Renata da Costa Barros Silva1, Lorena Evangelista Fernandes2, Camila Branda dos Reis2,
Ana Luiza de Moura Carmo2, Ludmila de Souza da Caputo Valente3, Mayara Souza Breder
Valente3, Junior César Fernandes4, Marlice Teixeira Ribeiro4, Jailton da Costa Carneiro4,
Cláudio Gallupo Diniz5, Marcelo Henrique Otenio4
1Parte da dissertação de mestrado da primeira autora, financiada pela Capes
2Graduanda em Ciências Biológicas do Centro de Ensino Superior de Juiz de Fora- CES/JF 3Graduanda em Farmácia da Faculdade de Ciências Médicas e da Saúde de Juiz de Fora -
Suprema
4Embrapa Gado de Leite
5Universidade Federal de Juiz de Fora
Resumo: Ruminantes são animais capazes de utilizar a fibra dos vegetais como alimento
devido à atuação de microrganismos presentes em seu trato digestivo. A prospecção por bactérias da microbiota ruminal com potencial capacidade de degradação de celulose e xilana tem importância no desenvolvimento de biocombustíveis de segunda geração. Foram realizadas coletas de conteúdo ruminal de vacas secas fistuladas para posterior isolamento de bactérias e avaliação quanto a sua pureza, motilidade, tolerância ao oxigênio e perfil enzimático. Foram obtidos 66 isolados, dos quais 23 foram cocos Gram positivos, 26 cocobacilos Gram positivos, oito bacilos Gram negativos e nove Gram positivos. O resultado do teste respiratório indicou que 16 foram anaeróbios estritos e 14 apresentaram motilidade positiva. Os zimogramas mostraram que dos isolados 14 eram celulolíticos e 65 xilanolíticos. A maioria dos isolados apresentou atividade enzimática para celulase, xilanase ou para ambas, indicando serem potenciais fontes de degradação de biomassa, com possível aplicabilidade biotecnológica.
Palavras–chave: biocombustível, biotecnologia, celulose, xilana, ruminante.
Abstract: The ruminants are animals capable of using the vegetable fiber as food due to
role the microorganisms play in their digestive tract. The prospection for rumen microrganisms with potential cellulose and xylan degradation habilities is of great importance, helping the development of second generation biofuels. Ruminal content was collected from fistulated dry cows for later bacteria isolation and evaluation regarding purity, motility, tolerance to oxygen and enzymatic profile. During this research 66 isolates were obtained, from which 23 were Gram positive cocci, 26 Gram positive coccobacilli, eight Gram negative rods and nine Gram positive. The respiratory test results indicated that 16 were strict anaerobes and 14 were motile. The zymmograms indicated that 14 were cellulolytics and 65 were xylanolytic. Most of the isolates presented enzymatic activity for cellulose, xylanase or both, indicating a source of biomass degradation, with possible biotechnological applicability.
Keywords: biofuel, biotechnology, cellulose, ruminant, xylan.
Introdução
Os vegetais possuem uma variedade de polissacarídeos estruturais ou de armazenamento. A celulose representa a maioria desses polissacarídeos, sendo uma das fontes naturais renováveis mais abundantes na natureza (SCHWARZ, 2001). A utilização desse polissacarídeo na indústria de bioenergia representa importante passo para o desenvolvimento sustentável. Para sua conversão em álcool etílico, os materiais
lignocelulósicos são biodegradados pela ação de enzimas extracelulares produzidas por determinados microrganismos e, portanto, o desenvolvimentos de técnicas e processos biotecnológicos que otimizem essa conversão é relevante para a indústria.
A presença dos microrganismos no sistema digestório dos ruminantes possibilita que esses animais utilizem a parece celular dos alimentos volumosos e o nitrogênio não proteico em sua nutrição. Haja vista que grande parte da biomassa vegetal ser constituída principalmente de lignina, celulose e hemicelulose a utilização efetiva desses compostos está diretamente relacionada ao desenvolvimento de metodologias que permitam a hidrólise e solibilização de tais compostos (XIMENES et al., 2003).
A degradação da celulose e da xilana em ruminantes alimentados com dietas baseadas majoritariamente em vegetais lignocelulósicos é feita com o auxílio de microrganismos presentes em seu trato digestivo, que são capazes de hidrolisar a fibra vegetal para obter os açúcares presentes na biomassa. O isolamento de microrganismos com potencial celulolítico e/ou xilanolítico tem como principal potencial biotecnológico a produção de etanol de segunda geração.
O objetivo deste trabalho foi prospectar microrganismos com potencial celulolítico e xilanolítico oriundos do rúmen de bovinos alimentados com dietas ricas em fibra vegetal.
Material e Métodos
No estudo foram utilizadas vacas secas fistuladas no rúmem. A manutenção dos animais foi realizada no Campo Experimental José Henrique Bruschi (Coronel Pacheco – MG) de propriedade da Embrapa Gado de Leite, em diferentes dietas à base de cana de açúcar com suplementação de 1 kg de concentrado com 22% de proteína bruta, silagem de milho acrescida de glicerina e pastagem (Brachiaria decubens) sem suplementação.
As coletas de conteúdo ruminal foram realizadas semanalmente de forma manual e armazenadas em garrafas térmicas para posterior transporte para o Laboratório de Microbiologia do Rúmen da Embrapa Gado de Leite, localizado em Juiz de Fora, MG.
O cultivo dos microrganismos foi realizado de acordo com a metodologia desenvolvida por Hungate (1966). Para o isolamento, o líquido ruminal foi diluído até 10-4
e inoculado em meio completo. Após período de 24 horas, o meio foi diluído até 10-10 e
inoculado em rolltubes. Foram selecionadas colônias, que foram transferidas para meio completo e avaliadas quanto à motilidade (meio SIM), pureza, teste respiratório (tolerância a oxigênio/câmara anaeróbica) e coloração de Gram. O potencial em degradar carboximetilcelulose (CMC) e xilana, foi avaliado aplicando-se zimogramas (TEATHER & WOOD, 1981). Neste método utilizou-se o meio NapI 50 mM, pH 7 + CMC 0,5% (1 g de CMC; 3 g de Agar; qsp 200 mL de NaPI 50 mM em pH 7; 0,1 mL de MgCl2 1 M e 0,1 mL
de CaCl2 1 M) para a detecção da atividade celulolítica. Nas placas com meio já
solidificado foram perfurados orifícios para inoculação das amostras (extrato e sobrenadante), obtidos da cultura pura e do controle positivo para a degradação de carboximetilcelulose, após centrifugação a 14 000 x g/15min. Em cada orifício foram colocados 0,1mL do sobrenadante da cultura pura (teste) e do controle positivo. As placas foram incubadas a 30ºC por 20 horas. Após incubação as placas foram lavadas com água destilada, coradas com vermelho congo a 0,1% por 10 minutos e lavadas, novamente, com NaCl 1M para revelação de halo. Foram realizadas fotos em transluminador de luz UV. Para a atividade xilanolítica utilizou-se o mesmo meio e procedimento, porém substituindo-se a carboximetilcelulose por xilana 1% (TEATHER & WOOD, 1981).
Uma vez caracterizados, os isolados foram acondicionados em freezer -20 ºC para caracterização molecular e posterior inclusão na coleção de microrganismos da Embrapa.
Resultados e Discussão
No total foram obtidos 66 isolados, sendo destes 23 cocos Gram positivos, 26 cocobacilos Gram positivos, oito bacilos Gram negativos e nove bacilos Gram positivos. Esse resultado está de acordo com Wilson et al. (1955), que relataram haver predominância de cocos e bacilos Gram positivos na microbiota ruminal. O teste de
motilidade revelou que apenas 14 dos 66 isolados eram móveis e no teste respiratório observou-se que 16 eram anaeróbios estritos.
Os zimogramas demonstraram que 14 isolados eram celulolíticos e 65 xilanolíticos. A xilana e a celulose são os dois polímeros de carboidratos mais abundantes na biomassa lignocelulósica e sua degradação é de grande interesse para o tratamento de dejetos, a produção de biocombustíveis, a digestão no rúmen e a indústria de papel (MACKENZIE et al., 1987). No entanto, a utilização desses compostos tem como barreira o alto custo de produção dessas enzimas, o que torna necessário a redução de custos ou o melhoramento de sua atividade de forma a tornar o processo mais eficiente e acessível. Assim este estudo contribui substancialmente para mitigar os desafios enfrentados na produção de derivados de fibra vegetal
Conclusões
O experimento realizado mostra que a maioria dos isolados apresentou atividade enzimática para celulase, xilanase ou para ambas.
Os resultados obtidos nesse trabalho são de grande importância, uma vez que representam um possível ganho tecnológico e econômico no processo de obtenção, caracterização e posterior produção industrial de xilanases e celulases
A caracterização molecular, próxima etapa desde trabalho, é ferramenta importante para a identificação das espécies isoladas, de forma a consolidar os resultados aqui obtidos.
Agradecimentos
À Capes, à Fapemig e à Embrapa pelo suporte financeiro e apoio a este trabalho.
Literatura citada
HUNGATE, R. E. 1966. The Rumen and its Microbes. Académie Press, New York and
London. 9-90.
.
MACKENZIE R. C.; BILOUS D.; SCHNEIDER H.; JOHNSON K. G. 1987. Induction of Cellulolytic and Xylanolytic Enzyme Systems in Streptomyces. Enzyme, 53: 2835-2839 SCHWARZ, W. H. 2001. The cellulosome and celulose degradation by anaerobic bactéria.
Applied Microbiology and Biotechnology. 56: 634–649.
TEATHER, R. M.; WOOD, P. J. 1981. Use of Congo Red-Polysaccharide Interactions in Enumeration and Characterization of Cellulolytic Bacteria from the Bovine Rumen. Applied
and Environmental Microbiology, 43: 4.
WILSON, M. K.; BRIGGS, C. A. E. 1955. The Normal Flora of the Bovine Rumen II: Quantitative Bacteriological Studies. Journal of Applied Microbiology. 18: 294-306. XIMENES, E. A.; FELIX, C. R. 2003. O sistema celulolítico de microrganismos anaeróbios: uma mini-revisão sobre o celulossoma. Universitas Ciências da Saúde. 1: 335-341.