Rev. Soc. Bras. Med. Trop. vol.6 número1

THE A VI RULENCE OF THE CULTI VATED

P F

STRAI N OF

T R Y P A ­

N O S O M A C R U Z I

. V — THE EV AL UAT I ON OF PARASI T OL OGI C

TESTS AFTER V ACCI NAT I ON OF DI FFERENT ANI M AL SPECI ES.

Humberto M enezes (*) e Rosa Ribeiro (**)

A f ter v acci nati on w i th the live

P F

strai n of

T r y p a n o s o m a c r u z i ,

194 blood

cul tures were perf ormed i n 143 mice, 9 dogs, 5

C e b u s

monkeys and 7 hum an

subj ects.

Some of these blood cul tures were si mul taneousl y done w i th xenodi agnosi s,

subi nocul ati on i n baby mice and/ or cul ture of vi scerae.

The trypanosomes i sol ated f rom the few posi ti ve cases (6,1%) were i n ­

capabl e of i nf ecti ng baby mice were consi dered as cases of i m m unotol erance.

All the other tests were negati ve.

T h i s w o r k i n t e n d s t o d e m o n s t r a t e t h r o u g h b l o o d c u l t u r e s , x e n o d i a g n o s i s , s u b ­ i n o c u l a t i o n s a n d c u l t u r e o f v i sc e r a e , t h e a v i r u l e n c e o f t h e

PF

s t r a i n o f

T ry pano­

soma cruzi

(2 0 ) i n l a b o r a t o r y a n i m a l s a n d h u m a n s (6 , 8, 12, 1 8) .

M A T E R I A L A N D M E T H O D S

T h e m a j o r i t y o f a n i m a l s d e s c r i b e d i n t h i s c o m m u n i c a t i o n h a v e a l r e a d y b e e n u s e d i n s e v e r a l e x p e r i m e n t s p e r f o r m e d i n t h e l a s t f o u r y e a r s b y o n e o f u s (6 - 2 0 ) , a c o m m o n f a c e b e i n g t h a t a l l o f t h e m h a d b e e n v a c c i n a t e d w i t h t h e

PF

s t r a i n w i t h t h e d o se s m e n t i o n e d i n T a b l e 1.

T h e y l a t e r h a d b l o o d c u l t u r e w i t h o r w i t h o u t o n e o r s e v e r a l o f t h e t e s t s s p e c i f i e d a b o v e .

164 a n i m a l s w e r e u sed ; 143 w h i t e m i c e, 9 d o g s, 5

Cebus

m o n k e y s a n d 7 h u m a n b e i n g s i n w h i c h 194 b l o o d c u l t u r e s w e r e p e r f o r m e d .

T h e c u l t u r e m e d i u m u se d w a s t h a t o f W a r r e n , a s d e s c r i b e d b y o n e o f u s (1 ) . T h e

t e s t s w e r e r e a l i z e d 8, 15, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 270 a n d 510 d a y s a f t e r v a c ­ c i n a t i o n . I n so m e g r o u p s t e s t s w e r e m a d e o n l y o n c e i n o n e o f t h e s e p e r i o d s b u t i n o t h e r s i n m o r e t h a n o n e p e r i o d o r i n a l l o f t h e m a s w a s t h e c a se w i t h t h e h u m a n s u b j e c t s .

A m o n g t h e m i c e t h a n h a d o n l y b l o o d c u l t u r e s , t h e a m o u n t o f t o t a l b l o o d o r s e ­ r u m u s e d w a s 0,4 t o 0,7 m l f o r e a c h t e s t t u b e o f c u l t u r e m e d i u m .

W h e n m o r e t h a n o n e t e s t w a s p e r ­ f o r m e d o n m i c e, t h a t a m o u n t w a s o n l y 0,2 m l . I n h u m a n s u b j e c t s , d o g s a n d m o n ­ k e y s, t h e q u a n t i t y o f t o t a l b l o o d o r b l o o d s e r u m ( t h e l a t e r i n a c c o r d a n c e w i t h S t r o u t ’s t e c h n i q u e - 2 3 ) w a s a l w a y s 0,5 m l f o r e a c h t e s t t u b e .

T h e r e s u l t s o f t h e b l o o d c u l t u r e s w e r e a l w a y s r e c o r d e d o n t h e 3 0 t h . d a y a s a b l i n d t e s t s i n c e t h e t e c h n i c i a n h a d n o k n o w l e d g e o f t h e o r i g i n o f t h e m a t e r i a l u n d e r e x a m i n a t i o n .

T h e x e n o d i a g n o s i s w a d d o n e b y t h e u se o f 4 t h . i n s t a r n y m p h e s o f

Rhodni us

*

USP. Faculdade de Medicina de Ribeirão Prêto. São Paulo. Brasil.

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Rev. Soc. Bras. Med. Trop.

Vol. VI — N<? 1

p ro lix u p o r R h o d n i u s n e g l e c t u s i n t h e l a ­ b o r a t o r y a n i m a l s , a n d 5 t h . i n s t a r n y m p h s o f P a n s t r o n g i l u s m e g i s t u s o r T r i a t o m a i n -f e s t a n s i n t h e h u m a n s .

T h e t r i a t o m i n a e s u c k e d t h e b l o o d o f t h e a n i m a l s f o r 20 m i n u t e s a n d w e r e e x a ­ m i n e d a l s o as a b l i n d t es t , o n e m o n t h l a t e r .

T h e s u b i n o c u l a t i o n s i n y o u n g m i c e w e r e g e n e r a l l y p e r f o r m e d u s i n g h e p a r i n i z e d b l o o d , b u t s o m e t i m e s c e n t r i f u g e d b l o o d s e ­ r u m w a s u s ed as f o r t h e b l o o d c u l t u r e s .

T h e i n o c u l u m w a s 0,1 o r 0,2 m l a l w a y s i n j e c t e d i n t r a p e r i t o n e a l l y .

T h e i n o c u l a t e d a n i m a l s h a d t h e i r p e r i ­ p h e r a l b l o o d s e a r c h e d f o r p a r a s i t e s , b y t h e Pi z z i - Br e n e r t e c h n i q u e (2 ), 8,15 a n d 30 d a y s l a t e r , w i t h t h e e x c e p t i o n s m e n t i o n e d i n T a b l e 1.

A m o n g t h e s e e x c e p t i o n s w e r e t h e c as es o f s u c c e s s i v e s u b i n o c u l a t i o n s w h e n t h e a n i m a l s o f e a c h g r o u p w e r e b l e d t o d e a t h b y h e a r t p u n c t i o n 8 d a y s a f t e r v a c c i n a t i o n o r i n o c u l a t i o n o f p o s i t i v e b l o o d c u l t u r e . F r o m t h e b l o o d p o o l o f t h e f i r s t g r o u p t h e s e r u m w a s s e p a r a t e d , c e n t r i f u g e d a n d i n ­ j e c t e d i n a n e w g r o u p a n d so o n .

T h e c u l t i v a t i o n o f v i s c e r a e w a s d o n e i n t h e s a m e W a r r e n m e d i u m . U n d e r a s s e p t i c c o n d i t i o n s , f r a g m e n t s o f h e a r t , l i v e r a n d s p l e e n w e r e k e p t a n d t r i t u r a t e d i n s t e r i l e s a l i n e s o l u t i o n c o n t a i n i n g 1000 I U o f P e ­ n i c i l l i n a n d 1000 u g o f St r e p t o m y c i n p e r m l . 0,5 m l o f t h e t r i t u r a t e w e r e t r a n s f e r e d t o e a c h t u b e o f c u l t u r e m e d i u m .

A g r o u p o f 18 v a c c i n a t e d m i c e h a d b l o o d c u l t u r e 30 d a y s a f t e r c h a l l e n g e w i t h a v i r u l e n t s t r a i n w h i c h , w i t h t h e s a m e i n o ­ c u l u m , k i l l e d 1 0 0 % o f t h e c o n t r o l a n i m a l s .

T w o d o g s o u t o f 5 v a c c i n a t e d w i t h a v e r y l a r g e n u m b e r o f P F p a r a s i t e s p r e ­ s e n t e d p o s i t i v e b l o o d c u l t u r e s 21 d a y s a f t e r v a c c i n a t i o n . A s d e s c r i b e d i n t h e T a b l e 1 t h e s e c u l t u r e s w e r e i n o c u l a t e d i n t o y o u n g m i c e w i t h n e g a t i v e r e s u l t s .

O n e m o n t h a f t e r v a c c i n a t i o n t h e 5 d o g s w e r e c h a l l e n g e d w i t h t h e Y v i r u l e n t s t r a i n . T h i r t y a n d s i x t y d a y s l a t e r t h e b l o o d c u l ­ t u r e s o f a l l t h e a n i m a l s w e r e n e g a t i v e w h i l e 7 5 % o f t h e c o n t r o l d o g s h a d d i e d .

R E S U L T S

F r o m t h e 194 b l o o d c u l t u r e s r e a l i z e d o n l y 12, i . e . , 6 , 1 % g a v e p o s i t i v e r e s u l t s .

T h e p o s i t i v e c a s es c a n b e s u m m a r i z e d as f o l l o w s :

1) — Se v e n m i c e w i t h 10g o f b o d y w e i g h t t h a t h a d r e c e i v e d , p r e v i o u s t o v a c ­ c i n a t i o n , V i n b l a s t i n s u l p h a t e i n j e c ­ t i o n s . T h e p o s i t i v e b l o o d c u l t u r e s w e r e i n j e c t e d s u c c e s s i v e l y i n t o t h r e e g r o u p s o f y o u n g m i c e , w i t h n e g a t i v e

r e s u l t s .

2 ) — T w o d o g s o u t o f 5 t h a t r e c e i v e d v e r y l a r g e i n o c u l u m as a l r e a d y m e n t i o n e d .

3 ) — O n e m o u s e f r o m a g r o u p o f 4 t h a t , b e f o r e v a c c i n a t i o n , h a d r e c e i v e d a h i g h d o sag e o f Pr e d n i s o l o n e . Ei g h t m i c e i n o c u l a t e d w i t h t h e p o s i t i v e b l o o d c u l t u r e p r e s e n t e d n o p a r a s i ­ t e m i a u n t i l t h e 3 0 t h d a y o f i n o ­ c u l a t i o n .

4 ) — T w o m i c e o u t o f 5 t h a t r e c e i v e d a v e r y l a r g e n u m b e r o f P F p a r a s i t e s h a d p o s i t i v e b l o o d c u l t u r e s 15 d a y s a f t e r v a c c i n a t i o n . A s i n t h e p r e v i o u s c as es t h e i n j e c t i o n o f t h e s e c u l t u r e s i n y o u n g m i c e w e r e n e g a t i v e .

O f t h e 143 v a c c i n a t e d m i c e , 5 h a d , s i ­ m u l t a n e o u s l y , b l o o d c u l t u r e , x e n o d i a g n o - si s, c u l t u r e o f v i s c e r a e s u b i n o c u l a t i o n , n e ­

g a t i v e 8 d a y s a f t e r v a c c i n a t i o n .

A n o t h e r 5 a n i m a l s h a d o n l y b o o d c u l ­ t u r e , s u b i n o c u l a t i o n a n d x e n o d i a g n o s i s , w i t h t h e s a m e r e s u l t , 15 d a y s a f t e r t h e v a c c i n a t i o n .

T e n m i c e , 5 t r e a t e d p r e v i o u s l y w i t h A z a t h i o p r i n e a n d 5 w i t h M e t h o t r e x a t e , h a d n e g a t i v e b l o o d c u l t u r e a n d s u b i n o ­ c u l a t i o n 15 d a y s a f t e r r e c e i v i n g t h e P F v a c c i n e .

O n e g r o u p o f 22 m i c e t h a t h a d p r e ­ v i o u s l y b e g u n t r e a t m e n t w i t h a l o w d o sag e o f Pr e d n i s o l o n e a n d c o n t i n u e d i t u n t i l 30 d a y s a f t e r v a c c i n a t i o n , p r e s e n t e d a t t h i s t i m e n e g a t i v e c u l t u r e s o f b l o o d a n d v i s ­ c e r a e .

T h e o t h e r v a c c i n a t e d m i c e h a d o n l y b l o o d c u l t u r e s , a l l o f t h e m n e g a t i v e as d e s c r i b e d i n T a b l e 1.

Bl o o d c u l t u r e s a n d x e n o d i a g n o s i s w e r e d o n e o n t h e 5 O e b u s m o n k e y s , 3 o n t h e 3 0 t h , 1 o n t h e 9 0 t h d a y a n d 1 t h e 1 8 0 t h d a y a f t e r t h e v a c c i n a t i o n , a l l p r e s e n t i n g n e g a t i v e r e s u l t s .

A n i m al (n u m b er )

Bo d y w e i g h t .

(m e an )

V a c c i n e (m ean )

Bl o o d t u b es

-c u l t u r e - Res.

In o c u l a t i o n m i c e — Res .

Xe n o d i a g . n y m p h es — Re s.

m en 7 6 5 k g 3 x 1 0 5 5 — (7 ) 5 — (7 ) 5 — (7)

m o n k . 1 1,4 kg 4 x 1 0 7 3 — (1 ) 5 — (1 )

m en 5 65 kg 2x 10* 5 — (5 ) 5 — (5) 5 — (5)

m en 2 65 kg 3x1 0 7 5 - (2 ) 5 — (2) 5 — (2 )

m an 1 8 0 kg 3 x 1 07 14

_

(1 ) 5

_

(D 14 — (1)

14 — (1) 14 — (1 )

14 _{— (1 )} 14 — (1 )

m an 1 53 kg 3 x 1 07 10 _{- (1)} 5 - (1) 5 — (D

m an 1 80 kg 3 x 1 07 14

_

(1 ) 5 —

(1) 14 — (1 )

14

__

₍₁₎ 14 — (1 )

14 — (D 14 ~ (1 )

m an 1 53 k g 3 x 1 0 7 10 - (1 ) 5 _{— (1 )} 5 — (1 )

m o n k . 1 1,4 kg 4 x 1 0 7 3 — (1 ) 5 — (1 )

m an 1 80 kg 3 x 1 0 7 14

_

(1) 5

_

(1) 14 — (1)

14 — (1 ) 14 — (1)

14 _{— (1)} 14 — (1 )

m an 1 53 k g 3 x 1 0 7 5 — (D 5 — (D 5 — (1 )

m en 2 3 x 1 0 7 5 _— (2 ) 5 — (2) 5 — (2)

m en 2 3 x 1 0 7 5 - (2 ) 5 — (2) 5 — (2 )

m i c e 18 9 g 1,2x 10® 4 — (1 8 )

d o g s 5 1 kg 2 ,3 x 1 0 ° 3 — (5)

d o g s 5 1 kg 2 ,3 x 1 09 3 — (5)

( ) N u m b e r o f A n i m a l s + Po s i t i v e — N e g a t i v e A Z T — A z at h i o p r i n e Vb l — Vi n b l as t i n

Cu l t . t u b e s

T e s t . T i m e af t e r v ac .

Observat ion

60 d a y s

9 0 d a y s

9 0 d ay s

120 d ay s

150 d a y s 151 d ay s 1 52 d ay s

150 d ay s

1 80 d a y s 181 d ay s 1 82 d ay s

1 80 d ay s

1 8 0 d ay s

2 1 0 d ay s 211 d a y s 2 12 d a y s

2 1 0 d a y s

2 7 0 d a y s

5 1 0 d a y s

30 d a y s af t e r c h a l l e n g e

30 d a y s

a f t e r 2 C u l t . + 219 p . V a c . c h a l l e n g e

60 d a y s

af t er 2 C u l t . + 219 p . V a c . c h a l l e n g e

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Rev. Soc. Bras. Med. Trop.

Vol. VI — N? 1

O n e o f t h e s e v e n h u m a n v o l u n t e e r s h a d x e n o d i a g n o s i s i n t h e 5 t h . 6 t h . a n d 7 t h . m o n t h p o s t - v a c c i n a t i o n , f o l l o w i n g S c h e - n o n e ’ s t e c h n i q u e (2 2 ) .

A t t h e s a m e t i m e , b l o o d c u l t u r e s w er e d o n e , e m p l o y i n g 1 t u b e o f c u l t u r e t o e a c h t r i a t o m a b u g , i . e . , 14 t u b e s e v e r y d a y f o r 3 su c c e ssi v e d a y s a n d 3 su c c e ssi v e m o n t h s .

A l l t h e t e s t s d o n e o n t h e h u m a n s u b ­ j e c t s w e r e n e g a t i v e .

D I S C U S S I O N

I t i s n o t o u r i n t e n t i o n t o m a k e a n y c r i t i c a l a n a l y s i s o f t h e v a l u e o f t h e p a r a ­ si t o l o g i c t e s t s i n t h e d i a g n o s i s o f t r y p a ­ n o s o m i a s i s i n f e c t i o n .

T o t h o s e i n t e r e s t e d i n t h e s u b j e c t w e r e c o m m e n d t h e p a p e r s o f P e d r e i r a d e F r e i ­ t a s ( 5 ) , C h i a r i & B r e n e r (4 ) a n d A l b u ­ q u e r q u e (1 ) .

T h e l a t e r h a s d e m o n s t r a t e d t h a t m i c e w i t h c h r o n i c T . c r u z i i n f e c t i o n g a v e 6 1,7% p o si t i v e b l o o d c u l t u r e s . T h i s p e r c e n t a g e r o se t o 90% w h e n c u l t i v a t i o n o f h e a r t t r i ­ t u r a t e w a s m a d e s i m u l t a n e o u s l y .

A l t h o u g h t h i s p a p e r h a s b e e n w r i t t e n w i t h t h e a i m o f s h o w i n g t h e a v i r u l e n c e o f t h e P F s t r a i n b y t h e n e g a t i v i t y o f t h e p a ­ r a s i t o l o g i c t e s t s , w e t h i n k t h a t t h e i r i m ­ p o r t a n c e r e m a i n s i n t h e a n a l y s i s o f t h e p o s i t i v e r e su l t e .

A s o n e o f t h e r e s e a r c h e r s h a s a l r e a d y o b se r v e d (1 2 , 13, 1 5 ), i t i s p o ssi b l e u n d e r c e r t a i n s p e c i a l c o n d i t i o n s t o o b t a i n p o s i ­ t i v e p a r a s i t e m i a s a n d / o r b l o o d c u l t u r e s f r o m v a c c i n a t e d a n i m a l s .

I n t h e 194 b l o o d c u l t u r e s r e a l i z e d , o n l y 6,1% g a v e p o s i t i v e r e s u l t s .

T h i s i s a v e r y l o w v a l u e b u t w o u l d b e e n o u g h t o c h a l l e n g e o u r a s s e r t i o n t h a t t h e P F s t r a i n i s a v i r u l e n t i f t h e p o s i t i v i t y o f t h e c u l t u r e h a d r e p r e s e n t e d a r e a l d i s e a s e - i n f e c t i o n o f t h e a n i m a l s o r a r e s t o r a t i o n o f t h e p r i m i t i v e v i r u l e n c e o f t h e c u l t i v a t e d s t r a i n .

I n a n o t h e r w o r k , o n e o f t h e a u t h o r s

(1 9 ) h a s d i s c u s s e d t h i s s u b j e c t a n d d e ­ m o n s t r a t e d t h a t a l l t h e p o s i t i v e r e s u l t s c a n b e e x p l a i n e d a s a p h e n o m e n o n o f i m m u n o - t o l e r a n c e , s i n c e i n t h e a b s e n c e o f t h e p e ­ c u l i a r c i r c u n s t a n c e s t h a t i n d u c e t h i s p h e ­ n o m e n o n , a l l t e s t s so o n e r o r a f t e r v a c c i ­ n a t i o n w e r e a l w a y s n e g a t i v e .

N o v a c c i n a t e d a n i m a l , e v e n t h o s e w i t h p o si t i v e b l o o d c u l t u r e s o r t h o s e c h a l l e n g e d w i t h v i r u l e n t s t r a i n , d i e d f r o m t r y p a n o ­ s o m a i n f e c t i o n .

T h e t r y p a n o s o m a i s o l a t e d f r o m t h e b l o o d c u l t u r e s w e r e u n a b l e t o i n f e c t y o u n g m i c e (1 3 , 19) .

S a n t o s (2 1 ) h a v e s h o w n t h a t t h e P F s t r a i n i s i n c a p a b l e t o i n f e c t t o o t h e i n v e r - t e b r a t e d h o s t o f t h e p a r a s i t e .

I s i s w o r t h e m p h a s i z i n g t h a t e v e n w i t h t h e u se o f i m m u n o s u p p r e s s o r a g e n t s t h e p a r a s i t e m i a w a s a l w a y s n e g a t i v e a n d n o s u b i n o c u l a t i o n w a s p o si t i v e a n d n o p a r a ­ s i t e s w e r e d e t e c t e d i n t h e t i s s u e s o f t h e p o s i t i v e b l o o d c u l t u r e v a c c i n a t e d a n i m a l s

(7 , 9, 1 0 ) .

A s a l r e a d y d e m o n s t r a t e d (1 1 ) i n o c u l a o f 10* l i v e p a r a s i t e s o f t h e P F s t r a i n w e r e s u f f i c i e n t t o c o n f e r i m m u n i t y t o m i c e o f 10g b o d y w e i g h t .

T h e u s e i n n o r m a l a n i m a l s o f d o se s 105 t i m e s g r e a t e r a l w a y s s h o w e d n e g a t i v e b l o o d t e s t s w h i c h f o r u s r e p r e s e n t s g o o d e v i d e n c e o f t h e e v i r u l e n c e o f t h e s t r a i n a n d t h e b r o a d s a f e t y m a r g i n o f t h e v a c ­ c i n e .

I t i s a n e l e m e n t a r y r u l e o f P r e v e n t i v e M e d e c i n e t h a t n o b o d y u n d e r t h e a c t i o n o f i m m u n o d e p r e s s o r d r u g s (3 ) o r u n d e r i m m u n o p a r a l y s i s i n d u c i n g c i r c u n s t a n c e s s h o u l d b e a c t i v e l y v a c c i n a t e d . T h e P F v a c c i n a t i o n sh o u l d n o t b e e x c l u d e d f r o m t h i s r u l e .

E x c e p t i n s p e c i a l p o si t i v e c a se s w h i c h c a n b e c o n s i d e r e d a s c a s e s o f i m m u n i t o - l e r a n c e , w e c a n c o n c l u d e t h a t t h e P F s t r a i n o f T r y p a n o s o m a c r u z i i s a v i r u l e n t f o r m e n a n d a n i m a l s o n t h e b a s i s o f t h e p a r a s i t o l o g i c t e s t s h e r e m e n t i o n e d .

R E S U M O

A p ó s v a c in a ç ã o c o m a c e p a P F d o T r y p a n o s o m a c r u z i , 1 9 4 h e m o c u l t u r a s f o ­ r a m f e i t a s e m 1 4 3 c a m u n d o n g o s , 9 c ã e s , 5 m a c a c o s C e b u s e 7 h o m e n s .

-Jan.-Fevereiro, 1972

Rev. Soc. Bras. Med. Trop.

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r a m i n c a p a z e s d e p r o v o c a r i n f e c ç ã o q u a n d o in o c u la d o s u m a o u m a is v e z e s e m c a m u n d o n g o s j o v e n s . O f e n ô m e n o só o c o r r e u e m c e r t a s e d e t e r m i n a d a s c i r ­ c u n s t â n c i a s c o n s i d e r a d a s c o m o i n d u t o r a s d e i m u n o t o l e r â n c i a .

R E F E R E N C E S

1. A L B U Q U E R Q U E , R . D . R . — Es t u d o c o m p a r a t i v o e n t r e o v a l o r d o s x en o - d i a g n ó s t i c o s s e r i a d o s e o d as c u l t u r a s d e s a n g u e e d e t r i t u r a d o s d e ó r g ão s p a r a o d i a g n ó s t i c o d a t r i p a n o s s o m o s e a m e r i c a n a e x p e r i m e n t a l n a f a s e c r ô ­ n i c a . T e s e . F a c . Fa r m . O d o n t . Ri b . Pr e t o , 1968.

2 . B R E N E R , Z. — C o n t r i b u i ç ã o ao es­ t u d o d a t e r a p ê u t i c a e x p e r i m e n t a l d a D o e n ç a d e C h a g a s . T e s e . F a c . F a r m . O d o n t . U n i v . M . G e r a i s . B . H ., 1961.

3 . B I A N C H I , H . — Im u n i z a ç õ e s : c o n d u ­ t a s p r á t i c a s . I n D o e n ç a s t r a n s m i s s í ­ v e i s . V. A m a t o N e t o & J. L . B a l d y Ed t s . L i v . A t e n e u , S. Pa u l o , 1972.

4 . C H I A R I , E. & B R E N E R , Z . — C o n ­ t r i b u i ç ã o a o d i a g n ó s t i c o p a r a s i t o l ó g i c o d a D o e n ç a d e C h a g a s n a s u a f a s e c r ô n i c a . R e v . I n s t . M e d . t r o p . S . P a u ­ lo . 8 : 134- 138, 1966.

5 . F R E I T A S , J. L . P . — C o n t r i b u i ç ã o p a r a o e s t u d o d o d i a g n ó s t i c o d a M o ­ l é s t i a d e C h a g a s p o r p r o c esso s d e L a ­ b o r a t ó r i o . T e s e . F a c . M e d . U n i v . S. Pa u l o . , 1947.

6 . M E N E Z E S , H . — Pr o t e c t i v e e f f e c t o f a n a v i r u l e n t ( c u l t i v a t e d ) s t r a i n o f T r y p a n o s o m a c r u z i a g a i n s t e x p e r i ­ m e n t a l i n f e c t i o n i n m i c e . R e v . I n s t . M e d . t r o p . S . P a u lo . 1 0 : 1- 4, 1968.

7 . M E N E Z E S , H . — Le s õ e s h i s t o l ó g i c a s e m c a m u n d o n g o s “ v a c i n a d o s ” c o m u m a c e p a a v i r u l e n t a d e T r y p a n o s o m a crum i. R e v . B r a s . M e d . 2 5 : 160- 165, 1968.

8 . M E N E Z E S , H . — A c t i v e i m m u n i z a t ­ i o n o f d o g s w i t h a n o n v i r u l e n t s t r a i n o f T r y p a n o s o m a c r u z i . R e v . I n s t . M e d . t r o p . S . P a u l o . 1 1 : 258- 263, 1969.

9 . M E N E Z E S , H . — Le s õ e s h i s t o l ó g i c a s d o c o r a ç ã o e m c ãe s “ v a c i n a d o s ” c o m u m a c e p a a v i r u l e n t a d e T r y p a n o s o ­ m a c r u z i . R e v . B r a s . M e d . 2 6 : 281- 283, 1969.

10. M E N E Z E S , H . — C a r d i a c a n d h e p a t i c l e s i o n s i n l a b o r a t o r y a n i m a l s i m m u ­ n i z e d w i t h a n a v i r u l e n t s t r a i n o f T r y

-p n n o r o s a c r u z i . I I C o n g . Pa n a m . I n t . A c a d . Pa t h o l . Bu e n o s A i r e s 2 6 / 1 1 /

1969.

11. M E N E Z E S , H . — Im u n i z a ç ã o d e c a ­ m u n d o n g o s c o m “ v a c i n a ” v i v a a v i r u ­ l e n t a d e T r y p a n o s o m a c r u z i . I — E n ­ s a i o d a a v a l i a ç ã o d o m e n ò r i n ó c u l o e f i c i e n t e . R e v . S o c . B r a s . M e d . T r o p . 3 : 297- 303, 1969.

12. M E N E Z E S , H . — I — T h e a v i r u l e n c e o f t h e c u l t i v a t e d Y s t r a i n o f T r y p a ­ n o s o m a c r u z i . R e v . I n s t . M e d . t r o p . S . P a u l o . 1 2 : 64- 68, 1970.

13. M E N E Z E S , H . — I I — T h e a v i r u l e n c e o f t h e c u l t i v a t e d Y s t r a i n o f T . c r u z i. R e v . I n s t . M e d . t r o p . S . P a u lo . 1 2 : 129- 135, 1970.

14. M E N E Z E S , H . — I I I — T h e a v i r u l e n c e o f t h e c u l t i v a t e d Y s t r a i n o f T . c r u z i . R e v . I n s t . M e d . t r o p . S . P a u lo . 1 3 : 14- 17, 1971.

15. M E N E Z E S , H . — T h e a v i r u l e n c e o f t h e c u l t i v a t e d Y s t r a i n o f T r y p a n o ­ s o m a c r u z i . — I V — T h e e f f e c t o f i m - m u n o s u p r e s s i v e a g e n t s i n m i c e. R e v . S o c . B r a s . M e d . T r o p . ( i n p r e s s ) .

16. M E N E Z E S , H . — A p l i c a ç ã o d e v a c i n a v i v a a v i r u l e n t a d e T r y p a n o s o m a c r u z i em s er e s h u m a n o s ( N o t a p r é v i a ) . R e v . I n s t . M e d . t r o p . S . P a u lo . 1 3 : 144- 154, 1971.

17. M E N E Z E S , H . — T h e v a c c i n a t i o n o f h u m a n b e i n g w i t h l i v e a v i r u l e n t v a c ­

c i n e o f T r y p a n o s o m a c r u z i . A o n e y e a r f o l l o w - u p o f t h e f i r s t t w o c ases. H o s p it a l ( i n p r e s s ) .

18. M E N E Z E S , H . — T h e v a c c i n a t i o n o f a n e w g r o u p o f h u m a n v o l u n t e r s w i t h l i v e a v i r u l e n t s t r a i n o f T r y p a n o s o m a c r u z i . U n d e r p u b l i c a t i o n .

19. M E N E Z E S , H . — I m u n i z a ç ã o a t i v a c o n t r a a t r i p a n o s o m o s e s u l a m e r i c a n a . Sín t e s e d a n o ss a e x p e r i ê n c i a . R e v . B r a s . M e d . ( i n p r e s s ).

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Rev. Soc. Bras. Med. Trop.

Vol. VI — NO 1

2 1 . SA N T O S, J. C . M . — C o m p o r t a m e n t o d a c e p a a v i r u l e n t a P F d o T r y p a n o ­ s o m a c r u z i n o h o s p e d e i r o i n v e r t e b r a ­ d o . R e v . I n s t . M e ä . t r o p . S . P a u lo . 1 3 : 279- 284, 1971.

2 2 . SC H EN O N E, H . ; A L F A R O , E. ; R E Y S , H . & T A U C H ER , E . — V a l o r d e l x

e-n o d i a g e-n o s t i c o e e-n l a i e-n f e c c i o e-n c h a g a - s i c a c r o n i c a . B o ll. C h il. P a r a s it . 2 3 : 149- 153, 1968.

2 3 . ST R O U T , R . G . — A m e t h o d f o r c o n ­ c e n t r a t i n g h e m o f l a g e l l a t e s . J . P a r a s it .

4 8 : 100, 1 96 2.