Caputo, L.S.1; Valente M.S.B.1; Fernandes L.E.2; Silva R.C.B.3; Carneiro, J.C.4; Otenio, M.H.4;
Ribeiro M.T.4.
1Acadêmicas do curso de Farmácia da Faculdade de Ciências Médicas e da Saúde de Juiz de
Fora - Suprema
2Acadêmica do curso de Ciências Biológicas do Centro de Ensino Superior de Juiz de Fora- CES 3Mestranda em Genética e Biotecnologia da Universidade Federal de Juiz de Fora
4Embrapa Gado de Leite
Resumo: Fungos anaeróbios do rúmen possuem capacidade de digerir polímeros da parede
celular vegetal por penetrarem profundamente nos tecidos por meio de talos e rizóides de zoósporos móveis. Os gêneros mais comumente descritos pela literatura são: Neocallimastix,
Piromyces, Orpinomyces, Anaeromyces, Caecomyces e Cyllamyces. O objetivo deste trabalho
foi identificar, com base em caracteres morfológicos, os fungos encontrados no rúmen de vacas Holandês X Gir. O líquido ruminal foi coletado de três vacas, acondicionado em garrafas térmicas pré-aquecidas a 39 oC e transportado para o laboratório. Após ajustar o pH do líquido ruminal,
sob fluxo de CO2, alíquotas de 1,0 mL foram inoculadas em meio de diluição. Posteriormente 0,3
mL do material inoculado foi transferido para tubos contendo meio para fungo com antibiótico, os quais foram incubados a 39 oC. Após o crescimento das colônias preparou-se lâminas com
fragmentos do fungo, pescados com pipetas de 1 mL e corados com o azul de algodão, estas foram analisadas em microscópio óptico no aumento de 100 vezes. O estudo das características dos micro-organismos ruminais serve como ferramenta para bioprospecção de biótipos importantes para diversas áreas do conhecimento. Foram encontrados no conteúdo ruminal analisado fungos celulolíticos anaeróbios dos gêneros Neocallimastix, Anaeromyces e Aspergillus spp tais fungos, de atividade celulolítica, lançam uma gama de enzimas celulares para degradar as paredes lignificadas das forrageiras.
Palavras–chave: fibra vegetal, fungos anaeróbios, morfologia microbiana.
Abstract: Anaerobic rumen fungi are capable of digesting plant cell wall polymers to penetrate
deep into the tissues through rhizoid and stalks of mobile zoospores. The genera most commonly described in the literature are: Neocallimastix, Piromyces, Orpinomyces, Anaeromyces,
Caecomyces and Cyllamyces. The objective of this study was to identify, based on
morphological characters, the fungi found in the rumen of Holstein x Gir cows. The rumen fluid was collected from three cows, packed in thermos pre-heated to 39 °C and transported to the laboratory. After adjusting the pH of the rumen fluid under a flow of CO2, 1.0 mL aliquots were
inoculated in a dilution. Subsequently 0.3 mL of the inoculated material was transferred to tubes containing medium fungal antibiotic, which were incubated at 39 oC. After growth of the
colonies was prepared with fragments of the blades fungus, fish pipetting 1 mL and stained with blue cotton, they were examined under an optical microscope at 100-fold increase. The study of the characteristics of rumen microorganisms serves as a tool for bioprospecting biotypes important in many areas of knowledge. Were found in the rumen cellulolytic anaerobic fungi examined the genera Neocallimastix, Anaeromyces and Aspergillus spp., the cellulolytic activity of these fungi, launch a range of enzymes to degrade cell walls of lignified forages.
Keywords: plant fiber, anaerobic fungi, microbial morphology
Introdução
Os anaeróbios são um grupo incomum de fungos zoospóricos capazes de digerir polímeros resistentes da parede celular de plantas por penetrarem profundamente nos tecidos
vegetais, normalmente não acessíveis às bactérias, por meio de talos e rizóides de zoósporos móveis, os quais aderem aos fragmentos das forragens. Estes microorganismos possuem enzimas altamente ativas na degradação da lignocelulose, sendo considerados, portanto, de grande importância nos estudos microbiológicos do ecossistema ruminal, por degradarem fibras em forragens de baixa qualidade (SRIDHARET al., 2007; BERCHILLI et al., 2011).
Os gêneros de fungos anaeróbios do rúmem mais comumente descritos pela literatura são: Neocallimastix, Piromyces, Orpinomyces, Anaeromyces, Caecomyces e Cyllamyces. Tais gêneros são pertencentes à família Neocallimasticaceae, dentro da ordem Neocallimastigales do filo Neocallimastigomycota (CHEN et al., 2007; LIGGENSTOFFER et al., 2010).
As espécies catalogadas são definidas pela análise da morfologia do talo (monocêntrico, policêntrico e filamentoso/bulboso) e pelo número de flagelos por zoósporo (uniflagelados ou poliflagelados). Dados moleculares têm sido usados como alternativa complementar na classificação dos fungos. A habilidade em degradar a parede celular vegetal varia de acordo com a espécie e a cepa dos fungos. Cepas do gênero Caecomyces normalmente demonstram atividade celulolítica reduzida se comparados à de cepas de outros gêneros (ALMEIDA, 2009). Os fungos anaeróbios participam da hidrólise da biomassa das plantas em ruminantes, por intermédio de enzimas, que têm importante função na fermentação ruminal. A hidrólise enzimática da celulose é considerada como um dos principais passos limitantes da produção biológica de biocombustíveis a partir de biomassa lignocelulósica (MAKI et al., 2009).
Este trabalho teve por objetivo, identificar, com base em caracteres morfológicos, os fungos encontrados no rúmen de vacas Holandês X Gir.
Material e Métodos
O líquido ruminal foi coletado de três vacas Holandês X Gir, fistuladas, no Campo Experimental José Henrique Bruschi, da Embrapa Gado de Leite-Coronel Pacheco, MG, em garrafas térmicas preaquecidas a 39 oC e transportado para o Laboratório de Microbiologia do
Rúmen da Embrapa Gado de Leite, em Juiz de Fora, MG. O conteúdo das garrafas térmicas teve o pH ajustado para 6,8 e, uma alíquota de 1 mL foi transferida para um tubo estéril de Hungate, contendo 9 mL do meio de diluição (75,0 mL de solução mineral I, 75,0 mL de solução mineral II, 850,0 mL de água destilada, 1,0 mL de resazurina, para o preparo de 1,0 L). A solução mineral I era composta por: 6,0 g K2HPO4 6% e água destilada qsp. Já solução mineral II
continha: 6,0 g KH2PO4, 12,0 g (NH4)2SO4, 12,0 g NaCl, 1,2 g MgSO4 7H2O, 1,2 g CaCl2 2 H2O,
água destilada qsp.
Uma alíquota de 0,3 mL do líquido ruminal, anteriormente diluído na concentração de 10-1, foi inoculada em duplicata em meio para fungos (670,0 mL de água destilada, 150,0 mL de
líquido ruminal centrifugado, 85,0 mL de solução mineral I, 85,0 mL de solução mineral II, 0,75 mL de solução de vitaminas, 2,0 g de celobiose, 0,5 g de extrato de levedura, 2,0 mL de hemina 0,1%, 1,0 mL resazurina 0,1%, 1,0 g de triptona, 1,0 g de ágar puro, 5,0 g de NaHCO3, 0,8 g
de Cisteína HCl, para o preparo de 1 L) acrescido de 1 mL de antibiótico e um fragmento de 4,0 cm x 4,0 cm de papel de celulose. Um litro de antibiótico continha: 300 mg de cloranfenicol, 250 mg de sulfato de estreptomicina, 40 mg de ampicilina, 125 mg de tetraciclina, 300 mg de sulfato de neomicina e 980 mL de água destilada. Todos os cuidados para a manutenção do ambiente em anaerobiose foram tomados, mantendo o fluxo de CO2 nos tubos.
Os tubos foram incubados em uma estufa regulada à 39 oC por período, de no mínimo,
sete dias para o crescimento dos fungos. Ao observar o crescimento com a degradação do papel de celulose, uma alíquota foi transferida para manutenção e purificação da cultura em meio de
Roll-Tube adicionado de ágar e antibiótico. Os isolados foram novamente repicados em meio de
cultura para fungos contendo papel de celulose e antibiótico e, imediatamente, caracterizados em lâminas preparadas com fragamentos da estrutura fúngica obtidos por pescagem e corados com azul de algodão. As lâminas foram analisadas em microscopia óptica, em aumento de 100 vezes, sob condensador alto, nesta etapa, os fungos foram caracterizados por comparação com a literatura.