Os principais eventos durante a maturação dos linfócitos B são:
Rearranjo e expressão de genes Ig numa ordem precisa;
Selecção e proliferação das células B em desenvolvimento no checkpoint do pré-receptor de antigénios;
Selecção do reportório de células B maduras.
Os linfócitos B, antes do nascimento, desenvolvem-se a partir de precursores no figado fetal, saco vitelino e baço e, depois do nascimento, são gerados maioritariamente na medula óssea. A maioria dos linfócitos B têm origem em progenitores na medula óssea adultos que são inicialmente Ig negativos, se desenvolvem em células B imaturas que expressam moléculas IgM membranares e, depois, deixam a medula óssea para maturarem no baço, onde as células B da linhagem folicular expressam IgM e IgD na sua superficie. É no baço que as células imaturas adquirem a habilidade de recircularem e povoar todos os órgãos linfáticos periféricos. As células B foliculares recirculantes residem nos foliculos linfáticos e têm a habilidade de reconhecer antigénios estranhos e de responder a estes sendo que o desenvolvimento de uma célula B madura a partir de um progenitor linfóide dura cerca de 2 a 3 dias.
Células Progenitoras na Medula Óssea
O desenvolvimento das células B inicia-se enquanto as células estaminais se diferenciam nas primeiras células da linhagem das células B, as células B progenitoras (célula pró-B) que expressam uma tirosina fosfatase transmembranar designada CD45R. As células pró-B proliferam na medula óssea, preenchendo os espaços extravasculares entre grandes sinusoides no eixo do osso. A proliferação e diferenciação das células pró-B em células B precursoras (células pré-B) requer o micro-ambiente fornecido pelas células do estroma da medula óssea.
As células do estroma têm dois papeis importantes:
Interagem directamente com células pró-B e pré-B;
Secretam várias citocinas, notavelmente IL-7, que suportam o processo de desenvolvimento. Na primeira etapa de desenvolvimento, as células pró-B requerem contacto directo com células do estroma na medula óssea. Esta interacção é mediada por várias moléculas de adesão celular, incluindo VLA-4 na células pró-B e o seu ligando, VCAM-1, na célula do estroma:
Após o contacto inicial ser feito, um receptor na célula pró-B designado c-Kit interage com uma molécula na superficie da célula do estroma conhecida como factor stem-cell (SCF);
Esta interacção activa a c-Kit, que é uma tirosina cinase, e a célula pró-B começa a dividir-se e a diferenciar-se em células pré-B e começa expressando um receptor para IL-7.
A IL-7 secretada pelas células do estroma dirige o processo de maturação, eventualmente induzindo a regulação de moléculas de adesão nas células pré-B, de modo que as células em proliferação são capazes de se desligar das células do estroma. Neste ponto, as células pré-B não requerem mais contacto directo com células do estroma mas continuam a requerer IL-7 para o crescimento e a maturação.
Rearranjo de Genes Ig
A maturação das células B depende do rearranjo do DNA para imunoglobulinas nas células estaminais linfóides:
Primeiro ocorre na etapa das células pró-B rearranjo DH-JH dos genes de cadeia pesada;
De seguida, ocorre um arranjo VH-DHJH;
Se o primeiro arranjo não for produtivo, o arranjo VH-DH-JH continua no outro cromossoma.
Após a conclusão do rearranjo de cadeias pesada, a célula é classificada como uma célula pré-B e o desenvolvimento continuado de uma célula pré-B numa célula B imatura requer o rearranjo produtivo de genes de cadeia leve. Devido à exclusão alélica, apenas um isotipo de cadeia leve é expresso na membrana da célula B. A realização de um rearranjo de cadeia leve produtivo compremete a, agora, célula B imatura a uma especificidade antigénica particular determinada pela sequência VDJ da cadeia pesada e a sequência VJ da cadeia leve:
As enzimas recombinase RAG-1 e RAG-2, que são necessárias para o rearranjo de genes de cadeia pesada e de cadeia leve, são expressas durante as etapas das células pró-B e pré-B;
A enzima TdT, que cataliza a inserção de nucleótidos N nas junções codificantes DH-JH e VH-DHJH,
está activa durante a etapa de células pró-B. como a expressão de TdT é desligada quando ocorre o rearranjo de cadeias leves, nucleótidos N não são normalmente encontrados nas junções codificantes VL-JL.
A fase da medula óssea do desenvolvimento das células B culmina na produção de células B imaturas que expressam IgM membranar. Nesta etapa de desenvolvimento, a célula B não está completamente funcional e antigénios induzem morte ou anergia (falta de resposta) em vez de divisão e diferenciação. A maturação completa é sinalizada pela co-expressão de IgD e IgM na membrana. Esta progressão envolve uma alteração no processamento do RNA do transcrito primário de cadeia pesada que permite a produção de dois mRNAs, um que codifica a forma membranar da cadeia μ e outro que codifica a forma membranar da cadeia δ.
Apesar da IgD ser uma marcador superficial das céluls B naive maduras, a sua função ainda não é conhecida. Contudo, visto que ratinhos knockout para Igδ apresentam numeros normais de céluls B completamente funcionais, a IgD não é essencial nem para o desenvolvimento das células B nem para a resposta a antigénios.
Receptor da Célula Pré-B
Na célula pré-B, a cadeia μ membranar encontra-se associada com um cadeia leve substituta (surrogate light chain), um complexo constituido por duas proteinas, que se associam para formar uma estrutura semelhante a uma cadeia leve:
Uma sequência V-like desiganada Vpré-B;
Uma sequência C-like designada λ5.
O complexo membranar da cadeia pesada μ com a cadeia leve substituta surge na célula pré-B associado com o heterodimero Igα/Igβ para formar o receptor da célula pré-B e apenas células pré-B que são capazes de expressar cadeias pesadas μ membranares em associação com cadeias leves substitutas são capazes de proceder na via de maturação. Existe também a especulação de que o receptor das células pré-B reconhecem ligandos ainda não identificados nas membrana das células do estroma, transmitindo um sinal à células pré-B que previne o rearranjo VH-DHJH do outro alelo da cadeia
pesada, levando assim a exclusão alélica.
Após o establecimento de um receptor da célula pré-B efectivo, cada célula pré-B sofre multiplas divisões celulares, produzindo 32 a 64 descendentes. Cada uma das células produzidas deve assim rearranjar diferentes segmentos de genes de cadeia leve, aumentando assim a diversidade geral de reportório de anticorpos.
O papel critico do receptor da célula pré-B foi demosntrado com ratinhos knockout nos quais o gene que codifica a proteina λ5 do receptor foi inactivado. O desenvolvimento das células B nesses ratinhos ficou bloqueada na etapa pré-B, o que sugere que:
Um sinal gerado atraves do receptor é necessário para que as células pré-B procedam para a etapa das células B imaturas.
Factores de Transcrição e Defeitos no Desenvolvimento das Células B
Vários factores de transcrição diferentes actuam no desenvolvimento das células hematopoiéticas e cerca de uma duzia deles parecem ter papeis no desenvolvimentos das células B, sendo que quatro são particularmente importantes:
E2A;
Early B-cell factor (EBF);
B-cell specific antivator protein (BSAP);
Sox-4.
Ratinhos que não apresentam E2A não expressam RAG-1, são incapazes de fazer rearranjo DHJH e
E2A e EBF apresentam papeis importantes no desenvolvimento inical das células B e podem também apresentam papeis importantes nas etapas inicias de entrada na linhagem cas células B.
A supressão do gene Pax-5, cujo produto é o factor de transcrição BSAP, também resulta na retenção do desenvolvimento das células B numa etapa inical:
Locais de ligação de BSAP são encontrados nas regiões promotoras de vários genes especificos das células B, incluindo Vpre-B e λ5, num numero de regiões de switch de Ig e no enhancer da cadeia pesada de Ig;
BSAP tem um papel importante nas etapas iniciais do desenvolvimento das células B;
É também expresso no sistema nervoso central e a sua ausência resulta em defeitos severos no desenvolvimento cerebral.
No entanto, apesar de não se conhecer o local exacto de acção de Sox-4, este afecta as etapas iniciais da activação das células B. E também é preciso ter em conta que, apesar de todos estes factores de transcrição afectarem o desenvolvimento em etapas inicias, alguns deles estão activos em etapas mais tardias.
Falhas semelhantes no desenvolvimento dos linfócitos são também observadas quando existe uma mutação no gene que codifica a subunidade catalitica da proteina cinase dependente do DNA (DNA- PKCS), designada mutação da imunodeficiência severa combinada (SCID).
Enquanto a actividade recombinase da SCID é capaz de marcar sequências de reconhecimento consensus (sinais) nas extremidades dos elementos codificantes V, D e J e induzir quebras de cadeia dupla nas fronteiras sinais/codificantes, ela não é capaz de mediar a formação de junções codificantes a uma frequência significante;
Esta incapacidade reflecte um defeito geral no reparo de quebras de DNA de cadeia dupla e a morte dos linfócitos por incapacidade de reparar quebras cromossómicas resultantes da tentativa de recombinação.
E o mesmo se observa também em casos de mutação de proteinas envolvidas na via de sinalização do receptor da célula pró-B, como BLNK, e do receptor da célula pré-B, como Btk, o que impede a passagem destas células à etapa seguinte e provoca uma imunodeficiência
Marcadores de Superficie
A progressão a partir da célula progenitora até à célula B madura é tipificada por um padrão alterado de marcadores de superficie:
CD45R - na etapa pró-B, as células não apresentam as cadeias leves ou pesadas dos anticorpos mas expressam esta forma de proteina tirosina fosfatase encontrada nos leucócitos, e durante todas as outras etapas;
Igα/Igβ – expressas na etapa pró-B e também encontradas em associação com as formas membranares dos anticorpos em etapas mais tardias do desenvolvimento das células B;
CD19, CD43 e CD24 – parte do co-receptor da célula B, leucossialina e uma molécula conhecida como heatstable antigen (HSA), respectivamente. Expressas nas células pró-B também;
C-Kit – expressa apenas na superficie das células pró-B e é um receptor para o ligando promotor do crescimento presente nas células do estroma;
CD25 – expressa nas células pré-B em substituição de CD43 e constitui o receptor para IL-2. Enquanto as células progridem da etapa pró-B para a pré-B, expressam muitos dos marcadores que estava presentes durante a etapa pró-B. Contudo, deixam de expressar c-Kit e CD43 e começam a expressar CD25.
A apresentação do receptor da célula pré-B (pré-BCR) é uma caracteristica saliente da etapa pré-B. Depois do rearranjo da cadeia leve, imunoglobulinas membranares que contêm tanto as cadeias leves como pesadas surgem, e as células, agora classificadas como células B imaturas, perdem o pré-BCR e não expressam mais CD25.
Existem anticorpos monoclonais que são capazes de reconhecer todos estes marcadores antigénicos, tornado possivel reconhecer e isolar as várias etapas do desenvolvimento das células B pelas técnicas de imunohistoquimica e citometria de fluxo.
Subgrupos de Células B
Subgrupos de células B distintos desenvolvem-se a partir de diferentes progenitores:
As células B B-1 diferem da maior parte dos linfócitos e desenvolvem-se de um modo unico:
Expressam a molécula CD5 (Ly-1);
No adulto, grandes numeros destas células são encontrados como uma auto “repopulação” nas cavidades pleural e peritoneal;
Desenvolvem-se mais cedo que as células B convencionais e expressam um reportório relativamente limitado de genes V e exibem muito menor diversidade juncional do que as células B convencionais (a TdT não é expressa no figado fetal);
Secretam espontaneamente anticorpos IgM que normalmente reagem com polissacarideos e lipidos microbianos. Estes anticorpos são por vezes designados anticorpos naturais porque estão presentes em individuos sem imunização, apesar de ser possivel que a flora microbiana do tracto gastrointestinal seja a fonte de antigénios que estimula a sua produção;
Fornecem uma fonte de produção rápida de anticorpos contra micróbios em locais particulares, como o perineurio;
Na pleura, podem diferenciar-se em cerca de metade das células secretoras de IgA na lâmina própria;
São análogas às células T γδ pois ambas possuem reportórios de receptores de antigénios limitados e estão ambas envolvidas na resposta a antigénios microbianos comummente encontrados nas primeiras etapas das respostas imunes.
As células B B-2 passam rapidamente através de duas etapas transicionais e podem desenvolver-se em dois grupos distintos de células:
Células B da zona marginal – localizam-se primariamente nas vizinhanças dos seios marginais no baço e são de algum modo semelhantes às células B-1 pois apresentam diversidade limitada e são capazes de responder a antigénios polissacarideos e produzir anticorpos naturais. Expressam IgM e o marcador de superficie CD21. Respondem muito rapidamente a micróbios sanguineos e diferenciam-se em células plasmáticas secretoras de IgM de curta vida. Apesar de geralmente mediarem respostas imunes independentes de células T contra patogénios circulantes, estas células parecem também ser capazes de mediar algumas respostas imunes
dependentes de células T. Surgem por diferenciação da célula B madura progenitora na presença de Notch2;
Células B foliculares – constituem a maior parte das células B maduras e co-expressam cadeias pesadas μ e δ em associação com cadeias leves κ ou λ e, assim, produzem tanto IgM e IgD membranares. Ambas as classes de Ig utilizam o mesmo exão VDJ e associam-se com cadeias pesadas idênticas e, assim, exibem a mesma especificidade de antigénio. Deste modo, splicing alternativo permite que uma célula B produza simultaneamente mRNAs e proteinas maduras de dois isotipos diferentes de cadeia pesada. O mecanismo pelo qual uma célula começa a expressar ambos os isotipos ainda é desconhecido mas a co-expressam de IgM e IgD é alcançada pela aquisição de competência funcional e de habilidade para recircular, e esta é a razão pela qual células B foliculares são também designadas células B maduras.
A correlação entre a expressão de IgD e a aquisição de competência funcional sugere que a IgD é o receptor activador essencial das células B maduras. No entanto, não existe evidência para uma diferença funcional entre IgM e IgD membranares.
As células B foliculares são na maior parte das vezes designadas células B recirculantes, visto que migram de um orgão linfático para o seguinte, residindo em nichos especializados conhecidos como
foliculos de células B. Nestes nichos, estas células B são mantidas, em parte, por sinais transmitidos por um ligando trópico do familia de citocinas tumor necrosis factor (TNF) designado de BAFF ou BlyS.
Células B maduras, naive, respondem a antigénios e, a não ser que as células encontrem antigénios que reconhecem com alta afinidade e a que respondem, elas morrem em dias.
Resumidamente, as principais caracteristicas dos diferentes subgrupos de células B são:
Propriedade/Actividade Células B-1 Células B-2 convencionais Células B-2 da zona marginal
Quando produzido pela
primeira vez Feto Após nascimento Após nascimento
Regiões N nas junções VDJ Algumas Extensivas Sim
Reportório da região V Restrito Diverso Parcialmente restrito
Localização primária Cavidade corporais
(peritoneal, pleural)
Órgãos linfáticos
secundários Baço
Modo de renovação Auto-renovação Repostas na medula óssea Grande longevidade
Produção de imunoglobulinas espontânea
Alta Baixa Baixa
Isotipos secretados IgM >> IgG IgG > IgM IgM > IgG
Resposta a carboidratos
antigénicos Sim Talvez Sim
Resposta a proteinas
antigénicas Talves Sim Sim
Necessidade de ajuda das
células T Não Sim Por vezes
Hipermutação somática Baixa-nenhuma Alta ?
Desenvolvimento de
memória Baixa-nenhuma Sim ?
Selecção do Reportório de Células B Maduras
O reportório de células B maduras é positivamente seleccionado da pool de células B imaturas. A
CD8+ restritas a MHC do próprio de uma pool de células T imaturas não seleccionadas. Não existe uma restrição comparável para o reconhecimento de antigénios pelas células B. No entanto, a selecção positiva parece ser um fenómeno gerado para identificar linfócitos que completaram o seu programa de rearranjo com sucesso e possivelmente facilitando a produção de subgrupos de células T ou B:
Acredita-se que apenas células B que expressam moléculas Ig membranares funcionais recebem sinais de subrevivência constitutivos derivados do BCR;
Antigénios do próprio parecem influenciar a força do sinal do BCR e, assim, a escolha subsequente da linhagem de células B periféricas durante a maturação de células B.
Células B imaturas de reconhecem antigénios do próprio com grande avidez podem ser induzidas a alterar as suas especificidades por um processo designado de editing do receptor:
Neste processo, o reconhecimento de antigénios leva à reactivação de genes Rag, a eventos adicionais de recombinação V-J de cadeia leve, e à produção de novas cadeias Ig leves, permitindo que a célula expresse diferentes receptores de cálula B que não são auto-reactivos;
Este processo ocorre normalmente em genes κ de cadeia leve, sendo que exões VJκ que
codificam os dominios variáveis das cadeias leves auto-reactivas são eliminados e substiuidos por novos exões exões VJκ ou por rearranjos da cadeia leve λ;
O novo exão exões VJκ deverá ser gerado pelo rearranjo de um gene V a montante do gene V
original que produziu uma cadeia leve auto-reactiva com um segmento J a jusante do segmento J originalmente rearranjado.
Células B imaturas que expressam receptores de alta afinidade para antigénios próprios e que encontram esses antigénios na medula óssea devem morrer ou não maturar se não forem editados. A eliminação é geralmente designada selecção negativa e é parcialmente responsável pela manutenção da tolerância das células B a antigénios próprios que estão presentes na medula óssea:
Os antigénios que medeiam a selecção negativa – normalmente antigénios próprios abundantes ou multivalentes (e.g., membranares) – fornecem sinais fortes a linfócitos B imaturos que expressam IgM que parecem ser especificos para esses antigénios próprios;
O reconhecimento do antigénio pela a morte por apoptose das células B imaturas, quando o editing falha.
Assim que é feita a transição para a etapa das células B maduras+IgD+IgM, o reconhecimento de antigénios leva a proliferação e diferenciação, e não a apoptose oi editing do receptor. Como resultado, as células B maduras que reconhecem antigénios com grande afinidade nos tecidos linfóides periféricos são activadas e esse processo leva a respostas imunes humorais.
Podemos ter quatro destinos diferentes para as células B imaturas na medula óssea dependendo da avidez e do tipo de ligando que ligam:
Molécula própria multivalente – quando as células B imaturas expressam receptores que reconhecem ligandos multivalentes, como moléculas membranares próprias, elas são eliminadas de reportório (delecção clonal). Estas células B ou sofrem editing do receptor, de modo que a auto-reactividade do receptor é eliminada, ou sofrem morte celulars programada ou apoptose (selecção negativa);
Molécula própria soluvel – células B imaturas que se ligam a antigénios próprios soluveis capazes de fazer cross-link com o receptor da célula B são mantidos num estado de não resposta ao antigénio (anérgico) e carregam muito poucas IgM membranares. Estas células migram para a periferia onde expressam IgD mas se mantêm anérgicas. Se em competição com outras células B na periferia, elas são rapidamente perdidas;
Molécula própria que não permite cross-link e com baixa afinidade – células B imaturas que ligam estes ligandos não recebem qualquer sinal como resultado da sua interacção e maturam normalmente para expressar tanto IgM como IgD na superficie da célula. Tais células são potencialmente auto-reactivas e são clonalmente ignorantes já que o seu ligando está presente mas não é capaz de as activar;
Reacção não própria – células B imaturas que não encontram antigénio maturam normalmente, migram da medula óssea para os tecidos linfóides periféricos onde se tornam células B recirculantes maduras carregadoras de IgM e IgD na sua superficie.