Rev. Soc. Bras. Med. Trop. vol.29 número1

Revista da Sociedade Brasileira de M edicina Tropical

29(1):59-61, jan-fev, 1996.

AVALIAÇAO DO SISTEMA

QUANTITATIVE BUFFYCOAT

(QBC) NO DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA INFECÇÃO

PELO

TRYPANOSOMA CRUZI

: ESTUDO EM MODELO

EXPERIMENTAL MURINO

Vicente Amato Neto, Luís Matsubara e Peria Natalia Bustos Lanura

P a r a e s c l a r e c e r o d i a g n ó s t i c o d a d o e n ç a d e C h a g a s é i m p r e s c i n d í v e l a

c o n firm a ç ã o

e t i o l ó g i c a , d e p e n d e n t e d a u t i l i z a ç ã o d e d i v e r s o s t i p o s d e p r o c e d i m e n t o s , q u e d e m o n s t r a m o

T r y p a n o s o m a c r i i z i

o u p a r t i c i p a m r e v e l a n d o a n a t u r e z a d o p r o c e s s o a t r a v é s d e a n t i c o r p o s , p o r e x e m p l o 14.

A f a s e a g u d a p o d e a p r e s e n t a r - s e a t r a v é s d e m a n i f e s t a ç õ e s c l í n i c a s s u g e s t i v a s , m a s é d e f i n i d a s e g u n d o c r i t é r i o l a b o r a t o r i a l , o u s e j a , a e v i d e n c i a ç à o d o

T. c r u z i

n o s a n g u e p e r i f é r i c o p o r m e i o d e m é t o d o s r o t u l a d o s c o m o d i r e t o s e r e p r e s e n t a d o s p o r e x a m e s a f r e s c o o u a p ó s c o l o r a ç ã o , c o m c o n c e n t r a ç ã o o u n ã o . C o n t u d o , t o r n a - s e n e c e s s á r i o l e m b r a r q u e a i n d a s ã o d e s e j á v e i s a p r i m o r a m e n t o s , s o b r e t u d o q u a n d o v i g e n t e s p e q u e n a s p a r a s i t e m i a s . A i n d a m a i s , a t é e m e s t u d o s e x p e r i m e n t a i s , b a s e a d o s n o e m p r e g o d e m o d e l o s q u e s e u t i l i z a m d e a n i m a i s , v a l e a p e n a a l m e j a r p r o g r e s s o s , p a r a m e l h o r a r a v a l i a ç õ e s p a t o g e n é t i c a s e t e r a p ê u t i c a s e n t r e o u t r a s .

Q u a n d o t o m a m o s c o n h e c i m e n t o d o v a l o r d o s i s t e m a

Q uantitative B uffy Coat

( Q B C ) n o d i a g n ó s t i c o e s p e c í f i c o d a m a l á r i a , e m v i r t u d e d a e f i c i ê n c i a p a r a m o s t r a r h e m a t o z o á r i o s n o s a n g u e , j u l g a m o s a c o n s e l h á v e l t e n t a r v e r i f i c a r a a p l i c a b i l i d a d e d e s s a t é c n i c a e m r e l a ç ã o a o

T.

c r u z i

e , d e i n í c i o , r e a l i z a m o s o b s e r v a ç õ e s r e c o r r e n d o a c a m u n d o n g o s i n t e n c i o n a l m e n t e i n f e c t a d o s . A g o r a , e n t ã o , r e l a t a m o s o s r e s u l t a d o s o b t i d o s .

Material e Métodos.

C i n c o c a m u n d o n g o s f ê m e a s , d a l i n h a g e m B a l b - C , p e s a n d o e n t r e 18

L a b o r a t ó r i o d e I n v e s t i g a ç ã o M é d i c a - P a r a s i t o l o g i a d o H o s p i t a l d a s C l i n i c a s d a F a c u l d a d e d e M e d i c i n a d a

U n i v e r s i d a d e d e S ã o P a u l o , S ã o P a u l o , SP, B r a s i l.

E ndereço p a r a co rresp o n d ên cia : P r o f . V i c e n t e A m a t o N e t o .

L a b o r a t ó r i o d e I n v e s t i g a ç ã o M é d i c a - P a r a s i t o l o g i a .

A v . D r . E n é a s d e C a r v a l h o A g u i a r 5 0 0 , 0 5 4 0 3 - 0 0 0 S ã o P a u l o , S P

R e c e b i d o p a r a p u b l i c a ç ã o e m 2 0 / 0 2 / 9 5 .

e l ü g c a d a u m , f o r m a i n o c u l a d o s p e l a v i a

intraperitoneal com 10' formas trípomastigotas

d a c e p a Y d o

T. cruzi,

m a n t i d a h á m u i t o s a n o s n o L a b o r a t ó r i o . D e c o r r i d o s s e t e d i a s , e f e t u a m o s p u n ç à o c a r d í a c a t o t a l , u s a m o s c i t r a t o d e s ó d i o a 3 . 5 % c o m o a n t i c o a g u l a n t e e a g r u p a m o s e m u m ú n i c o '‘p o o l ” , n o q u a l c o n t a m o s o s f l a g e l a d o s e m p r e g a n d o a c â m a r a d e N e u b a u e r . P u s e m o s o s a n g u e a s s i m c o l e t a d o e m d e z t u b o s c a p i l a r e s c o n t e n d o l a r a n j a d e a c r i d i n a , a t i n g i n d o o v o l u m e m é d i o d e

60

m i c r o l i t r o s ; h o m o g e n e i z a m o s , c o l o c a m o s r o l h a d e s i l i c o n e e m u m a d a s e x t r e m i d a d e s e b a s t o n e t e d e p l á s t i c o , d e n o m i n a d o f l u t u a d o r , n a o u t r a ; c e n t r i f u g a m o s a 1 2 . 0 0 0 r p m d u r a n t e c i n c o m i n u t o s , p a r a s u b s e q ü ê n t e m e n t e o b s e r v a r s o b l u z u l t r a - v i o l e t a , e m m i c r o s c ó p i o d e f l u o r e s c ê n c i a , c o m o b j e t i v a d e 6 0 X e g r a n d e p r o f u n d i d a d e d e c a m p o ; c o n t a m o s e e x p r e s s a m o s o s r e s u l t a d o s s e g u n d o o n ú m e r o m é d i o c o n c e r n e n t e a d e z c a p i l a r e s .

P a r a a n a l i s a r a s e n s i b i l i d a d e d a t é c n i c a , j u n t a m o s s a n g u e d o “p o o l ” a o d e c a m u n d o n g o s n ã o i n f e c t a d o s , a f i m d e c o n s e g u i r c o n c e n t r a ç õ e s d e 1 / 2 0 a 1 / 1 0 2 4 0 . D e c a d a u m a d e l a s p u s e m o s a m o s t r a e m u m t u b o c a p i l a r e c o n t a m o s .

Comentários.

.N os c a p i l a r e s , n o t a m o s n í t i d a s e p a r a ç ã o e m d i f e r e n t e s c a m a d a s : p l a s m a , p l a q u e t a s , m o n o n u c l e a d o s , g r a n u l ó c i t o s e h e m á c i a s . A p a r e c e c o l o r a ç ã o e s v e r d e a d a , f l u o r e s c e n t e , n o s n ú c l e o s , f a c i l i t a n d o a i n d e n t i f i c a ç ã o . Q u a n t o à s f o r m a s t r í p o m a s t i g o t a s , e l a s s ã o v i s t a s a p r e s e n t a n d o g r a n d e m o t i l i d a d e e i n t e n s a f l u o r e s c ê n c i a e m c i n e t o p l a s t o s e n ú c l e o s , q u e é m a i s d i s c r e t a n o s c i t o p l a s m a s .

A d i s t r i b u i ç ã o d o s p a r a s i t a s n o s t u b o s p o d e s e r e x p r e s s a c o m o e s t á a s e g u i r e s p e c i f i c a d a : 7 5 , 9 % n o p l a s m a , e m r e g i ã o p r ó x i m a à s p l a q u e t a s ; 1 5 % n a p o r ç ã o m a i s i n t e r n a c o r r e s p o n d e n t e à s p l a q u e t a s ; 9 % n a c a m a d a d e m o n o n u c l e a d o s e g r a n u l ó c i t o s ( T a b e l a 1).

Comunicação. A m ato Neto V, M atsubara L, Lanura PNB. Aiialiação do sistema quantitative buffy coat (QBC)

no diagnóstico laboratorial d a infeccão pelo Trypanosoma cruzi: estudo em modelo experim ental m urino.

Revista da Sociedade Brasileira de M edicina Tropical 29:59-61, jan-fev, 1996.

Tabela 1 - N ú m e r o s d e trip o m a stig o ta s, ã a n á lis e p e lo sis te m a Q BC;

c o n fo r m e d ife r e n te s c a m a d a s d o s a n g u e .

P l a s m a P l a q u e t a s M o n o n u c l e a d o s e

g r a n u l ó c i t o s

8 4 6 1 0 1 8 4

7 0 8 1 1 7 8 9

5 8 9 1 7 2 7 4

7 5 3 2 0 2 6 5

8 3 4 1 5 8 9 9

5 6 7 1 1 4 8 6

7 8 6 1 4 7 8 7

8 1 0 1 1 4 1 0 3

661 1 4 5 9 2

8 2 3 1 9 3 9 6

M é d ia s 7 3 7 , 7 1 4 6 ,3 8 7 ,5

P o r c e n t a g e n s 7 5 , 9 15 9

P a s s a d a s 2 4 h o r a s , n o t a m o s r e d u ç ã o , d a o r d e m d e 9 0 % , d e f l a g e l a d o s v i v o s , e s t a n d o o s i m ó v e i s n a p a r t e s u p e r i o r d o c o n t i n g e n t e d e p l a q u e t a s , t e n d o m o r f o l o g i a p r e s e r v a d a , c i n e t o p l a s t o s e n ú c l e o s v i s í v e i s c o m f l u o r e s c ê n c i a e c i t o p l a s m a s a v e r m e l h a d o s , n ã o f l u o r e s c e n t e s .

A r e s p e i t o d a s d i l u i ç õ e s , a p a r t i r d e s a n g u e c o m 2 0 0 t r i p o m a s t i g o t a s e m l m m 1, e n c o n t r a m o s f o r m a s n a t o t a l i d a d e e , a t é n a q u e l a d e 1 / 1 0 2 4 0 , e x i s t i a u m a ú n i c a ( T a b e l a

2

) .

T abela 2 - N ú m e r o s d e trip o m a stig o ta s.. à a n á lis e p e lo sis te m a QBC.

c o n fo r m e d ife r e n te s d ilu iç õ e s d o sa n g u e .

D i l u i ç õ e s N ú m e r o s

1 /2 0 2 0 0

1 /4 0 1 8 0

1 /8 0 1 5 3

1 / 1 6 0 1 0 2

1 /3 2 0 8 7

1 /6 4 0 5 4

1 /1 2 8 0 1 8

1 / 2 5 6 0 3 2

1 / 5 1 2 0 7

1 / 1 0 2 4 0 1

O s i s t e m a Q B C é p r o c e d i m e n t o q u e p r o m o v e c o n c e n t r a ç ã o b a s e a d a n o g r a d i e n t e d e d e n s i d a d e d e d i f e r e n t e s c o m p o n e n t e s d o s a n g u e . O s c o n s t i t u i n t e s d o “ c r e m e ” l e u c o c i t á r i o , r e p r e s e n t a d o s p o r p l a q u e t a s , m o n o n u c l e a d o s e g r a n u l ó c i t o s , p a s s a m a o c u p a r p o s i ç ã o p r ó x i m a à p a r e d e d o c a p i l a r , f i c a n d o m a i s d i s p e r s o s , d e m o l d e a f a c i l i t a r a o b s e r v a ç ã o . A i d e n t i f i c a ç ã o d e e l e m e n t o s n u c l e a d o s , q u e r s e j a m p a r a s i t a s o u n ã o , t o r n a - s e b a s t a n t e s i m p l i f i c a d a c o m o d e c o r r ê n c i a d a a f i n i d a d e q u e o c o r a n t e t e m c o m o s á c i d o s n u c l é i c o s , a d v i n d o d i s s o c o l o r a ç ã o e s v e r d e a d a f l u o r e s c e n t e m e d i a n t e e x a m e c o m o a u x í l i o d a l u z u l t r a v i o l e t a .

E s s a t é c n i c a t e m s e m o s t r a d o v a l i o s a n o d i a g n ó s t i c o d a m a l á r i a , m o r m e n t e q u a n d o a p a r a s i t e m i a s a n g u í n e a é p e q u e n a . E s s a c i r c u n s t â n c i a é b e n é f i c a , s e m d ú v i d a , s e b e m q u e a e l a c o n t r a p õ e m - s e a l g u n s f a t o s q u e d e v e m s e r l e v a d o s e m c o n t a - , d i f i c u l d a d e p a r a s e p a r a r

Plasm odium falciparum

d e

P. vivax,

c u s t o m a i s e l e v a d o d o q u e o d e p r o c e s s o s h a b i t u a i s ; p o u c a d i s p o n i b i l i d a d e e m c e r t o s l u g a r e s d e p a í s e s s u b d e s e n v o l v i d o s . D e q u a l q u e r m a n e i r a , p o s s u i m a i o r s e n s i b i l i d a d e d o q u e o u t r a s t é c n i c a s , c o m o a t r a d i c i o n a l g o t a e s p e s s a .

N o q u e c o n c e r n e à s t r i p a n o s s o m o s e s , v a l e r e g i s t r a r q u e o s i s t e m a Q B C p r o p i c i o u p o s i t i v i d a d e n o s s a n g u e s d e r a t o s i n f e c t a d o s p e l o

Trypanosoma briicei rhodesiense

, m e s m o q u a n d o e x t r e m a m e n t e p e q u e n a s a s p a r a s i t e m i a s 3.

P o d e m o s a f i r m a r c j u e a t e n t a t i v a q u e e m p r e e n d e m o s , p a r a a v a l i a r a e f e t i v i d a d e d o s i s t e m a c o m a f i n a l i d a d e d e d e m o n s t r a r o

T.

c r u z i

n o s a n g u e , c o n d u z i u a r e s u l t a d o s a n i m a d o r e s . N ã o h o u v e i n t e r f e r ê n c i a n a s f o r m a s t r i p o m a s t i g o t a s , q u e m a n t i v e r a m c l a r a m o v i m e n t a ç ã o . A i n t e n s a f l u o r e s c ê n c i a n a s e s t r u t u r a s c o m á c i d o s n u c l é i c o s f a c i l i t a a i d e n t i f i c a ç ã o , i n c l u s i v e n a v i g ê n c i a d e i m o b i l i d a d e . O c o r r e u m a r c a n t e c o n c e n t r a ç ã o d e f l a g e l a d o s n a f a i x a e n t r e a s p l a q u e t a s e o p l a s m a , s u s c i t a n d o a i n d a ê n f a s e à s e n s i b i l i d a d e , p o i s n a d i l u i ç ã o a 1 / 1 0 2 4 0 e s t a v a u m t r i p a n o s s o m o e , p o r t a n t o , e m

60

m i c r o l i t r o s .

F a c i l i d a d e à e x e c u ç ã o , v i s u a l i z a ç ã o s e m d i f i c u l d a d e e e f i c i ê n c i a p e r a n t e b a i x a s p a r a s i t e m i a s c r e d e n c i a m o m é t o d o p a r a u t i l i z a ç ã o e m t r a b a l h o s d i a g n ó s t i c o s , t e r a p ê u t i c o s e c i e n t í f i c o s . J á t e m o s a c u m u l a d a a l g u m a e x p e r i ê n c i a n o q u e t a n g e a a c o m e t i m e n t o s h u m a n o s , a g u d o s , e e m r e a t i v a ç õ e s r e l a c i o n a d a s c o m i m u n o d e p r i m i d o s , d e r i v a n d o d a í o p i n i ã o s a t i s f a t ó r i a . O p o r t u n a m e n t e , r e l a t a r e m o s o q u e e s t á s e n d o r e g i s t r a d o . O u t r o s s i m , e s t a m o s a n a l i s a n d o o s a n g u e d e i n f e c t a d o s e e m f a s e c r ô n i c a ; t a l v e z a s e n s i b i l i d a d e m u d e c o n h e c i m e n t o c o n s o l i d a d o , d e a c o r d o c o m o q u a l p r o c e s s o s d i r e t o s n ã o m o s t r a m o

T. cru zi

n e s s a e t a p a d a p a r a s i t o s e .

R E F E R Ê N C I A S B I B L I O G R Á F I C A S

1. Camargo ME. Apreciação das técnicas sorológicas

atuais para o diagnóstico da doença de Chagas.

C om unicação. Arnato Neto V, M atsubara L, Lanura PNB. Avaliação do sistema quantitative buffy coat (QBC)

110

diagnóstico laboratorial da infeccão pelo Trypanosoma cruzi: estudo em modelo experim ental murino.

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diagnosis system. The American Journal o f

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