4. Microbiologia
4.3. Testes de Identificação de Microrganismos
Após o isolamento dos microrganismos em culturas puras, procede-se à sua identificação. No laboratório de Microbiologia são utilizados vários testes que auxiliam este processo e que permitem fazer uma identificação presuntiva dos microrganismos em estudo, com base nas características metabólicas e nutricionais desses microrganismos e em reações antigénio-anticorpo (testes de aglutinação). Em seguida são apresentados alguns dos principais testes de identificação presuntiva realizados no laboratório e que foram observados e/ou realizados durante o estágio.
4.3.1. Provas Bioquímicas
Catalase
O teste da catalase é utilizado para distinguir dois géneros de bactérias Gram- positivo, os Staphylococcus spp. (catalase positiva) e os Streptococcus spp. (catalase negativa).
Esta prova baseia-se na deteção da presença da enzima catalase, que tem a capacidade de converter o peróxido de hidrogénio em oxigénio e água. O procedimento consiste em colocar uma gota de peróxido de hidrogénio numa lâmina e em seguida transferir uma colónia isolada do meio de cultura para a lâmina. A reação positiva, que indica a presença da catalase, é evidenciada pela rápida produção de bolhas de ar. (6)
Oxidase
O teste da oxidase permite detetar a presença da enzima citocromo oxidase, que participa no transporte de eletrões de um dador para um aceitador (normalmente o oxigénio). Esta prova é utilizada para a caracterização de bacilos Gram-negativo, permitindo diferenciar microrganismos da família das Enterobacteriaceae (oxidase
negativa) de outros bacilos pertencentes aos géneros Pseudomonas spp. e Aeromonas spp. (oxidase positiva).
Para a realização deste teste é utilizado o dihidrocloreto de tetrametil p-fenilenodiamina (composto que atua como aceitador de eletrões), que é colocado num disco fornecido com o kit, sobre o qual é seguidamente espalhada uma colónia isolada. Na presença da enzima oxidase, este reagente sofre oxidação e origina um composto de cor roxa. Na ausência de oxidase não ocorre mudança de cor, indicando uma reação negativa.(6,8)
Urease
O teste da urease é útil na identificação de algumas espécies pertencentes à família das Enterobacteriaceae, como o Proteus spp. (urease positiva), e também de outras bactérias importantes como o Helicobacter pylori.
Esta prova permite detetar a presença da enzima urease, que tem a capacidade de hidrolisar a ureia em amónia e CO2. Para este teste é utilizado o meio líquido ureia-indol
que tem na sua composição ureia e um indicador de pH (vermelho de fenol), no qual é colocada uma colónia isolada. A produção de amónia alcaliniza o meio, dando origem a uma mudança de cor do indicador de pH, de laranja para rosa, após incubação a 35-37°C em atmosfera de aerobiose durante 24h. A ausência de alteração da cor do meio corresponde a um resultado negativo, indicando assim a ausência da enzima urease. (6)
4.3.2. Testes de Aglutinação
Identificação Rápida de Staphylococcus aureus - SLIDEX® Staph Plus
O SLIDEX Staph Plus é um teste de aglutinação para a identificação de
Staphylococcus aureus. Neste teste são utilizadas partículas de látex sensibilizadas com
fibrinogénio humano e anticorpos monoclonais, para a deteção do fator de afinidade para o fibrinogénio (clumping factor), da proteína A e de antigénios de superfície específicos de
S. aureus.
O procedimento consiste em colocar uma gota do reagente num dos círculos dos cartões fornecidos com o kit, em seguida dissolver uma ou mais colónias e observar o resultado 30 segundos após ligeira rotação. A observação de aglutinação significa que o resultado é positivo, indicando assim a presença de Staphylococcus aureus.
desta prova são necessárias 4 a 24 horas de incubação, tendo por isso sido substituída pelo teste rápido de aglutinação, embora em alguns casos possa ser utilizada uma vez que é o método de referência. (9)
Deteção de Staphylococcus aureus Resistentes à Meticilina - SLIDEX® MRSA Detection
O SLIDEX® MRSA Detection é um teste de aglutinação com partículas de látex para a deteção de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA), com base na produção da proteína PBP2’. A resistência à meticilina é determinada pela aquisição de um elemento genético móvel do qual faz parte o gene mecA, que codifica a PBP2’. Esta proteína tem uma baixa afinidade para os antibióticos β-lactâmicos, nos quais se inclui a meticilina, o que permite a sobrevivência do S. aureus quando exposto a estes antibióticos. Neste teste, as partículas de látex encontram-se sensibilizadas com um anticorpo monoclonal contra a PBP2’ e vão reagir de forma específica com os MRSA, observando- se uma aglutinação que indica um resultado positivo. (7,9)
4.3.3. Teste de Sensibilidade à Optoquina
O teste de sensibilidade à optoquina permite fazer a identificação presuntiva de
Streptococcus pneumoniae, diferenciando-os de outros estreptococos α-hemolíticos,
nomeadamente os Streptococcus viridans. Este teste baseia-se no facto de o Streptococcus
pneumoniae ser sensível à optoquina, contrariamente aos restantes estreptococos α-
hemolíticos.
Para a realização desta prova é semeada uma gelose COS, com colónias isoladas cuja morfologia seja sugestiva de S. pneumoniae. Em seguida é colocado um disco impregnado com optoquina no centro da gelose e esta é incubada a 35°C em atmosfera com 5% CO2, durante 24h. Após a incubação, a presença de um halo de inbição de crescimento
à volta do disco, com um diâmetro igual ou superior a 14 mm ou 16 mm (dependendo do tamanho do disco utilizado), permite fazer a identificação presuntiva de S.
pneumoniae.(6,7)
4.3.4. Teste da Necessidade dos Fatores X e V
O teste da necessidade dos fatores X e V é utilizado para diferenciar as espécies de
Haemophilus, com base na necessidade dos fatores de crescimento X e/ou V. As diferentes
sangue para poderem crescer nos meios de cultura, nomeadamente os fatores X e V. Algumas espécies de Haemophilus necessitam apenas do fator X ou do fator V, enquanto outras necessitam de ambos os fatores para se desenvolverem.
Nesta prova é preparada uma suspensão em NaCl a 0,85% das colónias sugestivas de Haemophilus (isoladas em gelose de chocolate PVX ou HAE2), de 0,5 na escala de McFarland. A suspensão é inoculada numa gelose MHE com uma zaragatoa, através da técnica de espalhamento (distribuição uniforme da suspensão em toda a superfície da gelose). Em seguida, são colocados os três discos (X, V e X+V) no meio de cultura, de forma a ficarem o mais afastados possível, e este é incubado a 35°C em atmosfera com 5% CO2, durante 24h. Após a incubação é feita a observação dos resultados: (6,7)
Crescimento à volta do disco com fator V e do disco X+V - bactéria necessita apenas do fator V;
Crescimento à volta do disco com fator X e do disco X+V - bactéria requer apenas o fator X;
Crescimento apenas à volta do disco X+V – bactéria necessita de ambos os fatores em simultâneo.
Neste teste é ainda semeada uma gelose de chocolate PVX com a suspensão preparada, de forma a verificar a pureza das colónias isoladas.