Isabela Gomes Barreto da Motta1, Willian de Pascoa Pereira1, Isabella Silvestre Barreto
Pinto2, Isabela Fonseca3, Wagner Antônio Arbex4, Marcos Vinicius Gualberto Barbosa da
Silva5, Marta Fonseca Martins5
1Alunos de Graduação do Curso de Ciências Biológicas - CES-JF/Juiz de Fora. e-mail:
mottaigb@hotmail.com; willp_2@hotmail.com
2Doutoranda em Genética e Biotecnologia – UFJF/Juiz de Fora. Bolsista Capes. e-mail:
isabellasbp@gmail.com
3Doutoranda em Genética e Melhoramento - UFV/Viçosa. Bolsista CNPq. e-mail:
isabela_fonseca@yahoo.com.br
4Analista da Embrapa Gado de Leite. e-mail:wagner.arbex@embrapa.br
5Pesquisadores da Embrapa Gado de Leite. e-mail: marcos.vb.silva@embrapa.br;
marta.martins@embrapa.br
Resumo: A Deficiência de Uridina Monofosfato Sintetase (DUMPS) é uma doença
autossômica de caráter recessivo e caracteriza-se por uma mutação que ocorre no códon 405 do gene UMPS com a troca de uma citosina por uma timina, acarretando na deficiência da enzima UMP. Embriões homozigotos recessivos morrem em média até o 40º dia do período gestacional, em contrapartida, animais heterozigotos são assintomáticos. Dessa forma, objetivou-se estimar as frequências alélicas e genotípicas do gene UMPS nos animais participantes do Teste de Progênie da Raça Girolando e verificar se a população está em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Para isso foram genotipados 189 touros por meio da técnica de PCR-RFLP e os resultados observados estão próximos aos esperados indicando que a população está em equilíbrio de Hardy-Weinberg.
Palavras–chave: ácido orótico, mutação, pirimidina, progênie.
Abstract: The Deficiency of Uridine Monophosphate Synthase (DUMPS) is an autosomal
recessive disorder and it is characterized by a mutation which occurs in the codon 405 of the gene UMPS by the exchange of a cytosine for a thymine, causing a deficiency in the enzyme UMP. Recessive homozygous embryos die up to the 40th day of pregnancy on the
other hand heterozygous animals are asymptomatic. The objective was to estimate the allelic and genotypic frequencies of gene UMPS in animals participating of the Progeny Test of Girolando Breed and verify if the population is in Hardy-Weinberg equilibrium. 189 bulls were genotyped using PCR-RFLP method. The observed results are similar to those expected indicating that the population is in Hardy-Weinberg equilibrium.
Keywords: mutation, orotic acid, progeny, pyrimidine.
Introdução
A Deficiência de Uridina Monofosfato Sintetase (DUMPS) é uma doença autossômica monogênica de caráter recessivo, sendo inicialmente observada em gado da raça Holandesa nos Estados Unidos e, devido ao intenso uso do sêmen destes animais, atualmente, essa doença é encontrada em outros países (GHANEM et al., 2006; PATEL et al., 2006).
A DUMPS é caracterizada por uma mutação que ocorre no códon 405 do gene
UMPS com a troca de uma citosina por uma timina, acarretando na deficiência da enzima
UMP (SCHWENGER et al., 1993). Esta enzima é a principal responsável por catalisar as duas últimas etapas da síntese de novo de nucleotídeos de pirimidina com a conversão do ácido orótico em uridina monofosfato (SHANKS e ROBINSON, 1989).
As pirimidinas são essenciais para a síntese de DNA e RNA sendo necessária em altas quantidades durante o desenvolvimento embrionário. Embriões homozigotos recessivos para o alelo mutante morrem em média até o 40º dia do período gestacional devido à baixa síntese dos ácidos nucleicos, enquanto animais heterozigotos são assintomáticos (SCHWENGER et al., 1994). Na maioria dos casos, animais heterozigotos apresentam metade da atividade normal de síntese de UMP em eritrócitos e em diversos tecidos, além de excretarem elevados níveis de ácido orótico no leite e urina (SHANKS e ROBINSON, 1989; SCHWENGER et al., 1993). Para evitar o cruzamento entre indivíduos portadores, além da genotipagem, também é possível a realização de testes que medem a atividade de UMPS em eritrócitos.
O estudo de DUMPS apresenta grande importância para o melhoramento animal e está diretamente relacionado à criação de gado leiteiro já que a presença deste gene na população pode refletir em prejuízos aos produtores. Este estudo foi realizado com o objetivo de estimar as frequências alélicas e genotípicas do gene UMPS em animais participantes do Teste de Progênie da Raça Girolando bem como avaliar se a população está em equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW).
Material e Métodos
Foram genotipados 189 touros, participantes do Programa de Melhoramento da Raça Girolando, coordenado pela Embrapa Gado de Leite e Associação Brasileira dos Criadores de Girolando. Foram coletadas amostras (sêmen e/ou sangue) para a extração do DNA e foi utilizado o DNasey® Blood & Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA, EUA) de acordo com as recomendações do fabricante. A quantificação das amostras de DNA foi feita por espectrofotometria usando o NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, EUA). A identificação dos animais foi realizada através da técnica de PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism) na qual foram utilizados dois primers (um forward e um reverse) descritos por Schwenger e colaboradores (1993) e a amplificação do produto da PCR foi realizada no Termociclador
GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystem, Forster City, CA, EUA).
Para a digestão do produto da PCR foi utilizada a enzima Ava I (Promega Corporation, Foster City, CA, EUA)e o diagnóstico foi realizado em gel de agarose 3% corado com brometo de etídio. Em animais não portadores (TD) é possível observar uma banda de 53 e uma de 36 pb, já em animais portadores (DP) observam-se as bandas de 89, 53 e 36 pb. As frequências alélicas, genotípicas e o cálculo da probabilidade de EHW foram determinados por meio do programa Popgen 1.32 (YEH et al., 1997). A probabilidade de EHW, associada às frequências genotípicas observadas, foi testada pelo teste χ² (Qui- Quadrado) ao nível de significância de 5%.
Tabela1. Primers descritos por Schwenger e colaboradores (1993).
S09: 5’-GCAAATGGCTGAAGAACATTCTG-3’ S09: 5’-GCAAATGGCTGAAGAACATTCTG-3’
Resultados e Discussão
As frequências genotípicas encontradas para os genótipos TD e DP foram 1,00 e 0,00, respectivamente e as frequências alélicas foram 1,00 para o alelo T e de 0,00 para o alelo D. As frequências observadas encontram-se em concordância com as esperadas, indicando que a população estudada está em equilíbrio de Hardy-Weinberg.
O resultado obtido no presente estudo corrobora os resultados encontrados em estudo realizado por Patel e colaboradores (2006) com animais de raça Holandesa.
Tabela 1. Frequências genotípicas, alélicas e probabilidade de equilíbrio de Hardy-
Weinberg.
Gene Genótipo Número de animais Frequência EHW* Observado Esperado Genotípica Alélica
UMPS TD 189 189 1,00 1,00 0
DP 0 0 0,00 0,00
*P>0,05
Conclusões
Os dados obtidos mostram que a população estudada se encontra em equilíbrio de
Hardy-Weinberg, condição confirmada estatisticamente (P>0,05).
Agradecimentos
Ao CNPq. Agradeço a Dra. Marta Martins pela oportunidade de fazer parte da equipe do Laboratório de Genética Molecular. A Isabela Fonseca e Isabella Barreto pela paciência e por todo o conhecimento transmitido e aos demais companheiros do laboratório, Willian e Alessa, pela amizade. Agradeço também a equipe de Genética Molecular do Dr. Marco Antonio.
Literatura Citada
GHANEM, M. E.; NAKAOA, T.; NISHIBORI, M. Deficiency of uridine monophosphate synthase (DUMPS) and X-chromosome deletion in fetal mummification in cattle. Animal
Reproduction Science, v. 91, p. 45-54, 2006.
PATEL, R. K.; SINGH, M. K.; SONI, K. J.; CHAUHAN, J. B.; RAO, K. R. S. S. Lack of carriers of citrullinaemia and DUMPS in Indian Holstein cattle. Journal of Applied Genetics, v. 47, n.3, p. 239-242, 2006.
SCHWENGER, B.; SCHOBER, S.; SIMON, D. DUMPS Cattle Carry a Point Mutation in the Uridine Monophosphate Synthase Gene. Genomics, v. 16, p. 241-244, 1993.
SCHWENGER, B.; TAMMEN, I.; AURICH, C. Detection of the homozygous recessive genotype for deficiency of uridine monophosphate synthase by DNA typing among bovine embryos produced in vitro. Journal of Reproduction and Fertility, v. 100, p. 511-514, 1994.
SHANKS, R. D. e ROBINSON, J. L. Embryonic Mortality Attributed to Inherited Deficiency of Uridine Monophosphate Synthase. Journal of Dairy Science, v. 72, p.3035-3039, 1989.
YEH. F. C.; YANG. R. C.; BOYLE. T. B. J.; YE, Z. H.; MAO, J. X. POPGEN (VERSION 1.32): Software Microsoft Windows-based freeware for population genetics analysis. Alberta: University of Alberta, 1997.
Estabilidade genômica em uma população hexaploide híbrida
(capim-elefante X milheto)
Tatiana Aparecida Silva1, Marco Antônio Machado2, Juliane Dornellas Nunes3, Ana Luisa
Sousa Azevedo2, Juarez Campolina Machado2, Francisco José da Silva Lédo2, Emanuel
Masiero da Fonseca4 e Antônio Vander Pereira2
1Estagiária Bolsista do CNPq, e-mail: tatibiosocial@bol.com.br
2Pesquisadores da Embrapa Gado de Leite, e-mails: marco.machado@embrapa.br,
ana.azevedo@embrapa.br, juarez.machado@embrapa.br, francisco.ledo@embrapa.br, vander.pereira@embrapa.br.
3Pós-doutoranda da Embrapa Gado de Leite, e-mail: judornellas@gmail.com
4Universidade Federal de Juiz de Fora, email: emanuel_fonseca_1990@yahoo.com.br
Resumo: O gênero Pennisetum possui várias espécies de grande valor econômico, sendo o
capim-elefante (Pennisetum purpureum) e o milheto (Pennisetum glaucum) as espécies mais estudadas. Devido à proximidade genética entre tais espécies, é possível obter híbridos com relativa facilidade. O híbrido resultante do cruzamento é triploide e estéril, porém apresenta grande interesse para fins forrageiros, pois reúne características como resistência a seca e alta produção de matéria seca, além disso, a esterilidade pode ser revertida através da duplicação cromossômica. O presente trabalho teve como objetivo analisar características morfométricas dos cromossomos de híbridos interespecíficos hexaploides entre capim-elefante e milheto. Através dos resultados foi possível a caracterização do comprimento total do lote haploide dos cromossomos dos seis híbridos interespecíficos estudados, na qual os híbridos PCM-0701-11, PCM0701-22, PCM0701- 31 e PCM0701-32 apresentaram metáfases completas com 2n=42 cromossomos e os híbridos PCM0701-34 e PCM0701-35 foi observada a presença de metáfases incompletas, com o número de cromossomos variando entre 38 a 42, tornando-os mixoploides.
Palavras–chave: cromossomos, capim-elefante, milheto.
Abstract: The genus Pennisetum have several species of high economic value, the napier
grass (Pennisetum purpureum) and pear millet (Pennisetum glaucum) are the most studied species. Due to genetic proximity between these species it is possible to obtain hybrids with relative facility. The hybrid obtained is triploid and sterile, however this hybrid show great interest for forage purposes, because have characteristics like drought tolerance and high production of dry matter, besides this, the sterility could be reverted through chromosome duplication. This study aimed to analyze morphometric characteristics of the chromosomes of interspecific hybrids between hexaploid elephant grass and pearl millet. It was possible to characterize the length of the haploid lot of six interspecific hybrids studied, the hybrids PCM-0701-11, PCM0701-22-31 and PCM0701 PCM0701-32 showed complete metaphases with 2n = 42 chromosomes and the hybrids PCM0701 and PCM0701-34-35 showed incomplete metaphases with chromosome numbers ranging from 38 to 42, making them mixoploids.
Keywords: chromosomes, elephant grass, pear millet.
Introdução
O gênero Pennisetum está entre os mais importantes da família Poaceae, possuindo aproximadamente 140 espécies. Diversas espécies apresentam grande valor econômico, como o capim-elefante (Pennisetum purpureum) e o milheto (Pennisetum
glaucum). Uma estratégia comumente usada e recomendada para o melhoramento
genético de Pennisetum é a hibridação interespecífica. Devido à proximidade genética entre o capim-elefante e o milheto é possível a obtenção de híbridos com relativa
facilidade (SOUSA SOBRINHO et al, 2005). Contudo, este híbrido é triploide e estéril, dificultando sua propagação via sementes. A restauração da fertilidade pode ser obtida através do uso de agentes antimitóticos, produzindo então híbridos hexaploides com meiose regular. Dessa forma, a Embrapa Gado de Leite desenvolve um programa de melhoramento utilizando a técnica acima citada.
A duplicação cromossômica causa alterações genéticas nas plantas, como os fenômenos da poliploidia e mixoploidia decorrentes da variação no número de cromossomos (ABREU, 2002). O presente trabalho teve como objetivo realizar a análise cariotípica e verificar a sua relação com mudanças morfométricas decorrentes do processo de poliploidização.
Material e Métodos
O experimento foi conduzido no laboratório de Genética Vegetal da Embrapa Gado de Leite, localizado no município de Juiz de Fora, MG. Foi realizada a análise citogenética de seis híbridos interespecíficos hexaploides de propagação vegetativa pertencentes ao gênero Pennisetum (PCM0701-11, PCM0701-22, PCM0701-31, PCM0701-32, PCM0701-34, PCM0701-35).
O preparo das lâminas foi feito através dos métodos de secagem ao ar e esmagamento. As raízes utilizadas foram obtidas a partir de estacas. Foram selecionadas cinco metáfases/genótipo para obtenção dos parâmetros morfométricos dos cromossomos. A captura de imagens foi realizada através de microcâmera digital acoplada ao microscópio Olympus BX-60. As imagens foram processadas pelo programa Image Pro
Plus. Os cromossomos foram medidos através do Programa Image Tool 3.0 UTHSCSA.
Tal medição foi feita a partir da extremidade do braço longo (BL) até o centrômero, inclusive constrições secundárias quando presentes e da extremidade do braço curto (BC) até centrômero. Foram obtidos os valores de: braço longo (BL), braço curto (BC), comprimento total do cromossomo (CTi= BL + BC), relação de braço (RB=BL/BC), comprimento total do lote haploide (CTLH= ∑CTi/2), comprimento relativo (CR= CTi/CTLH x 100). Os cromossomos foram organizados e numerados em ordem decrescente de tamanho e identificaram-se os pares homólogos. A classificação morfológica dos cromossomos foi realizada de acordo com Guerra (2003).
Resultados e Discussão
Através da análise cariotípica foi possível caracterizar o comprimento total do lote haploide (CTLH) dos híbridos interespecíficos de Pennisetum estudados. Foi possível observar a existência de diferenças significativas entre o complemento total do lote haploide dos seis híbridos interespecíficos avaliados. O genótipo PCM0701-31 apresentou a maior média de CTLH enquanto o genótipo PCM0701-32 apresentou menor média. O coeficiente de variação da análise para o CTLH se manteve abaixo de 20%, conferindo boa precisão experimental aos dados segundo Pimentel Gomes (1990). Os cariótipos de todos os híbridos apresentaram apenas cromossomos metacêntricos e submetacêntricos, não foram observados cromossomos acrocêntricos (a) e telocêntricos (t).
Quanto ao comprimento relativo, no genótipo PCM0701-32, o cromossomo maior apresentou média de 7,87% do comprimento do lote haploide, demonstrando ser 3,14 vezes maior que o menor cromossomo, cuja média do comprimento relativo representou 2,50% do comprimento do lote cromossômico, sendo esta a maior diferença dentre os seis genótipos avaliados. A menor diferença encontra-se no genótipo PCM0701-34, em que o maior cromossomo apresentou comprimento relativo médio de 7,72%, sendo 2,45 vezes maior que o menor cromossomo, no qual a média do comprimento relativo foi 3,14%. Ao realizar análise cariotípica em híbridos hexaploides de capim-elefante e milheto, Campos (2007) observou que o comprimento relativo dos cromossomos variou entre 7,11% no primeiro par de cromossomos até 3,28% no vigésimo primeiro par de cromossomos do híbrido hexaploide. Os resultados indicaram que a eliminação de sequências de DNA em híbridos hexaploides pode derivar de conflitos intergenômicos.
Foi observada variação no comprimento total dos cromossomos, tal variação pode ser decorrida possivelmente da diferença no grau de condensação dos cromossomos.
Figura 1. Metáfases dos híbridos hexaploides analisados PCM 0701-11 (A), PCM-0701-22 (B), PCM 0701-31 (C), PCM0701- 32 (D), PCM 0701-34 (E) e PCM 0701- 35, com 36 cromossomos(F). As barras representam 10 µm.
Dos seis genótipos analisados, os híbridos PCM0701-11, PCM0701-22, PCM0701-31 e PCM0701-32 apresentaram 2n=42 cromossomos, contudo nos híbridos PCM0701-34 e PCM0701-35 foi observada a presença de metáfases incompletas, com o número de cromossomos variando de 38 a 42, tornando-os mixoploides (Figura 1). A mixoploidia em híbridos de Pennisetum pode ser resultado da eliminação de cromossomos individuais ou de genomas completos, sendo relatada também por outros autores (LEÃO et al; 2011; CAMPOS, 2007). A identificação de metáfases incompletas reforça a teoria de existência de eliminação cromossômica em híbridos duplicados. Dessa forma, para otimizar o processo de seleção de genótipos superiores, uma das características que devem ser levadas em consideração é a estabilidade genômica. Essa característica pode ser avaliada facilmente através da citometria de fluxo, ou seja, é possível analisar grandes populações e determinar quais os genótipos são mais estáveis. Essa informação juntamente com as avaliações agronômicas servirá de base para a seleção de genótipos superiores que contribuirão para a formação das próximas gerações.
Conclusões
A análise cariotípica revelou a presença de variações numéricas e morfométricas entre os genótipos analisados. Dessa forma, é possível afirmar que existe eliminação de cromossomos após os eventos de hibridação e duplicação do DNA em híbridos (capim- elefante x milheto).
Agradecimentos
Literatura citada
ABREU, J. C. Mixoplodia em híbridos de capim-elefante x milheto tratados com agentes
antimitóticos. 2002. 72p. Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento de Plantas)
– Universidade Federal de Lavras, Lavras.
CAMPOS, J. M. S. Obtenção de híbridos hexaploides e análise genômica em Pennisetum
sp. por citometria de fluxo. 2007. 115f. Tese (Doutorado em Genética e Melhoramento de
Plantas)- Universidade Federal de Lavras, Lavras.
GUERRA, M. S. Variação e evolução cromossômica: variação numérica. Introdução à citogenética geral. Guanabara Koogan. 2003. 142p.
LEÃO, F. F; DAVIDE, L. C.;CAMPOS, J. M. S.; PEREIRA, A. V.; BUSTAMANTE, F. O. Genomic behavior of hybrid combinations between elephant grass and pearl millet.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v.46, n.7, p.712-719, jul. 2011.
PIMENTEL, GOMES F. Curso de estatística experimental. 13. Ed. Piracicaba: Nobel, 1990. 468 p.
SOUZA SOBRINHO, F. de; PEREIRA, A.V.; LÉDO, F.J. da S.;BOTREL, M. de A.; OLIVEIRA, J.S.; XAVIER, D.F. Avaliação agronômica de híbridos interespecíficos entre capim-elefante e milheto. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 40, p. 873-880, 2005.