Características clínicas e frequência de polimorfismos em TLR4 em pacientes brasileiros com espondilite anquilosante.

(1)

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REVISTA

BRASILEIRA

DE

REUMATOLOGIA

Artigo

original

Características

clínicas

e

frequência

de

polimorfismos

em

TLR4

em

pacientes

brasileiros

com

espondilite

anquilosante

Natalia

Pereira

Machado

a

_,

_Eliana

_Nogueira

b

_,

_Karen

_Oseki

a

_,

Pâmela

Carolina

Cruz

Ebbing

a

_,

_Clarice

_Silvia

_Taemi

_Origassa

b

_,

_Tatiane

_Mohovic

b

_,

Niels

Olsen

Saraiva

Câmara

b

_e

_Marcelo

_de

_Medeiros

_Pinheiro

a,∗

a_Divisão_de_{Reumatologia,}_Departamento_de_Medicina,_Universidade_Federal_de_São_Paulo_(UNIFESP),_São_Paulo,_SP,_Brasil b_Divisão_de_Nefrologia,_Departamento_de_Medicina,_Universidade_Federal_de_São_Paulo_(UNIFESP),_São_Paulo,_SP,_Brasil

informações

sobre

o

artigo

Históricodoartigo:

Recebidoem10defevereirode2016

Aceitoem1demaiode2016

On-lineem8dejulhode2016

Palavras-chave:

Espondiliteanquilosante

PolimorfismosemTLR-4

HLA-B27

r

e

s

u

m

o

Objetivos:Aimunidadeinataestáenvolvidanafisiopatologiadaespondiliteanquilosante

(EA),comaparticipac¸ãodebactériasgram-negativas,modulac¸ãodoantígenoleucocitário

humano(HLA)B27eoenvolvimentodereceptoresdereconhecimentodepadrões,comoos

receptoresToll-like(TLR).Oobjetivodesteestudofoiinvestigarascaracterísticasclínicasea

frequênciadepolimorfismosemTLR4(Asp299GlyeThr399Ile)emumacoortedepacientes

brasileiroscomEA.

Métodos:Fez-seumestudotransversalqueenvolveu200pacientescomdiagnósticodeEA

eum grupocontrolesaudávelde 200indivíduos.Mediram-sea atividadeda doenc¸a,a

gravidadeeacapacidadefuncional.Oestudodospolimorfismosem TLR4foifeitocom

ométododepolimorfismodefragmentosderestric¸ão.OHLA-B27foianalisadoporreac¸ão

emcadeiadapolimeraseconvencional.Usou-seoprogramaSPSSStatistics20daIBMpara

aanáliseestatísticaeforamconsideradossignificativosvaloresdepinferioresa0,05.

Resultados:Amédiadeidadeeadurac¸ãodadoenc¸aforamde43,1±12,7e16,6±9,2anos,

res-pectivamente.Aamostrafoipredominantementedosexomasculino(71%)edenãobrancos

(52%).Dogrupodepacientes66%eramHLA-B27positivos.Aamostradepacientesfoi

carac-terizadaporumaalterac¸ãofuncionalmoderadaeumelevadograudeatividadedadoenc¸a.

Nãofoi encontradaassociac¸ãoestatisticamentesignificativaentreospolimorfismosem

TLR4easusceptibilidadeàEA.

Conclusões:OspolimorfismosemTLR4399e299nãoforammaisfrequentesempacientes

comEAemcomparac¸ãocomcontrolessaudáveisenenhumadasvariáveisclínicasesteve

associadaaessespolimorfismos.

licenc¸aCCBY-NC-ND(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

∗ _Autor_para_{correspondência}_.

E-mail:mpinheiro@uol.com.br(M.M.Pinheiro).

http://dx.doi.org/10.1016/j.rbr.2016.05.004

(2)

Clinical

characteristics

and

frequency

of

TLR4

polymorphisms

in

Brazilian

patients

with

ankylosing

spondylitis

Keywords:

Ankylosingspondylitis

TLR-4polymorphisms

HLA-B27

a

b

s

t

r

a

c

t

Objectives: Innateimmunityisinvolvedinthephysiopathologyofankylosing

spondyli-tis(AS),withtheparticipationofGram-negativebacteria,modulationofhumanleukocyte

antigen(HLA)B27andtheinvolvementofpatternrecognitionreceptors,suchasToll-like

receptors(TLRs).Theaimofthisstudywastoinvestigatetheclinicalcharacteristicsand

fre-quencyofTLR4polymorphisms(Asp299GlyandThr399Ile)inacohortofBrazilianpatients

withAS.

Methods: Across-sectionalstudywascarriedoutinvolving200patientswithadiagnosis

ofASandahealthycontrolgroupof200individuals.Diseaseactivity,severityand

functi-onalcapacityweremeasured.ThestudyofTLR4polymorphismswasperformedusingthe

restrictionfragmentlengthpolymorphismmethod.HLA-B27wasanalyzedbyconventional

polymerasechainreaction.TheIBMSPSSStatistics20programwasusedforthestatistical

analysis,withp-valueslessthan0.05consideredsignificant.

Results: Meanageanddiseasedurationwere43.1±12.7and16.6±9.2years,respectively.

Thesamplewaspredominantlymale (71%)andnon-Caucasian(52%).Atotalof66%of

thegroupofpatientswerepositiveforHLA-B27.Thesampleofpatientswascharacterized

bymoderatefunctionalimpairmentandahighdegreeofdiseaseactivity.Nosignificant

associationwasfoundbetweenthetwoTLR4polymorphismsandsusceptibilitytoAS.

Conclusions: TLR4polymorphisms399and299werenotmorefrequentinpatientswithAS

incomparisontothehealthcontrolsandnoneoftheclinicalvariableswereassociatedwith

thesepolymorphisms.

BY-NC-NDlicense(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Introduc¸ão

Receptores de reconhecimento de padrões (PRR) são um

conjunto de receptores envolvidos no reconhecimento de

patógenosemorganismosmulticelulares.ReceptoresToll-like

(TLR)1_atuam_como_PRR_e_desempenham_um_papel_essencial

noreconhecimentodecomponentesmicrobianoseligantes

endógenosinduzidosdurantearespostainflamatória.2–4

Entre os polimorfismos genéticos do TLR, alguns dos

maisamplamenteestudadossãoduasmutac¸õesfuncionais

cossegregadasnodomínioextracelulardoTLR4humano,

loca-lizadasnocromossomo4eassociadasarespostadiminuída

alipopolissacarídeos bacterianos (LPS).5 _Com _base_em _sua

evidênciadeassociac¸ãoaumrisco aumentadodeinfecc¸ão

por bactérias Gram-negativas,5 _esses _{polimorfismos} _foram

avaliados em algumas doenc¸as inflamatórias nas quais a

participac¸ãodessesmicrorganismos temsido implicada na

etiopatogenia,comoaespondiliteanquilosante(EA).

Baseadonapremissadecolitesubclínicaempacientescom

EAe modelos animais que demonstram a participac¸ão de

umgatilhoinfecciosoporbacilosgram-negativos6,7_modulada

pelaapresentac¸ãodoantígenoaoHLA-B27,8_o_objetivo_do

pre-senteestudofoiidentificarafrequênciadepolimorfismosem

TLR4(Asp299GlyeThr399IIe)empacientesbrasileiroscomEA

einvestigarpossíveisassociac¸õesentreessespolimorfismose

umamaiorsuscetibilidadeàdoenc¸a,bemcomoaspectos

clí-nicoselaboratoriaisdaatividadedadoenc¸aecronicidade.

Osresultadosdaassociac¸ãoentrepolimorfismosemTLR

eaEAforamcontroversosemalgunsensaiosclínicos,9

pro-vavelmenteporcausadapopulac¸ãodistintaestudada.Esse

fatomotivaainvestigaçãodestaassociaçãoempopulações

miscigenadas,comoabrasileira.

Material

e

métodos

Duzentos pacientescom diagnóstico de EA deacordo com

os critérios de Nova York modificados10 _ou

espondiloar-triteaxial11 _foram _recrutados_da _clínica_de_{espondiloartrite}

do Setor de Reumatologia da Universidade Federal de São

Paulo(Brasil);selecionaram-seainda200indivíduossaudáveis

entrevoluntáriosquedoaramsanguenohospitaldamesma

instituic¸ãoentremaiode2011eoutubrode2013.Todosos

par-ticipantesconcordaramemparticipardoestudoeassinaram

um termo de consentimento informado (pesquisa número

1.804/10noComitêdeÉtica).

Coletaram-se dados demográficos e clínicos e

empregaram-seferramentasdeavaliac¸ãoespecíficasparaa

caracterizac¸ãoda atividadeegravidade dadoenc¸a,como o

BathAnkylosingSpondylitisDiseaseActivityIndex(Basdai),12

An-kylosingSpondylitisDiseaseActivityScore(Asdas),13_Bath

Anky-losing Spondylitis Functional Index (Basfi),14 _Bath _Ankylosing

Spondylitis Metrology Index (Basmi)15 _e _Modified _Stoke

An-kylosingSpondylitisSpineScore(mSASSS).16

A análisedos polimorfismosAsp299Gly e Thr399Ile nos

TLR4foifeitacomareac¸ãoemcadeiadapolimerase(PCR),

seguida peladigestão com enzimas de restric¸ão paracada

alelo (NCOI para 299 e Hinfl para 399).17,18 _A _extrac¸ão _do

DNAgenômicofoifeitacomsanguetotalcom

etilenodiami-notetraacetato(EDTA)comumkitdeextrac¸ãodeDNA(DNA

(3)

feitacom50ngdoDNAaserestudadoemumvolumetotal

de20␮Lcom0,8␮Ldecloretodepotássio50mM,2␮LdeTris

(pH8,4),0,6mMdecloretodemagnésio,0,4mLdecadaprimer

(10nM),0,4␮Ldemisturadedesoxirribonucleotídeos(dATP,

dCTP,dGTPedTTP)e0,06␮Ldeunidadesde PlatinumTaq

DNAPolimerase(0,015U/␮L).

O termociclador automático (MJ Research PTC-200) foi

programado para amplificac¸ão: desnaturac¸ão inicial (95◦ _C

durantequatrominutos),seguidode35ciclosde95◦_C_durante

45 segundos, 55◦ _C _durante ₃₀ _segundos _e ₇₂◦ _C _durante

90segundos,comumaextensãofinala72◦_C_durante₁₀_min.

Osprimers forwardereverseforam,respectivamente,5′_-GAT

TAGCATACTTAGACTACTACCTCCATG-3’e5′_-GAT_CAA_CTT

CTGAAAAAGCATTCCCAC-3’paraoAsp299Glye5′_-GGT_TGC

TGTTCTCAAAGTGATTTTGGGAGAAe5′_-CCT_GAA_GAC_TGG

AGAGTGAGTTAAATGCT-3’paraoThr399Ile.Fez-se

eletro-foreseemgeldeagarosea2%paraconfirmaraamplificac¸ão

deDNA.

Usou-seumaalíquotade5␮Lcomaenzimaderestric¸ão

adequadaparaadigestãodoprodutodaPCRa37◦_C_durante

duashoras.Fez-seeletroforeseemgeldeagarosea4%

(Aga-rose1000Invitrogen,Eugene,Oregon,EUA)paraaidentificac¸ão

dosalelosdoTLR4.OgelfoicoradocomSybrGold(Nucleicacid

gelstain,Invitrogen,Eugene,Oregon,EUA)evisualizadocom

oStorm849system(MolecularDynamics,EUA).

AanálisedoHLA-B27foifeitacomaPCRconvencionalem

umtermociclador automático(MJ ResearchPTC-200): 70ng

deDNAdecadaamostra,0,9␮mol/Ldecadaprimerforwarde

reverse,1,1mmol/Ldecloretodemagnésio,200␮mol/Lde

mis-turadedesoxirribonucleotídeos(dATP,dCTP,dGTPedTTP)e

2UdeTaqDNAPolymeraseparaumvolumetotalde25␮L.Os

primersforwardereverseforam,respectivamente,E91S(5′_-GGG

TCTCACACCCTCCAGAAT-3′₎_e_136AS₍₅′_-CGG_CGG_TCC_AGG

AGCT-3′_)._As_condic¸ões_dos_ciclos_foram_de₁₀₀_segundos_a

94◦_C,_seguido_por₃₀_ciclos_de_um_minuto_a₉₄◦_C,_um_minuto

a64◦_C_e_dois_minutos_a₇₂◦_C,_com_uma_extensão_final_a₇₂◦_C

durante10minutosem40ciclosconsecutivos.

Paraavaliaraqualidade da reac¸ão(controleinterno), as

reac¸õesforamfeitas comprimersparaß-globinaparatodas

asamostras,nasmesmascondic¸õesusadasparaasreac¸ões

do HLA-B27. Os primers para essas reac¸ões foram o PCO4

(5′_-CAA _CTT_CAT_CCA_CGT_TCA_CC-3′₎_e_GH20₍₅′_-GAA_GAG

CCAAGGACAGGTAC-3′_)._Os_produtos_da_PCR_foram

analisa-dospormeiodaeletroforeseemgeldeagarosea1%durante

umahoraa100V.

Os dados numéricos foram expressos como a média e

desviopadrão.Usou-seotestedeKolmogorov-Smirnovpara

determinaradistribuic¸ãodosdados(normalounãonormal).

Usou-seotestedeMann-WhitneyouotestedeKruskal-Wallis

para comparac¸ões entre dados categóricos e numéricos.O

testedequi-quadradofoiusadoparadeterminaradistribuic¸ão

dospolimorfismosemTLR4entreosgrupos,bemcomoparaa

comparac¸ãodasvariáveiscategóricas.Calcularam-seos

coe-ficientesdecorrelac¸ãodeSpearmanparadeterminaraforc¸a

da correlac¸ãoentre as variáveis contínuas. Construíram-se

modelosderegressãologísticabivariadaemultivariadacom

asvariáveisqueapresentaramassociac¸õesestatisticamente

significativasnostestesanteriores.Usou-seoprogramaSPSS

20daIBMparaaanáliseestatísticaeforamconsiderados

sig-nificativososvaloresdepinferioresa0,05.

Resultados

A tabela1apresenta os dados clínicosedemográficosdos

200pacientes.Comoesperado,osexomasculinofoi

predo-minante.Aproximadamenteumquartodospacientestinha

antecedentesfamiliaresdeEAemetadedaamostrarelatou

envolvimentoperiférico atualou pregresso.Quase 40%dos

pacientes tinha uveíteanterior.As taxasde prevalênciade

tabagismoatualeapráticaregulardeexercíciosfísicosforam

baixas.

A média na atividade da doenc¸a foi elevada, com um

comprometimentosignificativonafunc¸ãoemobilidadeque

refletiuadurac¸ãoprolongadadadoenc¸a.Maisde60%dos

paci-entesfaziausoregulardeumfármacoanti-inflamatórionão

esteroidee35%usavamumfármacoantirreumático

modifi-cadordadoenc¸asintético.Quasemetadedospacientesusava

inibidoresdoTNF-␣,comigualdistribuic¸ãoentreetanercept,

infliximabeeadalimumabe.

OestudodoHLA-B27foifeitoem197(98,5%)pacientescom

EAe60(30%)indivíduossaudáveis,66%(n=130)e1,6%(n=1)

dosquaistestarampositivo,respectivamente.Manifestac¸ões

extra-articulares foramencontradasem80pacientes (40%),

a mais frequente das quais foi a uveíte anterior aguda

(n=74;37%),seguidapelabalanitecircinada(n=3;1,5%),colite

nãoespecífica(n=2;1%)euretriteestéril(n=1;0,5%).

Nãoforamencontradasdiferenc¸asestatisticamente

signi-ficativasentreospacientesecontrolessaudáveisemrelac¸ão

aospolimorfismosAsp299GlyeThr399Ile.Emdecorrênciada

quantidademuitobaixadehomozigotos,osheterozigotose

os homozigotosforam incluídos no mesmogrupo para os

testes. Os polimorfismos 299 e 399 estavam em equilíbrio

deHardy-Weinberg(HW)nospacientes(HW-␹2=0,73,p=0,39

e HW-␹2=0,22,p=0,63, respectivamente) e controles

(HW--␹2=0,68,p=0,41eHW-␹2=0,26,p=0,61,respectivamente),

oquedemonstraaconservac¸ãodefrequênciasdegenótipos

aolongodasgerac¸ões(tabela2).Encontrou-seumatendência

amaiorfrequênciadenãocossegregac¸ãodosalelosnogrupo

controleemcomparac¸ãocomospacientescomEA(tabela3).

Paraumaanálisemaisdetalhada,ospacientesforam

divi-didosemsubgruposcombaseemcaracterísticasclínicas.As

pacientes dosexofemininotinham maioríndicedemassa

corporal(IMC),bemcomomaioresescoresnoHAQ-Se

Asdas--VHS.Asmulherestambémtinhamumamenordurac¸ãoda

doenc¸a,menorgravidadedoenvolvimentosacroilíaco,bem

comomenoresescoresnomSASSSeBasmiemcomparac¸ão

com oshomens(tabela3). Depoisdecontrolarvariáveis de

confusão no modelo de regressão logística, apenas o IMC

(p=0,014)eapontuac¸ãono Basmi(p=0,02) permaneceram

significativamenteassociadosaosexo.

Na análise de regressão logística, com a positividade

para o B27 como variável dependente, foram encontradas

associac¸õessignificativascomaartriteperiférica(p=0,039),

uveíte (p=0,033) e uso de inibidores do TNF-␣ (p=0,003)

(tabela4).EntreospacientesHLA-B27positivos,encontrou-se

umatendênciaaumpredomíniodebrancos(p=0,058).Além

disso, encontraram-senessegrupomaiorestaxas de

preva-lênciadeuveíteanterior,envolvimentosacroilíacomaisgrave

(grauIV),maiortempodedurac¸ãoda doenc¸aeumamaior

(4)

Tabela1–Dadosclínicosedemográficosdepacientescomespondiliteanquilosanteecontrolessaudáveis

Característicasclínicas Pacientes(n=200) Controles(n=200) p

Idade(anos) 43,1±12,7 38,5±11,2 0,001

Sexomasculino(n,%) 142(71) 121(60,5) 0,027

Etniabranca(n,%) 96(48)

Durac¸ãodossintomas(anos) 16,6±9,2

Tempodediagnóstico(anos) 7,6±6,2

AntecedentesfamiliaresdeEA(n,%) 46(23)

Presenc¸adeHLA-B27(n,%) 130(66)

Envolvimentoperiférico(n,%)

Artrite(pregressaouatual) 99(49,5) Entesite(pregressaouatual) 129(64,5)

Envolvimentoaxialisolado(n,%) 42(21)

Envolvimentodoquadril(n,%) 26(13)

Uveíteanterior(pregressaouatual)(n,%) 74(37)

Hábitosdevidaatuais(n,%)

Tabagista 19(9,5)

Atividadefísicaregular 44(22)

Índicesdedoenc¸asespecíficos

BASDAI 2,25±2,02

BASMI 4,28±2,30

BASFI 3,80±2,52

ASDAS-VHS 2,20±1,06

ASDAS-PCR 2,07±1,08

HAQ-S 1,05±1,35

mSSASS 19,0±22,32

Testesdaatividadeinflamatória

VHS(mm) 21,92±20,47

PCR-us(mg/dL) 8,96±13,53

Tratamentoconvencionalatual(n,%)

AINE 125(62,5)

Glicocorticoides 12(6)

Metotrexato 34(17)

Sulfassalazina 18(9)

InibidoresdoTNF-˛(n,%) 81(40,5)

Infliximabe 35(17,5)

Etanercept 24(12)

Adalimumabe 22(11)

AINE,anti-inflamatórionãoesteroide;ASDAS,AnkylosingSpondylitisDiseaseActivityScore;BASDAI,BathAnkylosingSpondylitisDiseaseActivity Index;BASFI,BathAnkylosingSpondylitisFunctionIndex;BASMI,BathAnkylosingSpondylitisMetrologyIndex;EA,espondiliteanquilosante;HAQ-S,

HealthAssessmentQuestionnaire-Spondylitis;mSSASS,modifiedStokesAnkylosingSpondylitisSpineScore;PCR-us,proteínaCreativaultrassensível; VHS,velocidadedehemossedimentac¸ão.

TesteUdeMann-Whitney.

Tabela2–FrequênciadepolimorfismosemTLR4(299 e399)empacientesecontroles

Polimorfismos emTLR4

Pacientes n=200

Controles n=200

p

Asp299Gly

Selvagem 182(91%) 178(89%) 0,505 Heterozigoto 17(8,5%) 22(11%)

Homozigoto 1(0,5%) 0

Thr399IIe

Selvagem 187(93,5%) 186(93%) 0,50 Heterozigoto 13(6,5%) 14(7%)

Homozigoto 0 0

Testedequi-quadrado.

Ospacientescomaformaadultadadoençativeramuma maiorpontuaçãonoBasfi,BasdaieHAQ-S,tinhammaisidade emaiortempodeduraçãodadoença.Aquelescomaforma juvenildadoençaapresentavammaisrelatosde anteceden-tes familiares de EA, faziam mais uso de sulfassalazina e relatavammaisefeitoscolateraisdeinibidoresdoTNF-␣.No entanto,nenhumadessasvariáveispermaneceu estatistica-mentesignificativanomodeloderegressãomúltiplafinal.

Pacientesnãobrancostiverammaiorpontuac¸ãonoIMCe Basmi emcomparac¸ãocom brancos(tabela6).Noentanto,

apenasapontuac¸ãodoBasmipermaneceuestatisticamente

significativanaanálisederegressãologística(p=0,004).Ograu

mais frequente de sacroileíte radiográfica foi o III (n=103;

(5)

Tabela3–Característicasdospacientescomespondilite anquilosantedeacordocomosexo

Variáveis Masculino (n=142)

Feminino (n=58)

p

Etnia

Branca 67(47,2%) 29(50%) 0,717 Nãobranca 75(52,8%) 29(50%)

Início

Adulto 118(83,1%) 50(86,2%) 0,586 Juvenil 24(16,9%) 8(13,8%)

HLA-B27+ 96(67,6%) 34(58,6%) 0,158

Artrite 68(47,9%) 31(53,4%) 0,475

Entesite 93(65,5%) 36(62%) 0,646

Uveíteanterior 53(37,3%) 21(36,2%) 0,882

Antecedentesfamiliares deEA

36(25,3%) 10(17,2%) 0,216

Envolvimentoaxialpuro 29(20,4%) 13(22,4%) 0,754

IMC(kg/m2₎ _24,81±3,72 25,80±3,87 0,02

BASMI 4,63±2,22 3,43±2,27 0,001

mSASSS 22,54±23,34 10,64±17,2 <0,0001

ASDAS-VHS 2,11±1,05 2,42±1,04 0,036

HAQ-S 1,03±0,61 1,11±2,33 0,03

VHS(mm) 19,3±19,6 28,35±21,31 0,001

Durac¸ãodadoenc¸a (anos)

17,5±9,43 14,43±8,5 0,02

Sacroileíteradiográfica

II 11(7,7%) 4(7,0%) 0,044

III 66(46,5%) 38(65,5%)

IV 65(44,0%) 16(27,6%)

ASDAS, Ankylosing Spondylitis Disease ActivityScore; BASMI, Bath Ankylosing Spondylitis Metrology Index; EA, espondilite anquilo-sante;IMC,índice demassacorporal; HAQ-S,HealthAssessment Questionnaire-Spondylitis;mSASSS,modifiedStokesAnkylosing Spondy-litisSpineScore;VHS,velocidadedehemossedimentac¸ão.

Testesdequi-quadradoeMann-Whitney. Thepvalueinboldmeansstatisticallysignificant.

Entre os pacientes em uso de inibidores do TNF-␣, 20 (24,7%)precisarammudardeagentes:cinco(6,2%)em decor-rênciadefalhaprimária(6,2%),seis(7,4%)emrazãodefalha secundáriae13 (16%)emdecorrência deeventosadversos, especialmentereac¸õesàinfusãoeinfecc¸ões.Alémdisso, qua-tro(2%)dessespacientes mudarammaisdeduas vezesde inibidoresdeTNF-␣.

Auveíteanterioresteveassociadaaummaiortempode duraçãoda doença(p=0,002),masperdeusuasignificância estatísticanomodelofinal.Oenvolvimentodoquadrilesteve associadoacronicidadeecontagensmaisbaixasdeatividade dadoença (dadosnãomostrados).Nomodelo deregressão logísticafinal,omaiortempodeduraçãodadoença(p=0,039), umapontuaçãomaiselevadanoBasfi(p=0,027)eumamenor pontuação no Basdai (p=0,024) mantiveram-se estatistica-mentesignificativos.

Os pacientes com maior tempo de duração da doença tinhammaiorpontuaçãonomSASSSeBasmi,bemcomoum menorescorenoAsdas-VHS.Nomodelofinal,apenasoescore doAsdas-VHS(p=0,015)permaneceusignificativo.A maior duraçãodossintomassecorrelacionoucomescoresmaisaltos noBasmi,Basfi,HAQ-SemSSASS,bemcomoaumapontuação maisbaixanoBasdai.Nomodelofinal,osescoresdoBasmi

Tabela4–Característicasdospacientescomespondilite anquilosantedeacordocomapositividade

paraoHLA-B27

Variáveis HLA-B27

positivo (n=130)

HLA-B27 negativo (n=67)

p

Etnia

Branca 69(53,1%) 26(39%) 0,058 Nãobranca 61(46,9%) 41(61,2%)

Início

Adulto 103(82,4%) 55(87,3%) 0,386 Juvenil 22(17,6%) 8(12,7%)

Artrite 58(44,6%) 40(59,7%) 0,045

Entesite 85(65,4%) 43(64,2%) 0,867

Uveíte 56(43,1%) 17(25,4%) 0,015

Antecedentesfamiliares deEA

31(23,8%) 14(20,9%) 0,640

II 9(6,9%) 6(8,9%) 0,01

III 59(45,4%) 44(65,7%)

IV 62(47,7%) 17(25,4%)

Envolvimentoaxialpuro 28(21,5%) 12(17,9%) 0,549

Durac¸ãodadoenc¸a (anos)

8,28±6,57 6,39±5,07 0,039

InibidoresdoTNF-˛ 59(45,4%) 16(23,9%) 0,003

EA,espondiliteanquilosante.

Testesdequi-quadradoeMann-Whitney. Thepvalueinboldmeansstatisticallysignificant.

Tabela5–Característicasdospacientescomespondilite anquilosantedeacordocomaetnia

Variáveis Branca

(n=96)

Não branca (n=104)

p

Início

Adulto 78(81,3%) 90(86,5%) 0,3 Juvenil 18(18,7%) 14(13,5%) 0,8

Artrite 47(49%) 52(0,5%) 0,883

Entesite 61(63,5%) 68(65,4%) 0,786

Uveíte 34(35,4%) 40(38,5%) 0,656

Antecedentes familiaresdeEA

23(24%) 23(22,1%) 0,757

II 6(6,2%) 9(8,6%) 0,037

III 59(61,4%) 45(43,3%)

IV 31(32,3%) 50(48,1%)

Envolvimentoaxial puro

21(21,8%) 21(20,2%) 0,770

IMC(kg/m2₎ _24,81_±_3,72 _25,8_±_3,87 _0,048

BASMI 3,89±2,18 4,65±2,36 0,023

BASMI,BathAnkylosingSpondylitisMetrologyIndex;EA,espondilite anquilosante;IMC,índicedemassacorporal.

(6)

Tabela6–Característicasdospacientescomespondilite anquilosantedeacordocomoenvolvimentodoquadril

Variáveis Envolvimentodoquadril p

Sim(n=26) Não(n=174)

Idade(anos) 47,7±11,3 42,4±12,7 0,035 Tempode

diagnóstico (anos)

10,3±7,9 7,2±5,9 0,04

Durac¸ãoda doenc¸a(anos)

23,4±9,6 15,6±8,8 <0,0001

BASDAI 1,20±1,43 2,42±2,06 0,001 BASMI 5,55±1,52 4,10±2,33 0,002 BASFI 5,03±2,52 3,61±2,48 0,011 mSASSS 27,33±24,46 17,77±21,80 0,035 ASDAS-PCR 1,55±0,88 2,14±1,09 0,009 HAQ-S 1,86±3,72 0,93±0,61 0,017

ASDAS,AnkylosingSpondylitis DiseaseActivityScore;BASDAI,Bath AnkylosingSpondylitisDiseaseActivityIndex;BASFI,BathAnkylosing SpondylitisFunctionIndex;BASMI,BathAnkylosingSpondylitis Metro-logyIndex;mSASSS,modifiedStokesAnkylosingSpondylitisSpineScore. Testesdequi-quadradoeMann-Whitney.

Thepvalueinboldmeansstatisticallysignificant.

(p < 0,0001) e Basdai(p=0,016) permaneceram estatistica-mentesignificativosapósajustesmúltiplos.

Quandoospacientesforamclassificados–deacordocom osescoresdoAsdas–emremissão(<1,3),atividadedadoenc¸a moderada (≥ 1,3 e<2,1), alta (≥ 2,1 e<3,5) ou muito alta (≥3,5),encontraram-seasseguintesfrequências:14%(n=28), 31,5%(n=63),37%(n=74)e17,5%(n=35),respectivamente.

A pontuac¸ão no Basdai se correlacionou positivamente com o Basfi, Asdas-VHS, Asdas-PCR, VHS, PCR e HAQ--S e se correlacionou negativamente com o mSSASS. Após regressão linear multivariada, o Basdai permaneceu significativamente correlacionado com o Basfi (p=0,001), HAQ-S(p=0,047),Asdas-VHS, Asdas-PCReVHS(p<0,0001), masnãocomaPCR(p=0,247).

Discussão

Os polimorfismosem TLR4399 e 299não foram mais fre-quentes em pacientes brasileiros com EA em comparação com controles saudáveis, pois não houve diferença esta-tisticamente significativa entre o grupo de pacientes e o grupo controle. A influência dos polimorfismos em TLR4 naetiopatogenia deinfecções, especialmente porbactérias gram-negativas, é bem conhecida,19 _já_que _esses

polimor-fismos resultam em um fenótipo que é pouco sensível

às endotoxinas derivadas do processo infeccioso que

pro-vocam a transduc¸ão aberrante do sinal na presenc¸a de

microrganismos.Noentanto,diversosautoresrecentemente

questionaramainfluênciadepolimorfismosdessereceptor

naprogressão,gravidadeedesfechodeinfecc¸ões,oquesugere

queosfatoresrelacionadoscomohospedeirosãomais

impor-tantesdoqueospolimorfismospropriamenteditos.20,21

Componentesbacterianosouintracelularespodeminiciar

oprocessoinflamatórioeprovocarsensibilizac¸ãoaum

antí-geno endógeno por meio do mimetismo molecular, ativar

persistentementeaimunidadeinataadaptativaeperpetuar

oprocesso inflamatório.Ogatilhopodenãoser

necessaria-mentepatogênico, masfazerparteda microbiotaresidente

normalepodeculminarcomodesenvolvimentodedoenc¸as,

comoaEA,emindivíduosgeneticamentesusceptíveis.2

Háalgumasevidênciasdeumaassociac¸ãoentre

polimor-fismosemTLR(299e399)eaEA,6,22,23_mas_essa_{associac¸ão}

nãofoiconfirmadaporoutrosestudos.24–26_O_mesmo_é

ver-dadeiro para o Asp896Gly.27 _O _polimorfismo_S180L _de_uma

proteína adaptadora do TLR2 e 4 (TIRAP), que

demons-troudesempenharumpapelprotetorcontraaocorrênciade

lúpus eritematoso sistêmico, também demonstrounão ter

associac¸ãocomaEA.28

Kyo et al. descobriram que camundongos mutantes

(C3H/Hej)paraTLR4nãodesenvolveramartriteapósainjec¸ão

intra-articular de LPSde E. coli, ao contráriodo grupo

sel-vagem.29_Isso_levantou_a_hipótese_de_que_a_mutac¸ão_no_TLR4

podediminuiraintensidadedarespostaimuneinataeterum

papelprotetor,emvezdepromoveraautoimunidade.

Os presentes dados mostram que os polimorfismos

299e399emTLR4nãosãofatoresgenéticosdemaior

sus-ceptibilidadeàEA,oqueestádeacordocomumametanálise

recente que envolveu dados compilados de nove estudos

sobre esse tema.30 _Além _disso, _é_importante _ressaltar _que

umdosmaioresestudosgenéticosfeitos(The

Australo-Anglo--AmericanSpondyloarthritisConsortium),queenvolveumaisde

doismilpacientesdeascendênciaeuropeiacomEA,também

nãoencontrouassociac¸ãoentreosTLR easusceptibilidade

àdoenc¸a.9 _De_acordo_com _os_autores_citados, _as_principais

associac¸õesocorreramcomdoisgenesisolados(2p15e21q22),

bemcomocomaIL-23R,IL-1R2,ANTXR2eERAP-1.

A expressão do TLR4 está relacionada com a interface

entreosistemaimuneeoambiente,bemcomocomas

res-postas inflamatórias agudas e crônicas em pacientes com

EA,31–33 _mas_os _{polimorfismos} _não _parecem _estar

associa-dos a um maior risco de desenvolver a doenc¸a.30 _Estudos

populacionaisqueenvolveramindivíduossaudáveisindicam

heterogeneidadenadistribuic¸ãogeográficadesses

polimorfis-mos. Asfrequênciasvariaramde 4a10%embrancos34 _na

presentecoorte,enquantoserelatouumafrequênciade16%

entreosafricanos.35 _Não_há_relatos_desse_polimorfismo_em

asiáticos.25

Considerandoqueapopulac¸ãobrasileiraéaltamente

mis-cigenadaentrediversosgruposétnicos,nãosepodemgarantir

resultadossemelhantessepacientesdeoutraspartesdopaís,

especialmentesemorigemeuropeia,tivessemsidoincluídos.

Nãosepodedescartarapossibilidadedeumaassociac¸ão

fraca,quepodeserrepresentativaemumtamanhode

amos-tramaiordoqueausadanopresenteestudo.Noentanto,um

trabalhofeitonoReinoUnidoqueenvolveumaisde500

paci-entescomEAtambémnãoencontrouassociac¸ão.6_O_mesmo

éverdadeparaoutrasetnias,comopopulac¸õeshúngaras,

fin-landesas, coreanas, canadenseseholandesas. Outro ponto

aconsiderar éabaixaprevalênciadegenótipos

homozigo-tosparaospolimorfismosemTLR4napresentecoorte,que

ésemelhanteaosresultadosdescritosemoutraspopulac¸ões.

Demonstrou-sequeratostransgênicosparaHLA-B27não

desenvolvem inflamac¸ãodasêntesesouintestinos,embora

esses animais desenvolvam lesões genitais e de pele sob

condic¸ões estéreis, o que demonstra o papel dos agentes

(7)

participac¸ão doambienteéumfatordeterminante no

sur-gimento da doenc¸a, já que apenas 2 a 5% da populac¸ão

positiva para HLA-B27 adesenvolvem. Baseado nestefato,

investigou-seainterac¸ãoentreoHLA-B27epolimorfismosem

TLR4napresenteamostra,masessanãofoiencontrada,pois

nãoforamdetectadasdiferenc¸assignificativasnos

polimor-fismosentreospacientesecontrolessaudáveis.Alémdisso,a

quantidadedepacientescompolimorfismosfoirelativamente

pequena.

Emrelac¸ãoaos aspectosclínicos,os homens

apresenta-ramdanos radiográficos axiais maisgraves emaior tempo

dedurac¸ão da doenc¸a doqueas mulheres,o queé

seme-lhanteaosresultadosdescritosporoutracoortebrasileira,37

bemcomoemoutraspopulac¸ões,emborasemdiferenc¸a

signi-ficativadegêneroemrelac¸ãoaoenvolvimentoperiférico.38_No

entanto,essesachadosdevemserinterpretadoscomcautela,

umavezqueasúnicasdiferenc¸asestatisticamente

significati-vasapósocontroleporvariáveisdeconfusão,especialmente

aduraçãodadoençaeaidade,foramapontuaçãonoBasmi,

quefoimaiornosexomasculino,eoIMC,quefoimaiorentre

asmulheres.

A miscigenac¸ão provavelmentecontribuiu para as duas

peculiaridadesencontradasnapresenteamostra.Aprimeira

foiamenorfrequênciadepositividadeparaoHLA-B27(66%)

emcomparac¸ãocomoutracoortebrasileira(78,2%)37_e

estu-dosqueenvolverampopulac¸õesbrancas(maisde90%).39_Da

amostra emquestão,52% eram não brancos, o quereflete

melhorapopulac¸ãobrasileiraemcomparac¸ãocomestudos

anteriores(75,5%depacientesbrancos).37_A_segunda

particu-laridadefoiomaiorenvolvimentoperiféricooumisto,oque

tambémfoirelatadoemoutraspopulac¸õesmiscigenadas.39,40

Entre apenas os pacientes brancos do presente estudo, a

frequênciadepositividadeparaoHLA-B27foide75%,oque

émuitopróximodafrequênciarelatadaemumacoorte

bra-sileiraanterior,39_bem_como_a_relatada_em_um_estudo_francês

recente.41

Ospacientescomaltosescoresnoíndicedecronicidade

geralmentetinhammenorpontuac¸ãonoíndicedeatividade

da doenc¸a,tal como aassociac¸ãoentreo envolvimentodo

quadrileumapontuac¸ãopior noBasfiemenorno Basdai.

Domesmomodo,adurac¸ãodadoenc¸asecorrelacionoucom

umamenorpontuac¸ãonoBasdaieumamaiorpontuac¸ãono

Basmi.Curiosamente,apontuac¸ãonoBasdaisecorrelacionou

comoutrosmarcadoresdeatividade(Asdas-VHSePCR),bem

comocomumapiorfuncionalidade,masacorrelac¸ãocoma

PCR,queéumdosparâmetrosmaispadronizadospara

estu-daraatividadeinflamatóriaempacientescomEA,42_não_foi

significativa.

Como esperado, a presenc¸a de HLA-B27 esteve

signi-ficativamente associada a manifestac¸ões extra-articulares

(uveíte)43 _e_menor_envolvimento_periférico, _mas_não_foram

encontradasassociac¸õescomo escoreradiológico ou

qual-querferramenta deavaliac¸ãoespecífica da EA,incluindo a

atividade,func¸ãoemobilidade.Esseachadorefleteo

conhe-cimentomaisrecentedequeesseaspectogenéticonãoéum

fatorassociadoaumpiorprognósticoemrelac¸ãoàformac¸ão

denovoosso.44

A prevalência da forma juvenil (16%) foi semelhante à

encontradaemcaucasianos(8,6a21%),turcos(13,4%)eoutra

coortebrasileira(16%),45_bem_como_mais_baixa_do_que_as_taxas

relatadasparamexicanos(28a54%)ecoreanos(41,3%).46_A

inclusão desses pacientes nãoexerceuum impacto

impor-tantesobreosdesfechosclínicos,laboratoriaisedeimagem

analisados,oqueestádeacordocomanoc¸ãodequeesse

sub-grupoépartedomesmoespectrodadoenc¸a.Emcontraste,

alguns autoresrelataram menorenvolvimentoaxialeuma

maiorproporc¸ão deenvolvimentoperiférico, especialmente

nosjoelhos,emcomparac¸ãocomoiníciodadoenc¸aapósos

16anos.37,45,46

O presente estudo tem limitac¸ões que devem ser

abor-dadas, como o tamanho da amostra para estudos sobre

polimorfismosgenéticoseamaiorproporc¸ãodeindivíduos

caucasianosnessacoorte,oquepodenãorefletirapopulac¸ão

brasileiracomEA.Osdadosdopresenteestudosugeremque

essasvariac¸õesemTLR4nãosãosusceptíveisdeinfluenciar

naetiopatogeniadaEA.Esseachado,noentanto,nãoexclui

apossibilidadedequeasanormalidadesfuncionaisnosTLR

ououtrasmoléculasintimamenteassociadasàsinalizac¸ãode

TLR sejamimportantesnapatogênesedas

espondilartropa-tias.

Financiamento

Bolsa de pesquisa da agência de fomento brasileira

Fundac¸ão de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo

(Fapesp2011/05517-6).

Conflitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.

Agradecimentos

ÀDivisãodeReumatologiaeNefrologiadaEscolaPaulistade

MedicinadaUniversidadeFederaldeSãoPaulo(EPM/Unifesp).

r

e

f

e

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c

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a

s

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