Rev. Soc. Bras. Med. Trop. vol.19 número2

Revista da Sociedade Brasileira de M edicina Tropical

19(2): 79-84, Abr-Jun, 1986

E L M É T O D O D E C U L T I V O “ I N V I T R O ” C O M O I N S T R U M E N T O P R Á C T I C O

E N E L D I A G N Ó S T I C O Y E L A I S L A M I E N T O

P R I M Á R I O D E

LEISHMANIA BRAZILIENSIS BRAZILIENSIS

I. O B S E R V A C I O N E S D E L A B O R A T Ó R I O

Edua rdo M. Net t o, Ce sa r C. Cuba , Philip D. M arsden y Air C. Barretto

C o m p a r a m o s d ife re n te s m e d io s a rtific ia le s y p r o c e d im ie n to s d e c u ltivo

in v itr o

de

L e is h m a n ia b r a z il ie n s is b r a z il ie n s is

(L b b ) a is la d a d e lesio n es d e h a m ste re s

e x p e r im e n ta lm e n te in fec ta d o s. O b se rv a m o s q u e la a sp ira c ió n d e m a te ria l de la lesión,

u sa n d o je r in g a d e 5 m l y a g u j a 2 2 g ( 2 5 x 8 m m ), m o s tr ó r e su lta d o s s a tis fa c to r io s s ie n d o

un p r o c e d im ie n to co n v e n ie n te d e colecta. E l m e d io d e A g a r S a n g r e D ifco (D A B ) es un

m ed io e ficie n te p a r a el a is la m ie n to d e L b b . E l m e d io de E v a n s d e m o stro s im ila re s

resu lta d o s a l D A B , m ie n tra s q u e e l m e d io líq u id o d e S c h n e id e r y el q u ím ic a m e n te

d e fin id o A R - 1 0 3 fu e r o n n itid a m e n te inferiores.

E n la p r o p a g a c ió n

in v itr o

de L b b , e l m e d io d e S c h n e id e r p e r m itió un buen

crecim ien to d e i fla g e la d o , a lc a n z a n d o d e n s id a d e s d e 0 ,2 1

-

2 ,5 7 x 1 0 8 p r o m a s tig o te s

p o r m l y a , en e l 5.° d ia d e cu ltivo . L a a d ic ió n d e 5 -flu o ro c y to sin e a los tu b o s de cu ltivo

( 1 5 0 /jg /m l) p a r a e v ita r la c o n ta m in a c ió n p o r h ongos, no in h ib ió e l crecim ien to d e L bb.

P a la b r a s c la v e s :

L e is h m a n ia b ra zilie n sis brazilien sis.

C u lti v o

in vitro.

A i s l a r e l a g e n te c a u s a i d e la s le is h m a n ia s is e s n e c e s a r io n o s o la m e n t e p a r a e l d ia g n ó s t ic o c o m o p a r a la id e n ti fic a c ió n d e la s u b - e s p é c ie d e

L e is h m a n ia

in fe c ta n te 19. E n lo s e s t u d o s q u im io te r a p é u t ic o s d e la e n fe r m e d a d e s ta m b ié n v a li o s o in te n ta r a is la r e l p a r á s ito p o s tt r a ta m ie n to p a r a p r o b a r , e n fo r m a in c u e s ti o -n a b le , e l é x i t o o fr a c a s o d e u -n d e te r m i-n a d o c o m p u e s to a n t i l e i s h m a n i a l l 6 .

E s e n r e la c ió n a la c o r r e c t a e l e c c i ó n d e i m é t o d o m á s a p r o p r ia d o d e a is la m ie n t o d e i p a r á s it o q u e d e b e m o s a d o p ta r u n a d e c is i ó n p r á c t ic a y e fi c ie n t e . E s te la b o r a t ó r i o h a r e p o r ta d o , m u y r e c ie n te m e n te , s u s h a lla z g o s e n la d e m o n s tr a c ió n d ir e c ta d e

L e is h m a n ia

b ra zilien sis b r a z ilie n s is

e n p a c ie n te s c o n l e s io n e s le is h m a n iá s ic a s c u tâ n e a s y m u c o c u tá n e a s , p r e v a le n -te s en T r ê s B r a ç o s , B a h ia , B r a s i l 9 . E n d i c h o s e s tú d io s , la in o c u la c ió n e n h a m s te r e s d o r a d o s

M e so c ric e tu s

a u ra tu s

fu é e l p r o c e d im ie n to m á s e fi c ie n t e q u e e l m é to d o d e c u lt iv o “ in v it r o ” p a r a e l d ia g n ó s t ic o y a is la m ie n t o p r im á r io d e é s t a s u b - e s p é c ie d e

L e is h ­

m a n ia .

S in e m b a r g o , d e b e m o s a n o ta r q u e , e n e s o s e s tú d io s in i c i a l e s tu v im o s s e r io s p r o b le m a s d e c o n t a ­ m in a c ió n b a c t e r ia n a , p o r h o n g o s y le v a d u r a s , q u e h ic ie r o n fr a c a s a r e l m é to d o c u ltiv o .

N ú c l e o d e M e d i c i n a T r o p i c a l e N u t r i ç ã o , U n i v e r s i d a d e d e B r a s í l i a . 7 0 9 1 0 - B r a s í l i a , D F .

P e s q u i s a f i n a n c i a d a p a r c i a l m e n t e p e l o R E - G R A N T 8 2 0 5 2 6 W H O / T D R e C N P q .

U n i t e d S t a t e s P u b l i c S e r v i c e G r a n t ( A I / 1 6 2 8 2 - 0 4 ) , D e p a r t ­ m e n t o f I n t e r n a t i o n a l M e d i c i n e C o r n e l l M e d i c a i C o l l e g e . N e w Y o r k .

R e c e b i d o p a r a p u b l i c a ç ã o e m 1 8 / 9 / 1 9 8 5

P o s t e r io r m e n te , a le r t a d o s p o r la s p u b lic a c i o n e s d e M i le s 17 y P a lo m i n o

e t a l i i

18 p a s a m o s a u tiliz a r g e n t a m ic in a y 5 - f lu o r o c y t o s in e , r e d u c ie n d o m u c h o l o s ín d ic e s d e c o n t a m in a c ió n d e lo s c u lt iv o s y lo s r e s u lt a d o s d e é s t o s e s t ú d io s s o n p r e s e n ta d o s e n é s ta s e r ie d e tr a b a jo s .

L a p r e s e n te i n v e s t ig a c ió n fo r m u lo lo s d o s o b je ­ t iv o s s ig u ie n te s p a r a g a n a r e x p e r ie n c ia la b o r a to r ia l q u e s e r v ir ia d e b a s e a fu tu r a s in v e s ti g a c io n e s d e c a m p o :

1) A i s l a r

L . b. b r a z ilie n s is

y

L . m e x ic a n a

d e h a m s te r e s e x p e r im e n ta lm e n te in f e c ta d o s , p o r m e d io d e c u lt iv o s . C o m p a r a r la s e n s ib ilid a d d e m e d io s y m é t o d o s d e a is la m ie n to .

2 ) L o g ra r e l c r e c im ie n t o

in vitro

d e lo s p r o m a s ­ ti g o t e s d e e s a s u b - e s p e c ie d e

L e is h m a n ia ,

p ara e s tú d io s d e te x o n o m ia b io q u ím ic a e in m u n o ló g ic a .

M A T E R I A L Y M É T O D O S

1. M e d io s d e C u lt iv o e m p le a d o s :

A ) M e d io T C 1 9 9 ( c u lt iv o d e c é l u l a s d e m a m í­ fe r o s ) G i b c o , L a b s ., N .Y . U S A , s u p le m e n ta d o c o n 2 0 % d e s u e r o b o v in o fe ta l ( S t e r ile S y s te m H y - C l o n e - U S A ) in a c ti v a d o , p o r 3 0 m in u to s , a 5 6 ° C . >4 .

B ) M e d io d e S c h n e id e r ( c u lt iv o d e c é lu la s d e i n s e t o s )

D r o so p h ila

G i b c o m e d iu m , G i b c o , N .Y . U S A , c o m p le m e n ta d o c o n e l m is m o s u e r o b o v in o fe ta l c o m o e n ( A ) 12 13.

N e tto E M , C uba CC, M a rsd e n P D , B arreto A C . E l m étodo de cultivo "in vitro "c o m o instrum ento!práctico en el d ia g n ó s tic o y el a isla m ie n to p rim á rio d e L e i s h m a n i a b r a z i l i e n s i s b r a z i l i e n s i s . I. O bservaciones d e laboratório. R e v ista d a S o c ie d a d e B ra sileira de M ed ic in a Tropical 19: 79-84, A br-Jun, 1986

D ) M e d io d e E v a n s (E v a n s m o d ifie d T o b ie ’s M e d iu m ). M e d io p r e p a r a d o c o m o fu e in d ic a d o p o r E v a n s 10 n .

E ) M e d io q u ím ic a m e n te d e fin id o A R - 1 0 3 . C e d id o p o r e l D r . H . A z e v e d o p a r a lo s e s t ú d io s e n

L e is h m a n ia

y c o n la fo r m u la c i ó n p u b lic a d a p o r A z e v e d o y R o i t m a n 1.

2 . A i s l a m ie n t o p r im á r io d e

L . b. b r a z ilie n s is

y

L . m e x ic a n a sp.

F u e r o n u t il iz a d o s c o m o fu e n te d e c o l e c t a d e i m a te r ia l e x p e r im e n ta l, 6 0 h a m s te r e s d e n u e s tr o b io -te r io d e a n im a le s in o c u la d o s c o n c e p a s

de L e is h m a n ia .

T o d o s lo s a n im a le s p r e s e n ta b a n n ó d u lo s s u b -c u t a n e o s n o u lc e r a d o s e c o n ú lc e r a s r e c ie n te s , p a r a s ito ló g ic a m e n te ic o n f ir m a d o s p o r la u t il i z a ic ió n d e x e n o d ia g -n ó s t i c o s c o -n h e m b r a s d e

L u tz o m y ia w h itm a n i

6 .

E n s u c e s i v o s e x p e r im e n to s (I V I ) tr e s p r o c e -d im ie n t o s fu e r o n e m p le a -d o s p a r a c o n o c e r s u e f ic ie n c ia r e la ti v a c o r r e s p o n d ie n te e n la c o l e c t a d e i m a te r ia l d e la s l e s io n e s , e n lo s a n im a le s . A s i m is m o , 4 m e d io s d e c u lt iv o (g e n ta m ic in a 5 0 ju g /m l) fu e r o n c o m p a r a d o s e n s u e fi c ie n c ia y s e n s ib ilid a d . P r o c e d im ie n to s : a ) D e la a s p ir a c ió n , c o n a g u ja y je r in g a , e n la m a n e r a d e s c r ita p o r H e n d r ic k s y W r i g h t 13, p e r o lig e r a m e n te m o d i­ fic a d o p o r la u t il iz a c ió n d e u n a a g u ja d e c a lib r e m a y o r ( 2 2 g = 2 5 x 8 m m ) y u n a je r i n g a d e 5 m l ( m á s p o te n t e e n s u c c ió n ). b ) D e la m ic r o p ip e ta P a s t e u r , d e p u n ta m u y a fila d a , e s t e r il, q u e e r a in tr o d u c id a e n lo s b o r d e s d e la s h e r id a s o e n lo s n ó d u lo s s u b c u tá n e o s , d e lo s a n im a le s p a r a s it a d o s . E l m a te r ia l c o l e c t a d o c o n 0 , 2 m l d e s u e r o f i s io l ó g i c o ( 0 .8 5 % ) e s té r il e r a , e n to n -c e s , s e m b r a d o e n fo r m a a s é p t i-c a e n d o s tu b o s d e -c a d a m e d io in v e s tig a d o , c ) L a b i o p s ia c o n “ p u n c h ” d e 4 m m d e d iâ m e tr o , q u e p o s te r io r m e n te e r a tr itu r a d a c o n la a y u d a d e u n “ ti s s u e g r in d er " . L a s u s p e n s ió n d e te jid o s e r a e n t o n c e s i n o c u la d a c o m o r e la ta d o a n te ­ r io r m e n te e n l o s c u lt iv o s .

U n e x p e r im e n to ( E 4 ) u t il iz ó la 5 - f lu o r o c y t o s in e

( 1 5 0 ju.g/m l) e n u n g r u p o d e tu b o s d e c u lt i v o D A B a s e r c o m p a r a d o s c o n m e d io s D A B s in a n tifu n g ic o . T o d o s l o s c u lt i v o s e r a n e n t o n c e s m a n te n id o s a 2 3 ° C y e x á m e n e s c o n s e c u t i v o s a la s 4 8 , 7 2 , 9 6 y 1 2 0 h o r a s fu e r o n r e a liz a d o s c o n m i c r o s c o p i o in v e r tid o . P o s t e ­ r io r e s e x á m e n e s a l o s 1 5 y 3 0 d ia s fu e r o n e n s e g u id a e j e c u ta d o s . C o n é s t o p e n s a m o s e s t a b l e c e r e l p e r ío d o m ín im o y m á x im o e n la p o s i t i v a c i ó n d e l o s c u lt iv o s in o c u la d o s .

3 . E s t ú d i o d e i c r e c im ie n t o e n m a s a d e p r o m a s tig o t e s d e c e p a s d e

L . b. b r a z ilie n s is

3 . 1 . E m p l e o d e m é d io s d e c u lt iv o líq u id o s e m i-d e fin ii-d o s :

L o s m e d io s e m p le a d o s fu e r o n : T C 1 9 9 y d e S c h n e id e r (

D r o so p h ila m e d iu m ),

a m b o s s u p le m e n ­ ta d o s c o n 1 5 y 2 0 % d e s u e r o b o v i n o fe ta l. E s t o s m e d io s fu e r o n e s c o g id o s p o r s e r líq u id o s y tr a n s p a ­ r e n te s 17.

E l p r o c e d im ie n to c o n s i s t i ó e n la u t il iz a c ió n d e f r a s c o s p lá s t i c o s d e 2 5 m l ( C o r n in g , U S A ) , c o n t e -n ie -n d o , c a d a u -n o d e e l l o s 5 m l d e i m e d io líq u id o a e x p e r im e n t a r s e . L a m u e s tr a d e

L e is h m a n ia

a e s tu -d ia r s e e r a a ju s ta -d a e n u n a c o n c e n t r a c ió n -d e 1 x 1 0 6 p r o m a s ti g o t e s p o r m l, e n u n v o lu m e n d e 1 0 0 m l d e i m e d io y e n to n c e s in o c u la d a a s é p tic a m e n te . E l r e c u e n to d e i n ú m e r o a p r o x im a d o d e p r o m a s ti g o t e s /m l fu e h e c h o e n e x p e r im e n to s p o r d u p lic a d o y c o n la a y u d a d e u n a c â m a r a d e N e u b a u e r y m ic r o s c o p io d e c o n t r a s t e d e f a s e s . L a o b s e r v a c ió n d e i c r e s c im ie n t o e n lo s fr a s c o s d e c u lt iv o fu é r e a liz a d a , s in n e c e s id a d d e a b rir lo s r e c ip ie n te s , u t il iz a n d o u n m i c r o s c o p i o e s t e r e o s c o p io in v e r t id o Z e is s - J e n a . T o d o s l o s “ s t o c k s ” a is la d o s fu e r o n r á p id a m e n te c r i o p r e s e r v a d o s , lu e g o d e i p ri­ m e ir o o s e g u n d o p e s a je “ in v it r o ” y , d e s p u é s d e c o d i f i c a d o s , d e p o s it a d o s e n n u e s tr o c r io b a n c o d e c e p a s d e

L e is h m a n ia ,

a - 1 9 6 ° C .

L o s d e t a ll e s la b o r a to r ia le s d e la s c e p a s u tili­ z a d a s e n é s te e s tú d io fig u r a n e n la T a b la 1.

T a b la 1 -

C a ra cterístic a s b io ló g ica s y b io q u ím ic a s de cepas d e

L e is h m a n ia b r a z il ie n s is b r a z il ie n s is

u tiliza d a s

en los e x p e rim e n to s de cu ltivo

in v itro .

C ó d ig o d e la cepa

( C rio b a n co -B ra silia )

K - D N A (2 ,3 )

A n a lis is por:

Is o e n z im a s (7 )

A n tic u e rp o s (7 )

M o n o c lo n a le s

P a tró n d e i (7 )

D esa rro llo en

F le b ó to m o

M H O M / B R / 7 6 / L T B - O O 1 4 ( L ) * + +

+

+ ( P e r y p i l a r ia ) M H C ) M / B R / 7 7 / L T B - 0 0 1 4 ( R ) + +

+

+ (P e r y p il a r i a ) M H O M / B R / 7 7 / L T B - 0 0 4 2

+

+ + + (P e r y p il a r ia ) M H O M / B R / 7 8 / L T B - 0 0 4 8

+

+ + + (P e r y p il a r ia ) M H O M / B R / 7 9 / L T B - 1 0 7

+

+ N . H . + (P e r y p il a r ia )

M H O M / B R / 7 8 / C - 2 5

+

+ + + (P e r y p il a r ia )

M H O M / B R / 7 9 / C - 3 1

+

+ N . H . + ( P e r y p ila r i a )

N . H . = n o h e c h . i

N e tto E M , C uba CC, M a r sd e n P D , B arreto A C . E l m étodo d e cultivo "in vitro" com o instru m en to práctico en el diagnóstico y el a islam iento p r im á rio d e L e i s h m a n i a b r a z i l i e n s i s b r a z i l i e n s i s . I. O bservaciones de laboratório. R evista da S o cieda de Brasileira de M ed ic in a T ro pical 19: 79-84, A b r-Jun , 1986

A n á lis is E s ta d ís tic o

E l t e s t e x a c t o d e F i s c h e r ( m o d if ic a d o p o r T o c h e r ) fu é u t il iz a d o e n e l a n á lis is d e la s d if e r e n c ia s e n tr e la s p r o p o r c io n e s o b t e n id a s e n l o s t e s t s c o m p a ­ r a tiv o s , c o n u n n iv e l d e s ig n if ic a n c ia d e p < 0 , 0 5 .

R E S U L T A D O S

1 ) A i s l a m ie n t o p r im á r io

d e L e is h m a n ia

d e h a m s te r e s in fe c ta d o s ..

L a T a b la 2 p r e s e n ta r e s u lt a d o s q u e e v id e n c ia n s ig n if ic a tiv a p o s it iv id a d a fa v o r d e i m e d io D A B , c u a n d o c o m p a r a d o c o n e l d e S c h n e i d e r ( E 1 ). E n u n s e g u n d o e x p e r im e n to d e c o m p a r a c ió n d e i D A B c o n e l m e d io d e E v a n s , c o n f ir m a m o s la e f i c i e n c ia d e i D A B , s ie n d o q u e e l d i f á s i c o d e E v a n s t a m b ié n m o s tr ó s im ila r s e n s ib ilid a d , e n e l a is la m ie n to p r im á r io d

e L e is h m a n ia

b ra zilie n sis b r a z ilie n s is

( E 2 ) . U n ú n ic o a is la m ie n to fu é c o n s e g u id o c o n e l m e d io s e m id e f m id o A R - 1 0 3 q u e s e m o s tr ó p o c o a p r o p r ia d o p a r a e l c u lt iv o

in vitro

d e L .

b. b ra z ilie n s is

( E 3 ).

E n r e la c ió n a l a p r e c o c id a d d e c r e s c im ie n t o d e lo s p r o m a s ti g o t e s d e e s a s u b e s p e c i e d e

L e is h m a n ia ,

6 3 % d e l o s c u lt i v o s fu e r o n p o s i t i v o s a la s 4 8 h o r a s d e i n o c u la d o s . E s t e t i e m p o d e p o s i t i v a c i ó n fu é v e r ifi c a d o c o n s is t e n t e m e n t e e n la s p o s te r io r e s o b s e r v a c i o n e s e f e c tu a d a s e n lo s m e d io s d i f á s i c o s ( D A B y E v a n s ) . I g u a lm e n te , e n e l m e d io d e S c h n e id e r , 6 9 % d e lo s c u lt iv o s fu e r o n p o s i t i v o s a l a s 4 8 h o r a s d e in o c u la d o s . A l o s 4 d ia s , t o d o s l o s tu b o s d e c u lt iv o q u e fin a lm e n te r e s u lta r o n p o s i t i v o s y a p r e s e n ta b a n p r o m a s tig o t e s v is i b l e s a l m i c r o s c o p i o in v e r tid o .

U n a o tr a o b s e r v a c i ó n ( E 4 ) m o s tr ó q u e la a d ic ió n d e 5 - f l u o r o c y t o s in e ( 1 5 0 /x g /m l d e m e d io )

c o m o a n tifú n g i c o n o in h ib ió la d ife r e n c ia c ió n y m u lti-p l ic a c ió n

in vitro d e L . b. braziliensis

y

L . m exicana s p .,

a is la d a s d e 1 0 h a m s te r e s in fe c ta d o s .

F in a lm e n t e , e n o tr o e x p e r im e n to c u y o p r o c e ­ d im ie n t o fu é l a b i o p s ia y tr itu r a d o d e i m a te r ia l, r e a liz a d o p a r a le la m e n te a l E x p e r im e n to I II s e v e r ific o q u e e l m e d io A R - 1 0 3 fr a c a s ó to ta lm e n te , e n e l a is la m ie n t o d e

L b b

d e lo s 1 4 h a m s t e r e s in fe c ta d o s ( E 5 ) . S in e m b a r g o , l a m is m a o b s e r v a c ió n d e m o n s -tr a b a q u e e l m e d io D A B e s t a b l e c i ó 9 2 % d e a is la ­ m ie n to p r im á r io d e i p a r á s it o .

L o s r e s u lt a d o s o b te n id o s p o r la s u c c ió n d e i m a te r ia l d e la s l e s i o n e s c o n p ip e ta P a s t e u r ( E 6 ) d e m u e s tr a n q u e 8 4 % d e l o s c u lt iv o s e n 1 9 h a m s te r e s fu e r o n p o s it iv o s c u a n d o u t il iz a d o e l m e d io D A B , s ie n d o q u e s o la m e n t e 5 ,3 % d e lo s tu b o s d e S c h n e id e r fu e r o n p o s it iv o s e n l o s m is m o s a n im a le s .

2 ) C r e s c im ie n t o , e n m a s a , d e c e p a s s e l e c c i o n a d o s d e

L . b. b ra zilien sis.

C o m p r o b a m o s la n e c e s id a d d e i e m p le o d e d i­ v e r s o s l o t e s d e s u e r o b o v in o fe ta l ( G ib c o , F lo w , H y c l o n e ) e n s u c a p a c i d a d d e p e r m itir e l c r e c im ie n to

in

vitro

d e

L b b .

E l s u e r o b o v in o fe ta l d e i la b o r a to r io S t e r y le S y s t e m H y c l o n e ( U S A ) , d e m o s tr o lo s m e -j o r e s r e s u lt a d o s c u a n d o c o m p le m e n to , lo s m e d io s líq u id o s d e c u lt iv o d e te ji d o s a n im a le s T C - 1 9 9 y d e c é l u l a s d e i n s e c t o s d e S c h n e id e r . P r o m a s t ig o te s , e n d e n s id a d e s d e 1 0 8/ m l , fu e r o n c o n s is te n t e m e n te d e sa r -r o lla d o s e n a m b o s m e d io s . L a T a b la 3 m u e s t-r a q u e lo s p r o m a s ti g o t e s d e c e p a s h u m a n a s y c a n in a d e

L b b

c r e c ie r o n y m u ltip lic a r o n e n d e n s id a d e s d e 1 0 8 fla g e ­ la d o s p o r m l d e m e d io e n tr e l o s d ia s 5? y 8? d e c u ltiv o

in vitro,

c u a n d o in o c u la d o s l o s fr a s c o s d e m e d io d e S c h n e id e r c o n 1 0 6 p r o m a s ti g o t e s /m l. S im ila r e s r e s u l­ ta d o s ( n o p r e s e n ta d o s ) fu e r o n d o c u m e n ta d o s u tili­ z a n d o e l m e d io T C - 1 9 9 ( 1 5 % S .B .F .) .

T a b la 2

- R e s u lta d o s d e la c o m p a ra c ió n en tre m e d io s

y

p r o c e d im ie n to s d e c u ltivo en e l a is la m ie n to p r im á r io de

L e is h m a n ia

d e h a m ste re s e x p e r im e n ta lm e n te infectados.

M é d io s

y

E x p e r im e n to s

P ro c e d im ie n to s

R e s u lta d o s *

T o ta l (N )

P o s itiv id a d

(+ + )(+

- ) ( - - + ) ( -

~)

%

( v a lo r p )* *

E x p e r im e n to s **

E l ) D A B x S c h n e id e r ’s A s p ir a c ió n 1 3 4 0 2 1 9 8 9 ,5 x 6 8 , 4 ( p < 0 , 0 5 ) E 2 ) D A B x E v a n s c o n 1 9 0 2 1 2 2 8 6 , 4 x 9 5 ,5 ( p > 0 , 0 5 ) E 3 ) D A B x A R - 1 0 3 A g u ja y 1 1 0 0 3 1 4 7 7 , 6 x 7 ,1

E 4 ) D A B x D A B J e r in g a 1 0 0 0 0 IO *** 1 0 0 , 0 X 1 0 0 ,0 E 5 ) D A B x A R - 1 0 3 T r itu r a d o

B io p s ia 0 13 0 1 1 4 9 2 , 0 x 0 , 0

E 6 ) D A B x S c h n e id e r ’s A s p i r a c i ó n c o n

P ip e t a P a s t e u r 1 15 0 3 1 9 8 9 , 0 x 5 ,3

* L o s s í m b o l o s e n t r e p a r é n t e s i s i n d i c a n = ( + + ) , p o s i t i v i d a d p o r a m b o s m e d i o s ; ( + — ) , p o s i t i v i d a d p o r e l p r i m e r m e d i o , D A B ; ( — b ) , p o s i t i v i d a d p o r e l s e g u n d o m e d i o c o m p a r a d o ; ( — ) , n e g a t i v i d a d p o r a m b o s m e d i o s c o m p a r a d o s .

* * D i f e r e n c i a e s t a d i s t i c a s i g n i f i c a t i v a p < 0 , 0 5 . T e s t e x a c t o d e F i s c h e r ( M o d i f i c a d o p o r T o c h e r ) .

N e tto E M , C uba CC, M a rsd e n P D , B arreto A C . E l m étodo de cu ltivo "in vitro ” com o instrum en to p rá ctic o en el diagnóstico y e l aislam ie nto p r im á rio de L e i s h m a n i a b r a z i l i e n s i s b r a z i l i e n s i s . I. O bservaciones de laboratório. R e v ista da S o c ie d a d e B ra sileira de M ed ic in a Tropical 19: 79-84, A br-Jun, 1 98 6

T a b le 3

- N ú m e r o d e p r o m a s tig o te s d e

L e is h m a n ia b r a z il ie n s is b r a z il ie n s is

c u ltiv a d o s en e l m e d io d e S c h n e id e r

(2 0 % d e su ero b o vin o f e t a l )

-

2 3 °C .

N ú m e r o A p r o x im a d o d e F la g e la d o s /1 0 0

ju.1 d e M e d io

C ódigo d e la C epa

In ó c u lo

5to d ia

6 to d ia

8 to d ia

M H O M / B R / 7 6 / L T B - O O 1 4 ( L ) M H C > M / B R / 7 7 / L T B - 0 0 1 4 ( R ) M H O M / B R / 7 7 / L T B - 0 0 4 2 M H O M / B R / 7 8 / L T B - 0 0 4 8 M H O M / B R / 7 8 / C - 2 5

2, 17 x 1 o 6

2 .7 x 1 0 6 5 ,1 x 1 0 6 3 ,1 5 x 1 0 6 2 .7 x 1 0 6

1 ,5 2 x 1 0 » 0 , 1 2 x 1 0 8 1 ,7 7 x 1 0 8 2 , 5 7 x 1 0 8 0 ,2 1 x 1 0 8

1 ,5 1 x 1 0 8 0 , 4 x 1 0 8 1 ,8 9 x 1 0 8 1 ,2 9 x 1 0 8 0 , 2 3 x 1 0 8

2 , 1 8 x 1 0 8 N . H . N . H .

2 , 3 3 x IO 8

N . H . = n o h e c h o — = c o n t a m i n a d o

D I S C U S I O N

E n e l tr a n s c u r s o d e l o s ú l ti m o s 3 a n o s h a s id o n u e s tr o p r in c ip a l in te r é s e n la i n v e s t ig a c ió n d e le is h -m a n ia s is , e l c u lt i v o

in vitro

d e

L b b

c o m o t é c n i c a a p lic a d a a l d ia g n ó s t ic o p r e c o z y , c o n s e c u e n t e m e n t e , a l r á p id o a is la m ie n to p r im á r io d e i p a r á s ito d e p a c ie n ­ t e s e n la s á r e a s e n d ê m ic a s d e B a h ia , B r a s i l 8 . E l é x it o e n e l c u ltiv o e n m a s a d e l o s p r o m a s ti g o t e s d e é s t a s u b e s p e c ie d e

L e is h m a n ia ,

p o r o tr o la d o , b e n e f ic io d ir e c ta m e n te lo s e s tú d io s d e id e n tific a c ió n ta x o n ó m ic a . U n p a s o p r e lim in a r a l a m p lio e m p le o d e l o s m e d io s a r tific ia le s d e c u lt iv o , e n e s tú d io s d e c a m p o , h a s id o e v a lu a r la a p lic a c ió n d e lo s m e d io s d i f á s i c o s y líq u id o s , a p a r e n te m e n te p r o m is o r io s , p u b lic a d o s e n la lite ra tu r a 4 12 14 e n te n ta ti v a s d e a is la m ie n to d e c e p a s , b ie n c a r a c t e r iz a d a s d e

L b b

y

L . m e x ic a n a ,

m a n t e n i-d a s e n n u e s tr o la b o r a to r io . E s t e p r o c e i-d im ie n to la b o ­ r a to ria l y a fu é e m p le a d o p o r W e m e r 23 , y C h a v e z

e t

a l i i 5

y c o n s t it u y e a y u d a v a li o s a s o b r e t o d o e n e l e s t ú d io s d e la s in f e c c io n e s c a u s a d a s p o r

L b b .

A n a l i z a n d o l a m e t o d o lo g ia d e s c r it a e n o tr a s in v e s t ig a c io n e s c o m p r o b a m o s q u e , e l p r o c e d im e n to d e c o l e c t a d e i m a te r ia l in fe c ta d o c o n s i s t ió e n l a a s p ir a -c i ó n d e l o s a m a s t ig o te s , e m p le a n d o u n a a g u ja 2 7 g 13 o , p o r la u t iliz a c ió n d e u n a je r in g a d e tu b e r c u lin a m u n id a a u n a a g u ja d e n.° 2 3 g 5 . N u e s t r o p r o c e d im ie n to u t iliz a n d o u n a je r in g a d e 5 m l y a g u ja n? 2 2 g , d e m o s tr o b u e n a e f i c i e n c ia ta n t o e n la fu e r z a d e s u c c ió n c o m o e n l a o b te n c ió n d e r a z o n a b le v o lu m e n d e te jid o s r e tir a d o s d e la s l e s io n e s . A é s t e ú lti m o d e ta ll e s e a d ic io n a la b u e n a s e n s ib ilid a d v e r if ic a d a c o n e l m e d io a g a r s a n g r e D i f c o , ta l c o m o lo r e c o m e n d a d o p o r W a l t o n

et

a l i i

22 y S h a w & L a i n s o n 2 0 .

A v a n c e s r e la tiv a m e n te r e c ie n te s h a n s id o e f e c -tu a d o s e n e l c u lt iv o d e lo s p r o m a s ti g o t e s d e

L e is h ­

m a n ia ,

p o r e l u s o d e m e d io s d e c u lt iv o d e c é l u l a s d e m a m ífe r o s e i n s e c t o s , c o m p le m e n t a d o s c o m s u e r o b o v in o f e t a l 17. A l g u n o s in v e s ti g a d o r e s a fir m a n q u e

l o s m e d io s líq u id o s s o n s u p e r io r e s a lo s d ifá s i c o s ( b á s ic a m e n t e d e a g a r s a n g r e ) e n e l a is la m ie n t o p r i­ m á r i o d e

L e is h m a n ia ,

ta n t o d e p a c i e n t e s c o m o d e a n im a le s e x p e r im e n t a le s 1 3 14. A p e s a r d e i m e d io d e E v a n s h a b e r d e m o s tr a d o e f i c i e n c ia s im ila r a l D A B , e l e m p le o d e l o t e s d ife r e n te s d e s a n g r e d e c a b a llo p a r e c ió in f lu e n c ia r e n e l r e n d im ie n t o d e i p r im e r o . P o r e s a r a z ó n r e s u ltó m á s p r á c ti c o e l e m p le o d e i D A B q u e u t il iz a s a n g r e d e c o n e j o d e s f ib r in a d a d e m á s fá c il o b t e n c i ó n e n n u e s t r o m e d io . E s t o c o n f ir m a lo s r e s u l­ ta d o s o b te n id o s p o r lo s in v e s ti g a d o r e s d e P a r á , B r a s i l 20, B o l i v i a 21 y P e r ú 15, c o n c e p a s d e

L . b r a z i­

liensis.

U n a r a p id a c o n v e r s ió n

in vitro

p a r a p r o m a s ­ t ig o t e s fu é o b s e r v a d a e n u n p e r í o d o ta n c o r t o c o m o 4 8 h o r a s d e i n o c u la d o e l m e d io D A B . E s t e d e s e m p e n o fu é m e jo r q u e e l o b te n id o p o r C h a v e z

e t a l i i

5 y a l e m p le a r e l m e d io S e n e k jie . A s í , m is m o , e n e l m e d io D A B ,

L b b

v iv e ta n t o c o m o 4 5 d ia s y , r u tin a r ia m e n te , e s p o s i b l e s u b c u lt iv a r e l p a r á s it o c a d a 2 5 d ia s . E s t o ú lti m o c o n t r a s ta c o n e l c o m p o r t a m ie n to d e i p a r á s it o e n e l m e d io d e S c h n e id e r e n e l c u a l a l p i c o d e c r e c im ie n to e s a lc a n z a d o r á p id a m e n te e n la p r im e ir a s e m a n a d e c u lt iv o “ in v it r o ” , d e s p u é s d e i c u a l lo s p a r á s ito s m u e r e n e n tr e e l 1 2 ? y 1 5 ? d ia .

P o r o tr o l a d o m e d io s q u e s o n e f i c i e n t e s e n e l a is la m ie n to d e

L e is h m a n ia

p u e d e m n o s e r ig u a lm e n t e a p r o p r ia d o s p a r a e l c u lt iv o e n g r a n e s c a l a d e lo s o r g a n is m o s y v i c e - v e r s a 10. L a s c e p a s p a d r ó n d e

L b b

N etto E M , C u ba CC, M a rsd e n P D , B arreto A C . E l m étodo de cu ltivo “in vitro" com o in stru m en to p rà ctic o en el diagnóstico y el aislam iento p r im á r io de L e i s h m a n i a b r a z i l i e n s i s b r a z i l i e n s i s . I. O bservaciones d e laboratório. R e v ista da So c ieda de Brasileira de M edicina Tro pical 19: 79-84, A br-Jun, 1986

S U M M A R Y

W e h a ve c o m p a re d d iffe r e n i m e d ia a n d

iso-lation p ro c e d u re s to c u ltiv a te

L e is h m a n ia b r a z il ie n s is b r a z ili e n s is /r o m

h a m s te r tissues. W e f m d th a t

aspira-tion o f the lesio n u sin g a 2 2 g n eed le a n d a f t v e m l

syrin g e g iv e s s a tis fa c to r v results, a n d is a c o n ven ien t

sam pling m ethod. D ifc o B lo o d a g a r is an efficien t

m edium f o r iso la tio n . E v a n s m e d iu m g a v e e q u a l

results w hile S c h n e id e r s a n d A R - 1 0 3 m e d iu m were

inferior. In S c h n e id e r ’s m e d iu m fla g e lla te g row th

achieved 0 .2 1

-

2 .5 7 x 10& p r o m a s tig o te s /m l b v the

fifth day. 5 -flu o ro c y to sin e a d d e d to th e c u ltu res to

avoid f u n g a i c o n ta m in a tio n d o es n o t in h ib it th e

grow th

o / L . b . b r a s ilie n s is .

K ey words:

L e is h m a n ia b r a z ilie n s is b r a z ilie n s is .

C ulture in vitro.

R E F E R Ê N C I A S B I B L I O G R Á F I C A S

1. A z e v e d o J P , R o i t m a n , I . C u l t i v a t i o n o f T r y p a n o so m a c r u zi in d e f i n e d m e d i a . I n : G e n e s a n d A n t i g e n s o f p a r a s i t e s . A l a b o r a t o r y m a n u a l . M o r e i C . ( e d . ) 2 n d E d i t i o n U N D P / W o r l d B a n k / W H O S p e c i a l P r o g r a m m e f o r R e s e a r c h a n d T r a i n i n g in T r o p i c a l D i s e a s e . R i o d e J a n e i r o , p p . 2 9 - 3 3 , 1 9 8 4 .

2 . B a r k e r D C . B u t c h e r . J . T h e u s e o f D N A p r o b e s in t h e i d e n t i f i c a t i o n o f l e i s h m a n i a s i s d i s c r i m i n a t i o n b e t w e e n i s o l a t e s o f th e L e is h m a n ia m e x ic a n a a n d L . b ra zilie n sis

c o m p l e x e s . T r a n s a c t i o n s o f t h e R o y a l S o c i e t y o f T r o ­ p i c a l M e d i c i n e a n d H y g i e n e 7 7 : 2 8 5 - 2 9 7 . 1 9 8 3 . 3 . B a r k e r D C . B u t c h e r J , G i b s o n L J , K e n n e d y W P K ,

W i l l i a m s R H , C u b a C u b a C A , M a r s d e n P D , L a i n s o n R , S h a w J J . S e q u e n c e h o m o l o g y o f k i n e t o p l a s t D N A in

L e is h m a n ia s t u d i e d b y f i l t e r h y b r i d i s a t i o n o f e n d o - n u c l e a s e d i g e s t e d f r a g m e n t s a n d " i n s i t u ” h y b r i d i s a t i o n o f i n d iv id u a l o r g a n i s m s A n n a l e s d e P a r a s i t o l o g i e . in p r e s s 4 . C h a n g K P , F i s h W R L e is h m a n ia . I n : In vitro c u l t i v a t i o n

o f p r o t o z o a p a t h o g e n i c t o m a n a n d d o m e s t i c a n i m a i s . J e n s e n J . B . ( e d . ) C R E , P r e s s , F l o r i d a , p p . 2 - 9 1 , 1 9 8 1 . 5 . C h a v e s F . S i l v a S , Z e l e d o n R . C o m p a r i s o n o f t w o

c u l t u r e m e d i a f o r t h e i s o l a t i o n o f L e is h m a n ia s t r a i n s . T h e J o u r n a l o f P a r a s i t o l o g y 6 8 : 3 4 6 - 3 4 7 , 1 9 8 2 . 6 . C u b a C u b a C A , V e x e n a t A J , L l a n o s - C u e n t a s E A ,

M a r s d e n P D , B a r r e t o A C , R o s a A C . E x p e r i m e n t a l i n f e c t i o n s o f w i l d c a u g h t s p e c i m e n s o f L u t z o m y ia (N ) w h itm a n i ( D i p t e r a , P s y c h o d i d a e ) a n d t h e i r u s e f o r

L e is h m a n ia i d e n t i f i c a t i o n . I n : R e s u m o s d a I X R e u n i ã o A n u a l P e s q u i s a B á s i c a e m D o e n ç a d e C h a g a s . C a - x a m b ú . M G , B r a s i l , 1 9 8 2 .

7 . C u b a C u b a , C A . L e i s h m a n i o s e T e g u m e n t a r e m á r e a e n d ê m i c a d o E s t a d o d a B a h i a , B r a s i l . C a r a c t e r i z a ç ã o e c l a s s i f i c a ç ã o d e L e is h m a n ia d o h o m e m e d o c ã o d o m é s ­ t i c o e a s p e c t o s c o m p o r t a m e n t a i s d e L . b ra zilie n sis b ra zilie n sis. T e s e d e D o u t o r a d o . U n i v e r s i d a d e F e d e r a l d e M i n a s G e r a i s . B r a s i l . 1 5 2 p p . . 1 9 8 3 .

8 . C u b a C u b a C A , N e t t o E M , C o s t a J M L , R o s a A C , B a r r e t o A C , M a r s d e n P D . C u t a n e o u s l e i s h m a n i a s i s

c a u s e d b y L e is h m a n ia b ra zilie n sis b ra zilie n sis. I m p r o v - in g d i a g n o s i s b y p r i m a r y i s o l a t i o n in c u l t u r e . R e s u m o N ? 1 - 7 0 . X I R e u n i ã o A n u a l P e s q u i s a B á s i c a e m D o e n ç a d e C h a g a s , C a x a m b ú , M G . B r a s i l , 1 9 8 4 .

9 . C u b a C u b a C A , L l a n o s - C u e n t a s E A , B a r r e t o A C , M a g a l h ã e s A V , L a g o E L , R e e d S G , M a r s d e n P D . H u m a n m u c o c u t a n e o u s l e i s h m a n i a s i s in T r ê s B r a ç o s , B a h i a , B r a z i l . A n a r e a o f L e is h m a n ia b ra zilie n sis bra­ zilie n sis t r a n s m i s s i o n . I . L a b o r a t o r y D i a g n o s is . R e v i s t a d a

S o c i e d a d e B r a s i l e i r a d e M e d i c i n a T r o p i c a l 1 7 : 1 6 1 - 1 6 7 , 1 9 8 4 .

1 0 . E v a n s , D . T h e i s o l a t i o n a n d c u l t i v a t i o n o f L e is h m a n ia in vitro. I n B a r k e r J . . T a y l o r , A . ( e d . ) . 2 n d e d i t i o n . A c a d e - m ic P r e s s . p p . 8 2 - 8 3 . 1 9 7 9 .

1 1 . E v a n s D A , L a n h a m S M , B a l d w i n C , P e t e r s W . T h e i s o l a t i o n a n d i s o e n z y m e c h a r a c t e r i z a t i o n o f L e is h m a n ia b ra z ilie n sis s u b s p . f r o m p a t i e n t s w i t h c u t a n e o u s l e i s h ­ m a n i a s i s a c q u i r e d in B e li z e . T r a n s a c t i o n s o f t h e R o y a l S o c i e t y o f T r o p i c a l M e d i c i n e a n d H y g i e n e 7 8 : 3 5 - 4 2 , 1 9 8 4 .

1 2 . H e n d r i c k s L D , W o o d D E , H a d j u k M E . H a e m o f i a g e l - l a t e s : c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e l i q u i d m e d i a f o r r a p i d c u l t i v a t i o n . P a r a s i t o l o g y 7 6 : 3 0 9 - 3 1 6 . 1 9 7 8 .

1 3 . H e n d r i c k s L D , W r i g h t N . D i a g n o s i s o f c u t a n e o u s l e i s h ­ m a n i a s i s b y in vitro c u l t i v a t i o n o f s a l i n e a s p i r a t e s in S c h n e i d e r 's D r o s o p h ila m e d i u m . A m e r i c a n J o u r n a l o f T r o p i c a l M e d i c i n e a n d H y g i e n e 2 8 : 9 6 2 - 9 6 4 , 1 9 7 9 . 1 4 . H e n d r i c k s L D , C h i l d s G E . P r e s e n t k n o w l e d g e o f t h e in

vitro c u l t i v a t i o n o f L e is h m a n ia . I n : I n vitro c u l t i v a t i o n o f m a j o r p a t h o g e n s o f t r o p i c a l d i s e a s e . T r o p i c a l D i s e a s e R e s e a r c h S e r i e s 3 : 2 5 1 - 2 7 1 . B a s e l . S c h w a b e & C o ,

1 9 8 0 . '

1 5 . L l a n o s - C u e n t a s A , A r a n a M , M o n t o y a Y , C a m p o s M , R o m e r o G . A i s l a m i e n t o p r i m á r i o d e L e is h m a n ia s p . d e p a c i e n t e s e n a r e a e n d ê m i c a s d e l P e r ú . R e s u m o B I - 6 7 . X I R e u n i à o A n u a l P e s q u i s a B á s i c a e m D o e n ç a d e C h a g a s , C a x a m b ú , M G , B r a s i l , 1 9 8 4 .

1 6 . M a y r i n k W , R a s o P , M e l o M N , M i c h a l i c k M S M , M a g a l h ã e s P A . W i l l i a m s P . C o s t a C A . D i a s M . A m e r i c a n c u t a n e o u s l e i s h m a n i a s i s . D i s a p p e a r a n c e o f a m a s t i g o t e s f r o m l e s i o n s d u r i n g a n t i m o n i a l t h e r a p y . R e v i s t a d o I n s t i t u t o d e M e d i c i n a T r o p i c a l d e S ã o P a u l o 2 5 : 2 6 5 - 2 6 9 , 1 9 8 3 .

1 7 . M i l e s M A . L e is h m a n ia c u l t u r e a n d b io c h e m i c a l c o m - p a r i s o n s . S o m e d i f f i c u l t i e s . I n : B i o c h e m i c a l C h a r a c ­ t e r i z a t i o n o f L e is h m a n ia . P r o c e e d i n g s W o r k s h o p P A H O , W a s h i n g t o n D . C . C h a n c e M . & W a l t o n B . C . ( e d . ) U N D P / W o r l d / B a n k / W H O , p p . 1 2 4 - 1 3 7 , 1 9 8 2 . 1 8 . P a l o m i n o J C , G u e r r a H , L u m b r e r a s H . A s e l e c t iv e

l i q u i d m e d i u m f o r p r i m a r y i s o l a t i o n o f S o u t h A m e r i c a n L e i s h m a n i a s i s . T r o p e n m e d i z i n u n d P a r a s i t o l o g i e 3 4 : 2 2 9 - 2 3 2 , 1 9 8 3 .

1 9 . P e t e r s W , E v a n s D A L a n h a m S M . I m p o r t a n c e o f p a r a s i t e i d e n t i f i c a t i o n i n c a s e s o f l e i s h m a n i a s i s . J o u r n a l o f t h e R o y a l S o c i e t y o f M e d i c i n e 7 6 : 5 4 0 - 5 4 2 . 1 9 8 3 . 2 0 . S h a w J J , L a i n s o n R . T h e in vitro c u l t i v a t i o n o f m e m b e r s

N e tto E M , C uba CC, M a rsd e n P D , B arreto A C . E l m étodo de cultivo "in vitro ” com o instrum en to p rá c tic o en el d iagnóstico y e l aisla m ie n to p r im á rio de L e i s h m a n i a b r a z i l i e n s i s b r a z i l i e n s i s . I. O bservaciones de laboratório. R e v ista da S o c ie d a d e B ra sileira de M ed ic in a Tropical 19: 79-84, A br-Jun, 198 6

2 1 . U i j e l R , R e c a c o e c h e a M , L a F u e n t e C , O r e l l a n a H . A s im p le m e t h o d f o r t h e c o l l e c t i o n o f m a t e r i a l f r o m c u t a - n e o u s a n d m u c o c u t a n e o u s l e i s h m a n i a s i s le s io n s . T r a n s a c - ti o n s o f t h e R o y a l S o c i e t y o f T r o p i c a l M e d i c i n e a n d H y g i e n e 7 7 : 8 8 2 - 8 8 3 , 1 9 8 3 .

2 2 . W a l t o n B C , S h a w J J , L a i n s o n R . O b s e r v a t i o n s o n t h e

in

vitro

c u l t i v a t i o n o f

Leishm ania braziliensis.

J o u r n a l o f P a r a s i t o l o g y 6 3 : 1 1 1 8 - 1 1 1 9 , 1 9 7 7 .

2 3 . W e m e r J K . C o l o m b i a n s t r a i n s

oiLeishm ania

f r o m m a n : g r o w t h c h a r a c t e r i s t i c s in c u l t u r e m e d i a a n d h a m s t e r s . T r a n s a c t i o n s o f t h e R o y a l S o c i e t y o f T r o p i c a l M e d i c i n e a n d H y g i e n e 7 5 : 6 1 9 - 6 2 2 , 1 9 8 1 .

2 4 . W o r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n - I n t e r n a t i o n a l r e f e r e n c e s t r a i n s o f

Leishm ania.

B u l l e t i n o f t h e W o r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n 6 3 : 4 3 - 4 6 , 1 9 8 5 .