7. Diagnóstico
7.2. Diagnóstico Molecular
Atualmente os métodos moleculares, nomeadamente a técnica de amplificação de DNA por PCR (Polymerase Chain Reaction) e a técnica de sequenciação, constituem as ferramentas mais fiáveis para a identificação das diferentes espécies de Diphyllobothrium. A aplicação destes métodos permitiu melhorar a especificidade do diagnóstico e tornou possível analisar um grande número de amostras num curto período de tempo. (1,3)
Anteriormente eram utilizadas técnicas bioquímicas (ensaios enzimáticos ou imunoeletroforese) como métodos alternativos para a identificação das espécies de
Diphyllobothrium. Um outro método utilizado para distinguir principalmente as espécies D. latum e D. nihonkaiense era a técnica de RFLP (restriction fragment length polymorphism), no entanto os resultados obtidos eram muitas vezes difíceis de interpretar
e a técnica era mais adequada para discriminar um pequeno número de sequências de DNA.(1,3,42)
A partir do final dos anos 90, foram caracterizadas as primeiras sequências de DNA ribossomal (rDNA) e de DNA mitocondrial (mtDNA), que começaram em seguida a ser utilizadas na identificação das espécies de Diphyllobothrium, o que contribuiu para uma melhor compreensão da filogenia do género. (1,3,42) Contudo, as sequências de genes ribossomais (18S rDNA, 5.8S rDNA, 28S rDNA) e das regiões ITS (internal transcribed
spacers) ribossomais, não permitem distinguir as espécies D. latum, D. nihonkaiense e D. dendriticum. (1,3,47)
A caracterização completa dos genomas de D. latum por Park et. al (48) e de D.
nihonkaiense por Kim et. al (49), veio fornecer informação crucial acerca da utilidade de
diversas regiões codificantes e não codificantes na identificação das espécies de
Diphyllobothrium. Em particular, a sequência do gene cox1 (cytochrome c oxidase subunit 1) do mtDNA surgiu como um alvo apropriado, sendo que atualmente é o alvo mais
utilizado para o diagnóstico específico das espécies de Diphyllobothrium que causam infeção no Homem, juntamente com outros genes mitocondriais como o cob (cytochrome
b) e o nad3 (NADH dehydrogenase subunit 3). (1,3)
As técnicas de PCR e sequenciação, embora altamente precisas, são bastante complicadas, longas e dispendiosas para serem aplicadas no diagnóstico de rotina nos laboratórios de análises clínicas. Nesse sentido, Wicht et. al (42) desenvolveram, em 2010,
quatro principais espécies de Diphyllobothrium causadoras de infeção no Homem. Este teste baseia-se na técnica de PCR multiplex (uma variante da técnica de PCR que permite amplificar mais do que uma sequência alvo numa única reação, através da utilização de múltiplos primers), com o gene cox1 do mtDNA a ser utilizado como alvo.
Os resultados do estudo indicam que este é um método promissor para a identificação de rotina de D. latum, D. nihonkaiense, D. dendriticum e D. pacificum, representando uma alternativa adequada às técnicas de PCR e sequenciação. A utilização da técnica de PCR multiplex permite fazer a distinção das espécies a partir de proglótis e ovos de Diphyllobothrium spp. e, para além disso, pode também ser utilizada na identificação das formas larvares deste parasita, contribuindo assim para a compreensão do ciclo de vida das diversas espécies. (42)
Uma das maiores dificuldades existentes na identificação das espécies de
Diphyllobothrium através de métodos moleculares, incluindo a técnica de PCR multiplex,
é o facto de as amostras não se encontrarem conservadas/fixadas de forma correta. Para a análise molecular, estas apenas devem ser fixadas com etanol e não com outros fixadores como a formalina, AFA (mistura de etanol, formalina e ácido acético) ou etanol desnaturado, uma vez que estes afetam irreversivelmente a qualidade do DNA e as reações químicas que ocorrem nas técnicas moleculares. (1,42)
Mais recentemente, Thanchomnang et. al (43) desenvolveram um outro método para a identificação das espécies de Diphyllobothrium, com base na técnica de pirosequenciação. A pirosequenciação é uma técnica de sequenciação de DNA que utiliza reações enzimáticas e bioluminescência para detetar a libertação de pirofosfato (PPi) que ocorre durante a síntese do DNA. Quando um novo nucleótico é incorporado, a libertação de PPi gera um sinal luminoso que é detetado e medido. A intensidade da luz gerada é proporcional ao número de nucleótidos incorporados. (43)
Neste estudo, o método de pirosequenciação foi utilizado para distinguir 9 espécies de parasitas pertencentes à ordem Diphyllobothriidea, entre as quais o D. latum, D.
nihonkaiense, D. dendriticum e D. pacificum, utilizando o gene cox1 como marcador
molecular. Foi demonstrado que este método constitui uma ferramenta fiável para a rápida identificação das 9 espécies estudadas, constituindo por isso mais uma alternativa promissora aos métodos tradicionais de PCR e sequenciação. Para além da sua aplicação clínica, esta técnica pode também ser utilizada para estudos epidemiológicos,
nomeadamente através da identificação de formas larvares encontradas nos hospedeiros intermediários de Diphyllobothrium spp. (43)
Uma outra vantagem deste método é que, para a análise molecular, são suficientes produtos de PCR pequenos, pelo que amostras que foram fixadas com formalina e cujo DNA sofreu degradação podem ser utilizadas neste teste. (43)
8. Tratamento
O tratamento da difilobotriose é efetuado através da administração oral de fármacos pertencentes à classe dos anti-helmínticos, o praziquantel ou, em alternativa, a niclosamida. Os anti-helmínticos são um grupo de fármacos utilizados em infeções causadas por helmintas, atuando localmente no lúmen intestinal de forma a provocar a expulsão dos parasitas que vivem no intestino, ou a nível sistémico contra helmintas que se localizam fora do trato gastrointestinal. (50)
Para que o tratamento da difilobotriose seja considerado eficaz, é necessário que ocorra a expulsão completa do estróbilo e também do escólex, uma vez que o parasita pode voltar a crescer se o escólex se mantiver no lúmen intestinal. Caso o escólex não seja expulso, é necessário verificar que não surgem mais ovos de Diphyllobothrium nas fezes dos indivíduos infetados para que este seja considerado curado. (51)
8.1. Praziquantel
O praziquantel é um anti-helmíntico utilizado no tratamento de diversas infeções causadas por cestodes e trematodes (sobretudo por Schistosoma spp.), constituindo o fármaco recomendado para o tratamento da difilobotriose. (52,53) Este fármaco é um derivado da pirazino-isoquinolina e o seu modo de ação baseia-se em alterações estruturais no tegumento dos parasitas. O praziquantel aumenta a permeabilidade da membrana aos iões cálcio (Ca2+), dando assim origem a espasmos severos e causando paralisia dos músculos do parasita. A atuação do praziquantel resulta na expulsão do parasita juntamente com as fezes, ou na morte e destruição do mesmo no lúmen intestinal. (14)
A administração de praziquantel para o tratamento da difilobotriose é feita por via oral e em dose única, sendo que a dose recomendada a nível mundial é de 5-10 mg/kg para adultos e crianças. (53,54) Contudo, a dose a ser utilizada pode variar consoante a espécie de Diphyllobothrium em questão. No que diz respeito ao D. nihonkaiense, a dose de 5-10 mg/kg tem sido reportada como eficaz em diversos casos (1,3,51), sendo que o mesmo acontece com o D. pacificum, em que uma dose de 10 mg/kg foi eficaz no tratamento de vários indivíduos infetados. (1,3,55) Já nas infeções causadas por D. latum, estudos experimentais realizados por Bylund et. al em 1977 e por Groll em 1980, indicaram que apenas uma dose de 25 mg/kg era clinicamente eficaz no tratamento da difilobotriose.
(1,55,56) No entanto, artigos mais recentes reportam casos de difilobotriose causada por
D. latum em que todos os indivíduos foram tratados com sucesso através da administração
de uma dose de praziquantel de 15 mg/kg. (45,57,58)
Assim, o D. nihonkaiense parece ser mais sensível ao praziquantel do que o D.
latum, e igualmente ou mais sensível que o D. pacificum. (1,3,51)
De um modo geral o praziquantel é bem tolerado pelos indivíduos infetados, sendo que os efeitos secundários, quando presentes, são normalmente ligeiros. Os efeitos secundários deste fármaco incluem dor abdominal, náuseas, diarreia, cefaleias, tonturas e sonolência. Efeitos secundários indiretos como febre, prurido, urticária, artralgias e mialgias poderão também ser observados ocasionalmente. (14,50) Habitualmente os efeitos secundários do tratamento com praziquantel não requerem tratamento, no entanto nos indivíduos que se encontram infetados com um maior número de parasitas, estas reações podem ser de maior gravidade e podem surgir mais frequentemente. (1,3)
8.2. Niclosamida
Em alternativa ao praziquantel, pode também ser utilizado outro anti-helmíntico no tratamento da difilobotriose, a niclosamida. A niclosamida é um derivado da salicilanilida e começou a ser utilizada nos anos 60 para o tratamento de infeções no Homem causadas por Taenia saginata, Diphyllobothrium latum e Hymenolepis nana. Este fármaco era utilizado como alternativa ao praziquantel, uma vez que era eficaz, tinha um baixo custo e era facilmente obtido em muitas partes do mundo. (50) Para além disso, os seus efeitos secundários (náuseas, vómitos e dor abdominal) são pouco frequentes, dado que este fármaco não é absorvido no trato gastrointestinal. (3,14)
No entanto, a niclosamida já não se encontra disponível para ser utilizada no tratamento de infeções no Homem em vários países, como é o caso dos EUA. Noutros países continua a ser utilizada como alternativa ao praziquantel, sendo administrada por via oral e em dose única. A dose recomendada é de 2 g para os adultos e de 50 mg/kg para as crianças. (3,53,54)
9. Prevenção e Controlo
As medidas de prevenção e controlo da difilobotriose devem ter como principal objetivo a interrupção do ciclo de vida de Diphyllobothrium spp. Na prática, para um controlo eficaz da difilobotriose a larga escala, mas principalmente nas áreas endémicas, estas medidas devem focar-se em três pontos principais: prevenção da contaminação dos ecossistemas aquáticos; tratamento dos indivíduos infetados; prevenção da transmissão dos plerocercóides presentes nos peixes ao Homem. (1,3)
O tratamento adequado das águas residuais e a melhoria do saneamento básico representam medidas eficazes para evitar a contaminação das águas. No entanto, estas medidas têm um impacto limitado se existirem outros hospedeiros definitivos de
Diphyllobothrium spp. nessa área pois, como referido anteriormente, estes constituem
reservatórios deste parasita, contribuindo para a manutenção do seu ciclo de vida. Pela mesma razão, o tratamento dos indivíduos infetados com Diphyllobothrium spp., embora eficaz, não contribui para a eliminação do parasita. A existência de reservatórios de
Diphyllobothrium spp. representa assim um sério obstáculo para os programas de controlo
da difilobotriose. (1,3)
Assim, a forma mais simples e eficaz de prevenir a infeção por Diphyllobothrium
spp. no Homem é evitar o consumo de peixe cru, mal cozinhado, fumado ou em pickle.
Contudo, os hábitos alimentares tradicionais das populações e a crescente popularidade do consumo de peixe cru em todo o mundo, dificultam grandemente esta medida.
Desta forma, para evitar a infeção o peixe deve ser bem cozinhado ou, em alternativa, adequadamente congelado antes de ser consumido, o que permite eliminar os plerocercóides presentes no tecido muscular ou nas vísceras dos peixes. A cozedura do peixe a uma temperatura de 55°C durante cerca de 5 minutos é suficiente para eliminar o parasita. (1,3) Relativamente à congelação do peixe, as recomendações da U.S. Food &
Drug Administration (FDA) (59) são as seguintes:
Congelar e conservar a -20°C ou a uma temperatura inferior, durante 7 dias; ou
Congelar a -35°C ou a uma temperatura inferior até o peixe ficar firme e conservar à mesma temperatura, durante durante 15 horas; ou
Congelar a -35°C ou a uma temperatura inferior até o peixe ficar firme e conservar a -20°C (ou menos), durante 24 horas.
Desta forma, se não tiver sido previamente congelado de forma adequada, o peixe não deve ser consumido cru ou mal cozinhado. Contudo, o salmão, peixe que mais frequentemente está associado a infeções por Diphyllobothrium spp., é atualmente transportado fresco e apenas conservado em gelo. Este é principalmente exportado de zonas endémicas como o Chile e o noroeste do Pacífico (Canadá e EUA), sendo esta a via que leva à introdução de Diphyllobothrium spp. em novas áreas geográficas. (1,3)
Assim, a inspeção do peixe para venda ao público e do peixe utilizado na restauração, em particular nos restaurantes de sushi, onde devem ser cumpridas as recomendações de congelação já indicadas, e a inspeção da proveniência, condições de transporte e conservação do peixe, constitui uma importante medida de prevenção e controlo de infeções por Diphyllobothrium spp. (3,6,29)
Por fim, é fundamental informar, educar e sensibilizar os consumidores acerca dos riscos que o consumo de peixe cru ou mal cozinhado acarreta. (1,3,6) Para além disso, é também importante que estes tenham conhecimento de que o peixe fumado a baixas temperaturas pode também constituir uma fonte de infeção, já que o parasita não é eliminado. Já no caso do peixe salgado, esta técnica resulta numa infeciosidade diminuída dos plerocercóides de Diphyllobothrium spp., porém esta diminuição pode demorar vários dias ou semanas, dependendo do tamanho do peixe e do volume de sal utilizado. (1)
Neste sentido, as organizações de saúde locais e mundiais devem promover campanhas de sensibilização junto das populações, sendo que os meios de comunicação social têm um papel fundamental na divulgação da informação.
10. Conclusão
Apesar de o Diphyllobothrium spp. ser conhecido desde há muito tempo como um parasita causador de infeção no ser humano, atualmente existem ainda muitas lacunas no conhecimento da epidemiologia, distribuição mundial e ciclo de vida das diferentes espécies que infetam o Homem. Este facto deve-se principalmente às dificuldades existentes na identificação e distinção das várias espécies com base na sua morfologia, uma vez que, tanto os ovos como as proglótis das diferentes espécies são muito semelhantes. Para além disso, o facto de o tratamento da difilobotriose ser o mesmo independemente da espécie causadora de infeção, leva a que a identificação do parasita ao nível do género seja suficiente para os clínicos.
O desenvolvimento de métodos moleculares veio, entretanto, permitir a obtenção de um diagnóstico diferencial fiável e, consequentemente, a obtenção de mais informação acerca das diversas espécies de Diphyllobothrium. No entanto, por motivos económicos e técnicos, estes métodos (PCR e sequenciação) não são ainda aplicados na rotina dos laboratórios. Recentemente foram desenvolvidos novos métodos mais simples, rápidos e económicos (PCR multiplex e pirosequenciação), contudo estes carecem ainda de mais estudos para que possam ser implementados nos laboratórios de análises clínicas. Para além disso, é ainda fundamental que seja apenas utilizado etanol para fixar todas as amostras para análise molecular, uma vez que a utilização de outras substâncias impede geralmente o sucesso destas técnicas.
A utilização de métodos moleculares assume ainda maior importância tendo em conta a recente reemergência da difilobotriose que se verifica em diversas regiões a nível mundial, e que representa atualmente um crescente problema de saúde pública.
Esta reemergência deve-se essencialmente à crescente popularidade do consumo de peixe cru ou insuficientemente cozinhado que se verifica em todo o mundo, mas principalmente nos países desenvolvidos, e também ao aumento da produção (aquacultura) e exportação de peixe, em particular de salmão do Pacífico proveniente de zonas endémicas como o Chile. A previsão é de que o consumo de peixe continue a aumentar nos próximos anos e que, consequentemente, a produção de peixe através de aquacultura aumente também, o que pode resultar num aumento exponencial do número de casos de difilobotriose num futuro próximo.
Assim, torna-se fundamental adotar medidas de prevenção e controlo eficazes, quer ao nível da inspeção rigorosa do peixe produzido em aquacultura e das condições em que este é transportado e conservado, quer ao nível da informação e educação dos consumidores acerca do risco do consumo de peixe cru ou mal cozinhado.
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