificadas e catalo g adas de aco rdo co m um có dig o o ficial da OMS. Assim de mo do a de no minar o s vírus iso lado s, te m-se e m co nta as se g uinte s caracte rísticas: 1) o tipo antig é nico da NP (A, B o u C); 2) o ho spe de iro de o rig e m (e x: suíno , e quino o u aviário ) quando não e spe cificado que o vírus te m o rig e m humana; 3) a lo calização g e o g ráfica do prime iro iso lame nto (e x: Te xas, Taiwan, Be ijing o u Sydne y); 4) o núme ro labo rato rial da e stirpe , atribuído de aco rdo co m a o rde m cro no ló g ica na qual a e stirpe fo i iso lada, e m de te rminada lo calidade e 5) o ano de iso lame nto . Para alé m disso , o vírus influe nza tipo A, o s subtipo s de HA e NA são discriminado s e ntre parê nte se s.

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[53]. Os re se rvató rio s naturais do vírus influe nza A são o s mamífe ro s e ave s [10],te ndo já sido iso lado s uma varie dade de subtipo s a partir de po rco s, cavalo s e , inclusive , de mamífe ro s marinho s [14]. Os vírus influe nza B e C fo ram iso lado s quase e xclusivame nte de humano s, apre se ntando po te ncial pato gé nico ape nas para o Ho me m se m g rande s implicaçõ e s, po rtanto , na e pide mio lo g ia.

A tabe la 2 to rna e vide nte que , o s 16 subtipo s de he mag lutinina e nco ntram-se pe rpe tuado s e m ave s aquáticas po r to do o mundo , mas ape nas do is, o H5 e o H7, e vo lue m de mo do a to rnar o vírus numa variante de alta pato g e nicidade para o re fe rido g rupo de ave s.

Ape nas trê s subtipo s de HA e do is de NA (H1-3 e N1-2) tê m circulado no s humano s de sde 1918 [10]. Os subtipo s H1, H2 e H3 fo ram re spo nsáve is po r pande mias o u e pide mias no Ho me m. Os subtipo s H5, H7 e H9 são transmissíve is a humano s, se ndo que a variante Asiática de H5N1 é susce ptíve l de causar mo rtalidade [17]. No s cavalo s, ape nas do is subtipo s de influe nza A (H7N7 e H3N8) são e nco ntrado s, e nquanto o s subtipo s re cupe rado s do s po rco s na nature za são H1, H3, N1 e N2 [54]. Partículas víricas subtipadas co mo H7N7 fo ram e nco ntradas e m g rande s co nce ntraçõ e s no s pulmõ e s de fo cas [54]. Outra linhag e m de vírus influe nza A iso lada de ste s mamífe ro s fo i o subtipo H4N5 [54]. Os subtipo s H13N2, H13N9 e H1N3 també m fo ram iso lado s do s pulmõ e s de bale ias [54].

Tabe la 2. Distribuição do s subtipo s HA e NA do vírus influe nza A iso lado s de hum ano s, m am ífe ro s

e ave s.

HEMAGLUTININA NEURAMINIDASE

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Os vírus influe nza B po de m se r dividido s e m duas linhag e ns antig e nicame nte distintas, re pre se ntadas po r B/ Victo ria/ 2/ 87 (linhage V) e B/ Yamag ata/ 16/ 88 (linhag e m-Y), base ado e m te ste s de inibição da he mag lutinação (HI) [55]. A prime ira linhag e m te m circulado de sde 1976 e a se g unda fo i re co nhe cida na maio r parte do mundo de sde 1987 [55]. De sde o ano 2000, as duas linhag e ns co -circulam pe lo mundo e m pro po rçõ e s variáve is e m dife re nte s paíse s o u re g iõ e s e dife re nte s é po cas, dificultando de sta fo rma a pre visão da sua pre valê ncia futura e as re co me ndaçõ e s para a co mpo sição da vacina. A co -circulação de stas linhage ns també m re sulto u no surg ime nto e po ste rio r circulação mundial de um vírus B re co mbinante po ssuindo um HA da linhag e m-Victo ria co m um NA da linhag e m-Yamagata [56].

2.1.7. Variação antig é nica

Os vírus influe nza e stão suje ito s a do is tipo s de variaçõ e s antig é nicas re spo nsáve is pe la sua habilidade e m causar e pide mias anuais re co rre nte s e me no s fre que nte me nte pande mias: o s drifts e o s shifts antig é nico s [14]. As variaçõ e s antig é nicas me no re s o u

drifts antig é nico s o co rre m, e m mé dia, a cada do is o u trê s ano s para o s subtipo s do vírus influe nza A e a cada cinco o u se is ano s para o s vírus influe nza B [53]. Estas variaçõ e s são causadas pe la acumulação de mutaçõ e s po ntuais no s g e ne s HA e NA [14] que re sultam na alte ração g radual da e strutura das pro te ínas. Esta alte ração re duz a lig ação ao s antico rpo s e subse que nte me nte a imunidade pré -e xiste nte do ho spe de iro re sultando numa me lho r disse minação da influe nza co nduzindo ao de se nvo lvime nto de uma no va e pide mia [57]. Os vírus influe nza A també m e xibe m shift antig é nico , uma fo rma mais dramática de mudança antig é nica nas glico pro te ínas de supe rfície [14]. Estas variaçõ e s antig é nicas maio re s, e spe cíficas da influe nza A, e stão asso ciadas à co mple ta substituição de um o u ambo s o s se g me nto s do g e no ma viral [53]. Estas alte raçõ e s de ve m-se ao re ag rupame nto e ntre vírus de humano s e de o utras e spé cie s animais que co -infe ctam a me sma cé lula ho spe de ira facilitando , de sta fo rma o surg ime nto de re arranjo s no mate rial g e né tico . Os re fe rido s re arranjo s to rnam po ssíve l que o vírus po ssua se g me nto s das duas e stirpe s [57], o casio nando no vas e stirpe s imuno lo g icame nte dife re nte s das e stirpe s circundante s.

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pande mias do sé culo XX, a e spanho la (1918), a asiática (1957) e a de Ho ng Ko ng (1968), que re sultaram e m milhõ e s de mo rte s durante o s surto s da g ripe [53]. Os vírus influe nza do tipo B cuja varie dade de re se rvató rio s animais é mais re strito e limitado não apre se ntam g rande s variaçõ e s g e né ticas [57].

2.1.8. Epide m io lo g ia

A influe nza é uma do e nça re spirató ria ag uda altame nte co ntag io sa de impo rtância g lo bal re spo nsáve l pe lo surg ime nto de e pide mias e pande mias durante sé culo s [57].

As pande mias pro vo cadas pe lo vírus influe nza são e ve nto s raro s e irre gulare s, e spaçadas g e ralme nte po r 30 a 40 ano s [53]. Po r sua ve z, as e pide mias de gravidade variáve l te nde m a o co rre r siste maticame nte a cada 1-3 ano s, e pre do minante me nte no Inve rno [53].

Estas pande mias e e pide mias atinge m indivíduo s de to das as faixas e tárias num curto e spaço de te mpo , num pro ce sso de te rminado pe la e le vada variabilidade e capacidade de adaptação do vírus [53]. A nature za frag me ntada do g e no ma da influe nza induz taxas e le vadas de mutação durante a fase de re plicação , particularme nte no s g e ne s da HA e NA. A HA so fre mutaçõ e s co m uma taxa e stimada de 2x10-3 substituiçõ e s de base s

po r po sição po r g e ração de vírus [54]. As taxas de mutação e le vadas e a facilidade de disse minação do vírus co nduziram ao suce sso e pide mio ló g ico do vírus, re spo nsáve l po r 3 a 5 milhõ e s de caso s de do e nça g rave e pe la mo rte de 250.000 a 500.000 pe sso as e m to do o mundo , anualme nte [58].

O pe río do de incubação da influe nza é re lativame nte curto (1-4 dias).

Ape sar de to do s o s g rupo s e tário s se re m po te ncialme nte infe ctado s pe la influe nza, as co mplicaçõ e s mais e xtre mas o co rre m fre que nte me nte e m crianças jo ve ns (<1 ano de idade ) e e m adulto s co m idade igual o u supe rio r a 65 ano s de idade , e spe cialme nte e m indivíduo s da 3ª idade , cujo s e stado infe ccio so te rmina co m maio r fre quê ncia, na mo rte do individuo [59]. Esta dispo sição para co mplicaçõ e s é ig ualme nte o bse rvada e m indivíduo s imuno co mpro me tido s, incluindo o s po rtado re s de pne umo patias cró nicas, de he mo g lo bino patias, de ne o plasias, de insuficiê ncia re nal cró nica, de cardio patia co ng é nita e o s diabé tico s [60].

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A nature za e xplo siva das e pide mias e pande mias, e co nco mitante me nte o s prime iro s sinto mas ve rificado s nas co munidade s, sug e re m que um único indivíduo infe ctado apre se nta um e le vado po te ncial de transmissão do vírus a indivíduo s susce ptíve is [57].

2.1.9. Pato ge nia e pato lo g ia

Os vírus influe nza re plicam-se nas cé lulas co lunare s e pite liais do tracto re spirató rio [61], ace de ndo às se cre çõ e s re spirató rias e , são subse que nte me nte e manado s, atravé s das partículas de ae ro ssó is libe rtadas durante o s e spirro s, a to sse e a fala [57]. No e ntanto , a dispe rsão da infe cção po r co ntacto dire cto não de ve se r me no spre zada, se ndo ace ite , e ntre a co munidade cie ntífica, a transmissão dire cta do vírus de pe sso a a pe sso a [57]. As g ripe s co m me no r se ve ridade o bse rvadas e m humano s são caracte rizadas po r alte raçõ e s e m to da a árvo re traque o brô nquica, o u se ja, de scamação do e pité lio ciliado , hipe rplasia de cé lulas transito riais, e de ma, hipe re mia, co ng e stão e aume nto das se cre çõ e s [12].

A virulê ncia do vírus influe nza re sulta da inte racção e ntre o pato g é nio viral e o ho spe de iro , do s marcado re s de virulê ncia e spe cífico s de um o u mais se g me nto s g e nó mico s do vírus e do níve l de pro te cção imuno ló g ica do indivíduo o u da po pulação [62]. As g lico pro te ínas de supe rfície , HA e NA, são o s alvo s da re spo sta imuno pro te cto ra do indivíduo [62].

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asse g uram que a pato ge nicidade não de pe nde de um só g e ne , mas da co mbinação do s g e ne s pre se nte s no s o ito se g me nto s g e nó mico s. No e ntanto , HA e NA tê m um pape l primo rdial na infe cção [62].

2.1.10. M anife staçõ e s clínicas e co m plicaçõ e s

O pe río do de incubação do vírus é curto [12], variando de aco rdo co m a quantidade de vírus que inte rvé m na infe cção e as de fe sas imuno ló g icas do indivíduo . A sinto mato lo g ia da g ripe de ste vírus e ng lo ba e pisó dio s fe bris, calafrio s, ce fale ia, to sse se ca, do r de g arg anta, co ng e stão nasal o u co riza, mialg ia, ano re xia e fadig a [53]. Um sinto ma e spe cífico da g ripe co nsiste no surg ime nto abrupto de fe bre e ntre o s 39 e 40º C. O re sfriado é co mum e ve rdade iro s calafrio s po de m pre ce de r o u aco mpanhar a fe bre . A ce fale ia po de se r g rave aco mpanhada e ve ntualme nte po r do r re tro -o rbitária [12]. A se nsação de pro stração e xtre ma co m mialg ia, é e xpe rie nciada fre que nte me nte se ndo particularme nte grave no s músculo s das co stas e no s me mbro s [12]. A to sse - co m e scassa pro dução - é fre que nte e ag rava a do r sube ste rnal o u de sco nfo rto , acusado po r muito s pacie nte s.

Durante a fase ag uda da do e nça, o s sinais físico s manife stam-se atravé s da fe bre e da infe cção da faring e [12], não e vide nciando quaisque r ano malias no s pulmõ e s po r e xame físico o u radio g rafia. Na ausê ncia de co mplicaçõ e s clínicas, a fe bre diminui e m 3 a 4 dias e a re cupe ração do indivíduo co mple ta-se ao fim de uma se mana. Em alg uns pacie nte s, particularme nte , no s mais ido so s e de bilitado s, o cansaço fácil e a falta de e ne rg ia po de pe rsistir durante várias se manas.

No e ntanto , a sinto mato lo g ia da gripe e m pacie nte s co m do e nças re spirató rias cró nicas subjace nte s, do e nças cardio vasculare s, me tabó licas e re nais, e e m mulhe re s no último trime stre de g ravide z, po de rá se r particularme nte g rave , caracte rizando -se pe la de te rio ração rápida do e stado clínico do indivíduo infe ctado [12], e muitas ve ze s pe lo de se nvo lvime nto de pne umo nia viral e bacte riana [53].

Embo ra a pne umo nia primária pro vo cada pe la influe nza po ssa o co rre r, a pne umo nia re sultante da g ripe é g e ralme nte de spo le tada po r infe cção bacte riana se cundária pro vo cada po r Staphylo c o c cus aure us, Hae m o philus influe nz ae, Stre pto c o c cus

pne umo niae o u Stre pto c o c cus pyo g e ne [12].

2.1.11. Te rapia e pro filaxia

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re de de vig ilância e pide mio ló g ica da g ripe co o rde nada pe la Organização Mundial de Saúde (OMS) iniciada e m 1947 inclui actualme nte ce rca de 125 Ce ntro s Nacio nais de Influe nza (CNI) distribuído s po r 96 paíse s, juntame nte co m cinco Ce ntro s Co labo rado re s (CC) da OMS, quatro Labo rató rio s de Re g ulação Esse ncial (LRE) e o utro s grupo s ad-ho c [56]. Em co njunto , e ste s labo rató rio s pro ce ssam à vo lta de 500.000 e spé cime s re spirató rio s po r ano para mo nito rização da actividade da influe nza e m to do o Mundo [56]. Apro ximadame nte 8000 do s vírus iso lado s pe lo s CNI são co mpartilhado s co m o s CC, po ssibilitando uma caracte rização antig é nica e ge né tica mais e xte nsa [56].

Ne ste âmbito fo i criado e m Po rtug al, e m 1953, o Ce ntro Nacio nal da Gripe (CNG), no Instituto de Hig ie ne Dr. Ricardo Jo rg e . Este Ce ntro tinha po r atribuiçõ e s o e studo da g ripe , no me adame nte atravé s do iso lame nto e caracte rização do s vírus influe nza e do e nvio de amo stras e info rmaçõ e s so bre as e stirpe s e pidé micas ao s ce ntro s mundiais [2]. O Siste ma Nacio nal de Vig ilância da Gripe co o rde nado pe lo Ce ntro Nacio nal da Gripe (CNG), e m co labo ração co m o Obse rvató rio Nacio nal de Saúde (O NSA) e a Dire cção -Ge ral da Saúde (DGS), g arante a vig ilância e pide mio ló g ica da g ripe e m Po rtug al, atravé s da inte g ração da info rmação e pide mio ló g ica/ clínica co m a viro ló g ica. As info rmaçõ e s de co nte xto clínico e labo rato rial são fo rne cidas pe la re de de Mé dico s-Se ntine la e pe las Unidade s de Urg ê ncia de Ho spitais e Ce ntro s de Saúde [2].

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De sde o final do s ano s 40, e dado que é praticame nte inviáve l e vitar a transmissão do vírus influe nza, a vacinação co nstitui a me lho r me dida de pre ve nção para a infe cção causada pe lo vírus o u para diminuir a sua se ve ridade . As vacinas mais utilizadas mundialme nte apre se ntam duas tipo lo g ias distintas, de sig nadame nte a vacina de vírus ate nuado e a vacina tipo split, co mpo sta po r vírus inactivado s pe la e xpo sição a de te rg e nte s e purificado s de fo rma a co nte r o s antig é nio s de alg umas pro te ínas do vírus [63].

A vacina do vírus inactivado po de se r administrada e m pe sso as co m idade supe rio r a 6 me se s, e m mulhe re s g rávidas o u que pade çam de alg um pro ble ma de saúde cró nico . Duas do se s po de m se r administradas co m inte rvalo de um mê s e ntre cada aplicação , e m crianças co m idade e ntre 6 me se s e o s 8 ano s, de sde que imunizadas pe la prime ira ve z. Uma única do se é ade quada para imunizar o s indivíduo s adulto s saudáve is.

A vacina de vírus ate nuado po de se r administrada e m pe sso as saudáve is co m idade co mpre e ndida e ntre o s 5 e o s 49 ano s, co m e xce pção das mulhe re s g rávidas. A vacina é administrada via spray nasal, po de ndo causar sinto mas le ve s se m le var ao de se nvo lvime nto da do e nça [64].

Alé m da vacinação , actualme nte , e stão dispo níve is duas classe s de dro g as antivirais usadas na pre ve nção e tratame nto co ntra a actividade da influe nza. As adamantadinas o u inibido re s do canal de iõ e s M2 tais co mo a amantadina (Symme tre l; Endo Pharmace uticals, Chads Fo rd, PA) e a rimantadina (Flumadine ; Fo re st Pharmace uticals, St Lo uis, MO). E, o s inibido re s da ne uraminidase , o se ltamivir (Tamiflu; Ro che Labo rato rie s, Nutle y, NJ) e zanamavir (Re le nza; Glaxo Smith-Kline , Re se arch Triang le Park, NC) [10,56].

As dro g as antivirais (amantadina e rimantadina) são utilizadas ape nas nas infe cçõ e s pro vo cadas pe lo vírus influe nza A e apre se ntam ce rtas limitaçõ e s, no me adame nte o rápido de se nvo lvime nto de re sistê ncia viral, o e spe ctro de acção re strito e as re acçõ e s adve rsas no siste ma ne rvo so ce ntral e no tracto g astro inte stinal [65]. Os no vo s inibido re s de ne uraminidase apre se ntam a vantage m de po ssuir e le vada capacidade para inte rro mpe r a re plicação viral do s vírus influe nza A e B e utilidade no tratame nto da infe cção g rave , be m co mo , po te ncial para re duzir o risco de co mplicaçõ e s [65].

2.1.12. Diag nó stico