Natana Chaves Rabelo1, Michele Munk Pereira2, Sabine Wohlres-Viana2, Savana Giacomini
Brito3,Carolina Capobiango Romano Quintão2, João Henrique Moreira Viana2, Luiz Sérgio
de Almeida Camargo2
1Graduada em Ciências Biológicas – Centro de Ensino Superior de Juiz de Fora 2Embrapa Gado de Leite – Juiz de Fora/MG
3Graduada em Biomedicina – Universidade Presidente Antônio Carlos – Juiz de Fora/MG
Resumo: O extrato etanólico de Azadirachta indica A. JUSS tem demonstrado potencial de
inibição do ciclo de algumas células, podendo ser candidato a contribuir para o aumento da eficiência da Transferência Nuclear com Células Somáticas (TNCS). O objetivo do trabalho foi avaliar possíveis efeitos prejudiciais do extrato sobre células expostas a ele, por meio da expressão de genes de estresse e apoptose. A abundância relativa dos transcritos de HSP70.1A, HSBP1, HSP27.P1, BAX, BCL-2 e WNT5A em fibroblastos bovinos expostos às concentrações 50, 100 e 200 µg/mL do extrato, foi realizada em comparação a um controle negativo (0 µg/mL) pela técnica de Real-Time PCR. A partir da quantificação pelo método do Ct (cycle threshold) comparativo, foi observado que a
maioria dos transcritos avaliados apresentou-se subregulado em relação ao grupo controle, onde apenas HSP27.P1 do tratamento 100 µg/mL e HSP70.1A do tratamento 200 µg/mL não apresentaram diferenças significativas (p>0,05) em relação a ele, evidenciando alteração na expressão destes genes após a exposição ao extrato. Conclui-se que esse extrato pode interferir na transcrição de alguns genes, sendo necessários outros testes para que seja possível determinar se ele pode ser utilizado na TNCS, sem danos às células doadoras de núcleo.
Palavras–chave: ciclo celular, reprogramação gênica, transferência nuclear, viabilidade
celular.
Abstract: The ethanol extract of Azadirachta indica A. Juss has shown potential cycle
inhibition of some cells, may be a candidate for contributing to increase the efficiency of nuclear transfer of somatic cell (SCNT). The objective of this study was to evaluate possible harmful effects of the extract on cell exposed to it, through the expression of genes for stress and apoptosis. The relative abundance of transcripts HSP70.1A, HSBP1, HSP27.P1, BAX, BCL-2 and WNT5A at bovine fibroblasts exposed to concentrations 50, 100 and 200 µg/mL of the extract was performed in comparison to a negative control (0 µg/mL) by technique of Real-Time PCR. From the quantification method of Ct (cycle
threshold) of comparison, it was observed that most of the transcripts evaluated is down regulated in relation to control group, where only HSP27.P1 treatment 100 µg/mL and HSP70.1A treatment 200 µg/mL showed no significant differences (P>0,05) in relation to it, reveling a change in expression of these genes after exposure of cells to extract. In conclusion, this extract can interfere with the transcription of some genes, additional tests are needed to be able to determine if it can be used in SCNT without damage to the donor nucleus cell.
Keywords: cell cycle, cell viability, gene reprogramming, nuclear transfer.
Introdução
A técnica de Transferência Nuclear com Células Somáticas (TNCS) é considerada atualmente uma das mais avançadas biotecnologias, principalmente na pecuária. Entretanto, ela ainda apresenta baixa eficiência, onde apenas uma pequena proporção (de
0 a 4%) de embriões reconstruídos se desenvolve normalmente (HEYMAN et al., 2002). Dentre os principais fatores que interferem no desenvolvimento desses embriões, destaca- se a fase do ciclo em que as células doadora e receptora se encontram no momento da TN (
WILMUT
et al., 1998).Segundo Campbell et al. (1996), durante o final da fase G2 até o início da G1, a cromatina é capaz de se redirecionar e permitir a reprogramação nuclear. No caso da transferência de um núcleo diplóide (2 n), os cromossomos se condensam, se organizam na placa metafásica e são deslocados, aleatoriamente, para os pólos do fuso. Posteriormente, sofrem descondensação para a síntese do DNA e para a primeira divisão mitótica (SOLTER, 2000). Já no caso de um núcleo doador em fase S (4 n), a cromatina sofre condensação prematura quando introduzida no citoplasma de oócitos MII (metáfase II), alterando sua integridade (RAO, 1990), o que compromete a capacidade de responder às demandas enviadas pelo citoplasma para o início do desenvolvimento embrionário.
Dentre os métodos de inibição do ciclo celular mais utilizados atualmente, estão a confluência (inibição por contato celular) e a soroprivação (retirada parcial de soro do meio de cultivo). Existem também alguns químicos utilizados para a mesma finalidade, todos apresentando um efeito reversível. Entretanto, nenhum destes métodos é 100% eficaz pois, além de não proporcionarem a parada do ciclo sincronicamente entre as células em cultivo, podem provocar danos no DNA e levar à apoptose (KUES et al., 2000).
Uma alternativa a esses métodos seria a utilização de extratos vegetais, como é o caso da Azadirachta indica A. Juss (nim), que já apresentou eficiência em estacionar o ciclo de células cancerígenas (KUMAR et al., 2006). Por outro lado, além de proporcionar a parada do ciclo, alguns efeitos deletérios foram observados após sua administração, o que poderia se tornar um problema para a utilização na TNCS. Entretanto, a toxicidade parece depender diretamente da dosagem administrada, como observado por Kumar et al. (2006), que relataram up regulation de proteínas Bax (pró-apoptóticas) de forma dose- dependente do extrato etanólico de Azadirachta indica.
Pelo o exposto acima, extratos deste vegetal são candidatos à inibição do ciclo celular, mas é necessário avaliar seus possíveis efeitos citotóxicos para viabilizar a utilização na TNCS. Desta forma, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a expressão de alguns genes relacionados ao estresse celular e apoptose em fibroblastos bovinos expostos a diferentes concentrações do extrato etanólico de Azadirachta indica.
Material e Métodos
Foram utilizados fibroblastos coletados de uma vaca Gir do Campo Experimental José Henrique Bruschi, Coronel Pacheco-MG, pertencente a Embrapa Gado de Leite, que foram previamente cultivados e congelados em nitrogênio liquido (N2). O cultivo dos
fibroblastos foi realizado em meio Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM – SIGMA), acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB) e 0,1% de antibiótico (estreptomicina + penicilina). Foram realizados três tratamentos com diferentes concentrações do extrato etanólico: 50, 100 e 200 µg/mL, durante 24 horas de exposição. O extrato foi adicionado ao meio de cultivo no momento em que as células atingiram 30-40% de confluência da placa. Após a retirada do meio com o extrato, as células foram distribuídas em tubos criogênicos de 1,0 mL, com 2 x 106 de células em 20 µL de PBS para cada tratamento,
em triplicata e, imediatamente, congeladas em N2. As células foram estocadas em freezer
à -80 ºC até o momento da extração do RNA total.
Para a extração do RNA foi utilizado o kit comercial RNeasy Micro Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha) de acordo com as especificações do fabricante. Do volume final recuperado após o procedimento, aproximadamente 11 µL, foi retirada uma amostra de 1 µL para quantificar o RNA total, através do aparelho espectrofotômetro nd-1000 (Nanodrop, Wilmington, DE, EUA). A transcrição reversa para a síntese do cDNA foi realizada com o Kit comercial SuperScript III First-Stand Synthesis Supermix (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) seguindo as recomendações do fabricante.
Os primers (β-ACTINA, HSP70.1A, HSBP1, HSP27.P1, BAX, BCL-2 e WNT 5a) foram desenhados a partir de sequências disponíveis no banco de dados do GenBank
(www.ncbi.nlm.nih.gov) utilizando o programa Prime3 (ROZEN; SKALETSKY, 2000) e a sequência do primer GAPDH foi obtida a partir da referência de Mourot et al. (2006). Todos os primers foram sintetizados pela Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, EUA) e estão descritos na Tabela 1.
Tabela 1. Informações dos primers utilizados.
Produto Sequência do primer
Temperatura de pareamento Tamanho do produto (pb) N° de acesso no GenBank/Referência β-ACTINA (endógeno) F5’GACATCCGCAAGGACCTCTA3’ R 5’ACATCTGCTGGAAGGTGGAC3’ 53 ºC 205 NM_173979 GAPDH (endógeno) F5’CCAACGTGTCTGTTGTGGATCTG3’
R 5’GAGCTTGACAAAGTGGTCGTTGAG3’ 53 ºC 237 Mourot et al., (2006) HSP70.1A F5’CGGAGAAGGACGAGTTTGAG3’ R 5’ACATGAGCAATCCAGGGAAG3’ 59 °C 192 NM203322.2 BAX F5’TTTGCTTCAGGGTTTCATCCAGGA3’ R 5’CAGCTGCGATCATCCTCTGCAG3’ 64 ºC 174 NM173894 BCL-2 F5’TGGATGACCGAGTACCTGAA3’ R 5’CAGCCAGGAGAAATCAAACA3’ 53 ºC 120 XM_586976 HSBP.1 F5’TGCAGGATCTCACCTCAGTG3’ R 5’ GTTCCAGATTCCAGCGAAGA3’ 55 ºC 236 NM_001113316.1 WNT5a F5’GAGAGCGCGCGCATCCTGAT3’ R 5’ CAGCTGCAGCCAGCACGTCT3’ 67 ºC 135 NM_001205971.1 HSP27.P1 F5’AGCTGACGGTCAAGACCAAG3’ R 5’ GGGGACAGAGAGGAGGAGAC3’ 57 ºC 154 NM_001025569.1
A abundância de cDNA de cada amostra foi realizada utilizando a metodologia de PCR em Tempo-Real. Foi utilizado o kit comercial QuantiTect Sybr Green PCR Kit (QIAGEN), de acordo com as recomendações do fabricante. Foram feitas reações em triplicata para cada amostra e controles negativos foram preparados, onde o cDNA foi omitido durante a reação e substituído por H2O, em placas ópticas de reação de 96 poços
(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). As placas foram seladas com filme adesivo óptico (Applied Biosystems) e amplificadas no aparelho ABI PRISM® 7300 Sequence
Detection Systems (Applied Biosystems), sob incubação por 95 ºC por 15 min., seguido
de 45 ciclos de 94 ºC por 15 seg., ligação na temperatura específica para cada primer (conforme descrito na Tabela 1) por 30 seg e extensão a 72 ºC por 30 seg.
A quantificação foi realizada utilizando-se o método do Ct (cycle threshold)
comparativo, com os resultados expressos relativos a genes de referência endógena e um grupo controle. Como a quantificação relativa se baseia na frequência relativa dos transcritos do gene alvo em relação a um gene de expressão constitutiva, foram amplificadas as sequências dos primers β ACTINA e GAPDH e o que apresentou menor coeficiente de variação foi utilizado como referência endógena, e um grupo calibrador (grupo controle negativo).
Os produtos amplificados foram analisados em gel de agarose a 1,5% e corados com brometo de etídio, para a verificação dos tamanhos dos fragmentos, especificidade das reações e validação dos resultados obtidos pela PCR em tempo real.
As análises de quantificação relativa dos transcrito de β-ACTINA, HSP70.1A, HSBP1, HSP27.P1, BAX, BCL2 e WNT5A, foi feita pelo Relative Expression Software Tool (REST®) (PFAFFL, HORGAN e DEMPFLE, 2002) que possui o modelo estatístico Pair Wise
Fixed Reallocation Randomisation TEST® (versão 384 - Beta, 2005), utilizado para analisar
os dados obtidos da quantificação relativa da PCR em Tempo-Real.
Resultados e Discussão
Comparando-se a abundância dos transcritos no tratamento de 50 µg/mL com o controle, todos os transcritos foram subregulados (P<0,05; P<0,001) (Figura 1).
Figura 1. Abundância relativa dos transcritos no tratamento de 50 µg/mL. Os resultados estão demonstrados em média e erro padrão da média (EPM), utilizando-se como calibrador o grupo controle negativo (0 µg/mL), com valor igual a 1. Diferenças significativas entre os grupos são indicados por *para P<0,05 e **para P<0,001.
No tratamento de 100 µg/mL, observou-se menor abundância de transcritos (P<0,05) da maioria dos genes de reposta ao estresse (HSP70.1A, WNT5a, HSBP1) e dos relacionados ao processo de apoptose (BCL-2, BAX), sendo o HSP27.P1 o único transcrito que não apresentou diferenças significativas (P>0,05) em relação controle negativo (Figura 2).
Figura 2. Abundância relativa dos transcritos no tratamento de 100 µg/mL. Os resultados estão demonstrados em média e erro padrão, utilizando-se como calibrador o grupo controle negativo (0 µg/mL), com valor igual a 1. Diferenças significativas entre os grupos são indicados por *para P<0,05 e **para P<0,001.
Para o tratamento de 200 µg/mL, também foi observada menor abundância de transcritos (P<0,05) da maioria dos genes de reposta ao estresse (HSP27, WNT5a, HSBP1) e os dois relacionadas àe apoptose (BCL-2, BAX), sendo o HSP70.1A o único que não apresentou diferenças significativas (P>0,05) em relação controle negativo (Figura 3).
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Figura 3. Abundância relativa dos transcritos para o tratamento 200 µg/mL. Os resultados estão demonstrados em média e erro padrão, utilizando-se como calibrador o grupo controle negativo (0 µg/mL), com valor igual a 1. Diferenças significativas entre os grupos são indicados por **para P<0,001.
A partir das análises das curvas de dissociação dos genes avaliados, não foram observados picos referentes a dímeros de primers ou produtos inespecíficos da PCR. Além desta análise, a partir da técnica de eletroforese em gel de agarose (1,5%) houve a confirmação da presença e tamanho dos produtos, sendo possível realizar a validação dos resultados. Todos os transcritos dos genes estudados foram identificados e apresentaram o tamanho esperado.
Pelo fato de a maior parte dos genes de estresse aqui avaliados ter se apresentado
down regulated nas condições a que as células foram submetidas, o extrato etanólico da
planta Azadirachta indica pode ter proporcionado alterações na expressão dos mesmos. Isto pode também estar relacionado a vias de inibição dos transcritos ou a degradação dos mesmos.
Entretanto, além destes fatores, a subregulação, neste caso, pode também ter sofrido influência de outras vias. Estudos revelaram que uma das características que distinguem células quiescentes de não-quiescentes, são a falta de ciclina D e expressão da ciclina E, a cromatina altamente condensada e menor quantidade de ribossomos que, por sua vez, implicam em uma diminuição de mRNAs e proteínas, quando comparados á homólogos (LARSSON et al., 1986). Portanto, este fator pode ter relação com a baixa expressão dos genes avaliados nos fibroblastos expostos ao extrato etanólico de
Azadirachta indica, que se encontravam em quiescência, quando comparados ao grupo
controle, onde as células estavam em condições de proliferação.
Conclusões
A busca por novos métodos que sejam eficientes em sincronizar o ciclo de células somáticas e que não produzam efeitos tóxicos às células, tem se tornado cada vez mais importante, pois o sucesso da técnica de Transferência Nuclear com Célula Somática depende, em grande parte, da fase em que o núcleo doador se encontra.
As análises dos resultados de expressão dos genes avaliados pelo presente trabalho indicam que, possivelmente, nas concentrações administradas, o extrato etanólico de Azadirachta indica provoca alterações na expressão de determinados genes, sendo necessários outros estudos para determinar o real efeito citotóxico deste extrato e a viabilidade das células após a exposição ao mesmo.