O kit Influe nza A/ B Ig G/ Ig M ELISA® da Ge nzyme Viro te ch® fo i usado no e nsaio imuno e nzimático rápido e in vitro , de stinado à de te cção dife re ncial quantitativa e qualitativa de antico rpo s humano s co ntra o s vírus influe nza A e B pre se nte s no so ro (ve r Ane xo s, tabe la 25).
Na de te cção do vírus influe nza A fo i utilizado co mo antig é nio uma mistura das e stirpe s A/ Brisbane / 59/ 2007 (H1N1) e A/ Brisbane / 10/ 2007 (H3N2), e nquanto no influe nza B fo i usada a e stirpe B/ Brisbane / 60/ 2008. Este s antig é nio s do s vírus sazo nais influe nza A e B co rre spo nde m às re co me ndaçõ e s da OMS no He misfé rio No rte para 2009/ 2010. A partir do lo te de placas 213 e 103, as placas ELISA Viro te ch® e stão re ve stidas co m um antig é nio actualizado . Trata-se da e stirpe do vírus A/ Califo rnia/ 7/ 2009 (H1N1) e A/ Pe rth/ 16/ 2009 (H3N2), que de aco rdo co m a re co me ndação da OMS de ve se r incluído nas vacinas para a campanha de 2010/ 2011 [72].
Ante s do início do te ste no pro ce ssado r auto mático , diluiu-se 10 µL da amo stra do pacie nte e m 500 µL de tampão de diluição PBS-Twe e n 20 (ve r Ane xo s, tabe la 25).
Pro ce de u-se a uma no va diluição , de sta ve z, co m a so lução de tratame nto VIR- ELISA IgG – RF - SORBENT® e a amo stra de so ro pré -diluída na pro po rção de 1:1.
De ixo u-se incubar a mistura durante 30 minuto s ante s de co lo car no analisado r auto mático para micro placas AP22 Spe e dy® da DAS® .
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Nas amo stras para a de te rminação das Ig G, a diluição pré via co m so lução de tratame nto não é ne ce ssária.
No s te ste s Influe nza A/ B IgM/ IgG ELISA® da Ge nzyme Viro te ch® , pipe to u-se 100 µL do co ntro lo ne g ativo , do co ntro lo cut-o ff e do co ntro lo po sitivo (ve r Ane xo s, tabe la 25) no s po ço s re ve stido s co m antig é nio co mo ilustra a fig ura 10.
(a) (b)
Figura 10. Micro placas re ve stidas co m antig é nio usadas no te ste ELISA (a) na de te cção do s antico rpo s Ig G (o s círculo s ve rde claro , ve rde e ve rde e scuro co rre spo nde m , ao co ntro lo ne g ativo , co ntro lo cut-o ff e co ntro lo po sitivo , re spe ctivam e nte ); (b) na de te cção do s antico rpo s Ig M (o s círculo s bo rde aux, ve rm e lho e ro sa co rre spo nde m , ao co ntro lo ne g ativo , co ntro lo cut-o ff, e co ntro lo po sitivo , re spe ctivame nte ).
Apó s a pipe tage m do s co ntro lo s, as micro placas fo ram co lo cadas na supe rfície de trabalho do s re spe ctivo s pro ce ssado re s AP22 SPEEDY para o te ste ELISA, cada um para a de te cção co rre spo nde nte ao s antico rpo s Ig G e Ig M.
Pre paro u-se a re stante supe rfície de trabalho , co nfo rme ilustrado na fig ura 11, adicio nando o s re ag e nte s (co njug ado , substrato e so lução sto p) (ve r Ane xo s, tabe la 25) ao s “tabule iro s e spe cífico s para re ag e nte s, calibrado re s e co ntro lo s” e o tampão de diluição ao “tabule iro co mum ELISA”.
Finalme nte , para a de te cção das Ig G, fo ram co lo cadas as amo stras não diluídas do s do e nte s no “tabule iro po rta-amo stras”, assim co mo o s tubo s de e nsaio no “tabule iro de pré -diluição ”.
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Figura 11. Supe rfície de trabalho do pro ce ssado r AP22 SPEEDY para o te ste ELISA.
No o utro pro ce ssado r re spo nsáve l pe la de te cção do s Ig M, as amo stras diluídas são co lo cadas dire ctame nte no “tabule iro po rta-amo stras”, uma ve z que a diluição já fo i re alizada.
Uma ve z pre parado s ambo s o s analisado re s, de u-se início à e xe cução da se ssão de trabalho .
Pipe to u-se 100 µL das amo stras diluídas dire ctame nte para o s po ço s re ve stido s co m antig é nio das micro placas. De po is da pipe tag e m, as amo stras ficaram a incubar durante 30 minuto s, a 37º C.
Findo o pe río do de incubação , lavo u-se o s po ço s 4 ve ze s, cada uma co m 400 µL de so lução de lavag e m po r po ço .
Adicio no u-se 100 µL de co njugado (ve r Ane xo s, tabe la 25) po r po ço e de ixo u-se a incubar po r 30 minuto s, a 37º C. Te rmino u-se a incubação do co njug ado co m 4 lavag e ns.
De se g uida, fo ram pipe tado s 100 µL do substrato TMB (ve r Ane xo s, tabe la 25) e de ixo u-se incubar durante 30 minuto s, a 37º C, te ndo o cuidado de mante r a tampa fe chada de mo do a facultar um e spaço e scuro .
Paro u-se a re acção do substrato , pipe tando 50 µL da so lução sto p de citrato (ve r Ane xo s, tabe la 25) e m to do s o s po ço s, se ndo visíve l uma co r amare la ho mo g é ne a.
Me diu-se o s co e ficie nte s de e xtinção da mistura re ag e nte no s 450 e 620 nm. A me dição e spe ctro fo to mé trica de ve se r re alizada no prazo máximo de uma ho ra apó s a adição da so lução sto p.
O analisado r auto mático de micro placas AP22 SPEEDY® é um instrume nto de stinado à distribuição , lavag e m e le itura de micro placas e m análise s imuno e nzimáticas. É capaz de pro ce ssar amo stras bio ló g icas (diluindo -as pre viame nte , se ne ce ssário ) co m
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re ag e nte s e spe cífico s e de pro ce ssar até 2 micro placas e m linha. O fluxo g rama da me to do lo g ia utilizada no pro ce ssame nto das amo stras no pro ce ssado r AP22 SPEEDY, durante o te ste ELISA po de se r co nsultado no s Ane xo s, tabe la 26.