Os dominios globulares de cadeias polipeptidicas pesadas e leves interagem numa estrutura quaternária, formando dominios funcionais que permitem que a molécula de ligue

especificamente ao antigénio e, ao mesmo tempo, realizar um numero de funções biológicas efectoras.

Enrolamento Imunoglobulina

Análise cuidadosas das sequências de aminoácidos das cadeias pesadas e leves das imunoglobulinas mostraram que ambas as cadeias contêm várias unidades homólogas com cerca de 110 residuos de aminoácidos. Dentro de cada unidade, denominadas dominios, uma ponte dissulfito intracadeia forma um loop com cerca de 60 aminoácidos:

 As cadeias leves contêm um dominio variável (VL) e um dominio constante (CL);

 As cadeias pesadas contêm um dominio variável (VH) e três ou quatro dominios constantes (CH1,

Análises de cristalografia revelaram que os dominios imunoglobulina são enrolados numa estrutura compacta caracteristica designada enrolamento imunoglobulina:

 Esta estrutura consiste numa “sandwich” de duas folhas-β pragueadas, cada uma contendo cadeias-β antiparalelas de aminoácidos, que são ligadas por loops de vários comprimentos;

 As duas folhas-β numa estrutura deste tipo são estabilizadas por interacções hidrofóbicas entre elas e pela ponte dissulfito.

Apesar de dominios variáveis e constantes apresentarem estrutura semelhante, existem diferenças subtis entre elas. O dominio V é ligeiramente mais longo que o dominio C e contem um par extra de cadeias-β na estrutura das folhas-β, tal como uma seuquênica loop extra que conecta este par de cadeias-β.

A estrutura básica deste enrolamento imunoglobulina contribui para:

 A estrutura quaternária das imunoglobulinas facilitando interacções não-covalentes entre dominios atraves das faces das folhas-β. Interacções formam ligações entre dominios idênticos (e.g., CH2/CH2, CH3/CH3 e CH4/CH4) e entre dominios não idênticos (e.g., VL/VH e CH1/CL);

 Comprimentos e sequências de aminoácidos variáveis que formam loops ligando as cadeias-β. Algumas sequências de loops dos dominios VL e VH contêm aminoácidos variáveis e constituem

Dominios da Região Variável e Ligação ao Antigénio

Comparações detalhadas das sequências de aminoácidos de um grande numero de dominios VL e VH

revelaram que a variação sequencial está concentrada em poucas regiões discretas desses dominios. O padrão desta variação é melhor resumido medindo quatitativamente a variabilidade em cada ponto da cadeia polipeptidica. a variabilidade é definida como:

A determinação quantitativa da variabilidade dos dominios VL e VH mostram que variações máximas são

observadas em sequências que correspondem aos loops que ligam as cadeias-β. Essas regiões foram designadas originalmente regiões de hipervariabilidade em reconhecimento da sua elevada variabilidade. No entanto, estas regiões formam os locais de ligação ao antigénio e, por isso, são agora designadas regiões determinantes da complementariedade (CDRs). As regiões restantes dos dominios VL e VH exibem menor variação, sendo designados regiões framework (FRs):

 A grande gama de especificidades exibida pelos anticorpos é devida a variações no comprimento e na sequência de aminoácodps das seis CDRs em cada fragmento Fab;

 A região framework actua como scaffold que suporta os seis loops;

 A estrutura tri-dimensional das regiões framework de virtualmente todos os anticorpos analizados pode ser sobreposta, no entanto, os loops hipervariáveis apresentam diferentes orientações em diferentes anticorpos.

Difracção de raios-X de vários complexos anticorpo-antigénio mostrou que vários CDRs fazem contacto com o antigénio, podendo até fazer os seis. Em geral, parece que mais residuos dos CDRs da cadeia pesada contactam com o antigénio, do que residuos dos CDRs da cadeia leve. Assim, o dominio VH

normalmente contribui mais para a ligação ao antigénio do que o dominio VL.

A forma do local de ligação ao antigénio formada por qualquer combinação de CDRs varia dramaticamente entre anticorpos. Isto deve-se a diferenças de tamanho dos antigénios, que levarão a diferentes tipos de interacções:

1. Contactos entre um grande numero de proteinas antigénicas globulares grandes e anticorpos ocorrem numa grande superficie, sendo que, na área de contacto, depressões ou saliências no antigénio complementam saliências ou depressões no anticorpo. Nesta área, cerca de 15-22 aminoácidos no anticorpo contactam o mesmo numero de residuos na proteina antigénica;

2. Anticorpos que ligam pequenos antigénios, como haptenos, fazem-no em bolsas mais pequenas, em que o antigénio é encaixado.

As interacções não covalentes que formam a base da ligação antigénio-anticorpos incluem:

 Pontes de hidrogénio;

 Ligações iónicas;

 Interacções hidrofóbicas;

 Interacções de van der Waals.

Como estas interacções são individualmente fracas (comparado com uma ligação covalente), um grande numero delas é necessário para formar uma ligação antigénio-anticorpo forte. Ainda, como cada uma destas interacções não covalentes opera a distâncias muito curtas, geralmente cerca de 1x10-7 mm, uma interacção antigénio-anticorpo forte depende de uma aproximação e de um encaixe entre o anticorpo e o antigénio. Isto depende assim de uma elevada complementariedade entre antigénio e anticorpo, um requerimento que caracteriza as interacções antigénio-anticorpo.

Com o avanço da resolução da estrutura dos fragmentos Fab, começou a tornar-se claro que em alguns casos a ligação do antigénio induz alterações conformacionais no antigénio, no anticorpo, ou em ambos, dependendo do anticorpo e do antigénio. Esta alteração de conformação resulta no encaixe fechado entre o epitopo e o local de ligação ao antigénio no anticorpo, necessário para as interacções. Assim, em adição à variabilidade no comprimento e na composição em aminoácidos dos loops CDR, a habilidade destes loops alterarem de conformação significativamente no local de ligação permite que os anitcorpos assumam uma forma mais complementar para os epitopos. No entanto, estas alterações não necessitam de ser limitadas ao anticorpo, o que também pode inactivar os antigénios (no caso de moléculas com actividade biológica).

Dominios da Região Constante

Os dominios da região constante das imunoglobulinas participam em vária funções biológicas que são determinadas pela sequência de aminoácidos de de cada dominio. Existem vérios dominios com diferentes funções, sendo de importância mais elevada:

 Dominios CH1 e CL;

 Região dobradiça;

 Dominios da região Fc.

Os dominios CH1 e CL existem em todos os tipos de cadeia

pesadas e servem para:

 Extender os braços Fab da molécula de anticorpo, facilitando assim a interacção com o anticropo e aumentando a rotação máxima dos braços Fab;

 Ajudam a manter os dominios V e V juntos através de

 Contribuem para a diversidade de anticorpos permitindo uma maior associação aleatória entre dominios VH e VL do que aquela que ocorreria se esta associação fosse feita apenas pelas

interacções VH/VL.

Estas considerações para estes dois dominios apresentam implicações importantes na montagem de diversos anticorpos pois rearranjos aleatórios de genes imunoglobulina geram sequência unicas VH e VL

que depois geram locais de ligação ao antigénio unicos, e a presença destes dois dominios aumenta o numero de interacções VH/VL estáveis que são possiveis, contribuindo para a diversidade geral de

moléculas de anticorpos que podem ser expressos num animal.

As cadeias pesadas α, γ e δ contêm uma sequência péptidica extendida entre os dominios CH1 e CH2 que

apresenta homologia com outros dominios. Esta região, é designada região dobradiça (hinge region):

 É rica em residuos de prolina e é flexivel, fornecendo flexibilidade às IgA, IgD e IgG;

 Como resultado, os dois braços Fab são capazes de assumir vários ângulos um com o outro quando o antigénio está ligado, podendo assim um anticorpo ligar um antigénio cujos epitopos estejam mais ou menos separados;

 Varia em comprimento (10-60 residuos) entre diferentes isotipos de imunoglobulinas, sendo que as maiores diferenças entre as subclasses IgG estão concentradas nesta região.

Os aminoácidos mais comuns nas regiões dobradiça são:

 Prolina – fornecem a esta região uma conformação polipeptidica extendida, tornando-a particularmente vulnerável à clivagem por enzima proteoliticas. É aqui que o anticorpo é clivado pela papaina ou pepsina;

 Cisteina – formam ponte dissufito inter-cadeias que mantêm as duas cadeias pesadas juntas. O numero de pontes dissulfito na região dobradiça varia consideravelmente entre diferentes classes de anticorpos e entre espécies.

Por outro lado, as cadeias pesadas das imunoglobulinas do tipo μ e ε não apresentam uma região hinge, mas contêm um dominio adicional de 110 aminoácidos (CH2/CH2) que apresenta caracteristicas

semelhantes à região dobradiça.

Como visto anteriormente, as cadeias pesadas nas IgA, IgD e IgG contêm três dominios na região constante e uma região dobradiça enquanto as cadeias pesada na IgE e IgM contêm quatro regiões constantes e nenhuma região dobradiça. Os dominios correspondentes dos dois grupos são:

IgA, IgD, IgG IgE, IgM

CH1/CH1 CH1/CH1

Região dobradiça CH2/CH2

CH2/CH2 CH3/CH3

CH3/CH3 CH4/CH4

Cristalografia raios-X revelou que dos dois dominios CH2 das IgA, IgD e IgG, e os dominios CH3 das IgE e

IgM, são separados por cadeias laterais oligossacrideo, sendo estes os dois dominios globulares mais acessiveis que os outros em meio aquoso. Isto contribui para a actividade biológica destes dominios na activação de components do complemento pelas IgG e IgM.

O dominio C-terminal é designado CH3/CH3 nas IgA, IgD e IgG e CH4/CH4 nas IgE e IgM, e este está

relacionado com a possibilidade de podermos dividir a imunoglobulinas em dois tipos, sendo diferentes em ambos os tipos:

1. Imunoglobulinas secretadas (sIg) – apresentam uma sequência de aminoácidos hidrofilica de