A maturação dos linfócitos T a partir dos seus progenitores envolve:
Rearranjo e expressão sequencial dos genes TCR;
Proliferação celular;
Selecção induzida pelo antigénio;
Aquisição de capacidades funcionais.
Em vários aspectos, este mecanismo é semelhante à maturação das células B. Contudo, a maturação das células T apresenta algumas caracteristicas unicas que reflectem a especificidade dos linfócitos T para péptidos antigénicos associados a MHC próprio e a necessidade de um microambiente especializados para a selecção de células com esta especificidade.
Papel do Timo na Maturação das Células T
O timo é o principal local de maturação das células T. Esta funcção do timo é demonstrada por deficiências imunológicas associadas com a ausência de timo:
Se o timo é removido de ratinhos neo-natais, estes animais falham no desenvolvimento de células T maduras;
A ausência congenital de timo, como ocorre no sindrome de DiGeorge em humanos ou em estirpes de ratinhos nus, é caracterizada por baixo numero de células T maduras em circulação e nos tecidos linfóides periféricos e deficiência severa na imunidade mediada por células T.
O timo regride com a idade e é virtualmente indectável em humanos após a puberdade, mas alguma maturação de células T continua através da vida adulta, como indicada pela reconctituição com sucesso do sistema imune em adultos que recebem transplantes de medula óssea. É possivel que o resto do timo regredido seja adequado para alguma maturação de células T. Como as células T de memória apresentam uma longa longevidade (talvez mais de 20 anos em humanos) e se acumulam com a idade, a necessidade de gerar novas células T diminui enquanto o individuo envelhece.
Os linfócitos T têm origem em precursores que surgem no figado fetal e na medula óssea adulta e que se fixam no timo:
Em ratinhos, os linfócitos imaturos são primeiro detectados no timo no dia 11º de uma gestação normal de 21 dias, o que corresponde a mais ou menos 7-8 semanas de gestação;
Células T em desenvolvimento no timo são designadas
timócitos e os timócitos mais imaturos não expressam
TCR nem co-receptores CD4 ou CD8, são encontrados nos seios subcapsulares e na região cortical do timo;
A partir daqui, os timócitos migram para e através do córtex, onde a maior parte dos eventos da maturação subsequente ocorrem;
É no córtex que os timócitos primeiro expressam TCRs γδ e αβ, e as células T αβ se começam a maturar em células T CD4+ restritas a MHC classe II ou CD8+ restritas a MHC classe I;
Enquanto estes timócitos entram nas etapas finais da maturação, eles migram para o córtex da medula e saem do timo através da circulação.
O ambiente timico fornece estimulos que são necessários para a proliferação e maturação dos timócitos. A maior parte destes estimulos têm origem em células timicas para além das células T em maturação. Estas incluem células epiteliais timicas e macrófagos e células dendriticas derivadas da medula óssea:
No córtex, as células epiteliais formam uma rede de processos citoplasmáticos longos, à volta dos quais os timócitos devem passar para alcançar a medula. Também existem células epiteliais na medula;
Células dendriticas derivadas da medula óssea estão presentes na fronteira corticomedular e na medula e macrófagos estão presentes principalmente na medula;
A migração dos timócitos através deste arranjo anatómico permite interacções fisicas entre timócitos e estas outras células, que são necessárias para a maturação dos linfócitos.
Dois tipos de moléculas produzidas pelas células não-linfóides timicas são importantes para a maturação das células T:
Moléculas MHC classe I e classe II – expressas nas células epiteliais e nas células dendriticas no timo. As interacções dos timócitos em maturação com estas moléculas MHC no timo são essenciais para a selecção do reportório de células T maduras;
Citocinas e quimiocinas – secretadas pelas células do estroma do timo, incluindo as células epiteliais, e estimulam a proliferação de células T imaturas e orquestram a transição do córtex para a medula da linhagem de timócitos αβ, respectivamente. A citocina melhor definida é a IL- 7, que é um critico factor de crescimento linfopoietico, e quimiocinas como CCL21 e CCL19, que são reconhecidas pelo receptor de quimiocinas CCR7 nos timócitos, medeiam o movimento guiado dos timócitos pelo timo.
As taxas de proliferação e morte celular por apoptose são extremamente elevadas nos timócitos corticais. Um único precursor dá origem a muita progenia, e 95% dessas células morre por apoptose antes de alcançar a medula. A morte celular deve-se à combinação de rearranjos não produtivos do gene de cadeia β do TCR, à não selecção positiva por moléculas MHC no timo e a selecção negativa induzida por antigénios próprios. Para além disso, timócitos corticis são sensiveis a radiação a glucocorticóides, sendo que, in vivo, altas doses de corticóides induzem morte apoptótica dos timócitos corticais.
Inicio da Maturação das Células T no Timo
Durante a maturação das células T, existe uma ordem precisa na qual genes TCR são rearranjados e o TCR e os co-receptores CD4 e CD8 são expressos:
No ratinho, a expressão superficial de TCRγδ ocorre primeiro, 3 a 4 dias após as células precursoras chegarem ao timo, e o TCRαβ é expresso 2 ou 3 dias depois;
No timo humano fetal, a expressão do TCRγδ começa às 9 semanas de gestação, seguida pela expressão do TCRαβ às 10 semanas.
Os timócitos corticais, que são recém-chegados apartir da medula óssea, contêm genes TCR na sua configuração da liha germinativa e não expressam TCR, cadeias CD3 ou ξ, ou CD$ ou CD8. Estas células são designada timócitos duplo-negativos e esta etapa de maturação é conhecida como a etapa das células pró-T:
A maioria dos timócitos duplo-negativos (>90%) dará origem a células T que expressam TCRαβ e restritas a MHC com CD4 ou CD8;
Proteinas Rag-1 e Rag-2 são expressas primeiro nesta etapa e são necessárias para o rearranjo de genes do TCR.
Os rearranjos Dβ-Jβ no locus da cadeia β do TCR ocorre primeiro, e envolve a combinação do segmento
de gene Dβ1 com um dos seis segmentos Jβ1 ou combinação do segmento Dβ2 com um dos seis
segmentos Jβ2. Os rearranjos Vβ-DJβ ocorrem na transição entre a etapa das células pró-T e a
subsequente etapa das células pré-T durante o desenvolvimento das células T αβ. As sequências de DNA entre os segmentos que sofrem rearranjo, incluindo genes D, J e possivelmente Cβ1 (se os
segmentos Dβ2 e Jβ2 forem usados), são eliminados durante estes processos de rearranjo formando no
final uma cadeia β funcional.
Receptor da Célula Pré-T
Se um rearranjo produtivo do genes da cadeia β do TCR ocorrer numa determinada célula pré-T, a proteina da cadeia β é expressa na superficie em associação com uma proteina invariante designada pré-Tα e com proteinas CD3 e ξ para formar um receptor da célula pré-T. O pré-TCR medeia a selecção das células pré-T em desenvolvimento que produtivamente rearranjaram a cadeia β do TCR, pois cerca de dois terços das células T em desenvolvimento adiciona ou remove bases nas junções de rearranjo que de um modo não multiplo de três e, assim, esses rearranjos falham na codificação da proteina β do TCR.
Sinais a partir do pré-TCR medeiam a sobrevivência das células pré-T e contribuem para a expansão proliferativa durante o desenvolvimento das células T;
Os sinais do pré-TCR também iniciam a recombinação do locus da cadeia α do TCR e dirige a transição a etapa duplo-negativa para a etapa duplo-positiva do desenvolvimento dos timócitos, levando também à expressão de CD4 e CD8;
Estes sinais também inibem o rearranjo seguinte de locus de cadeia β do TCR limitando a acessibilidade dos outros alelos à maquinaria de recombinação. Isto resulta numa exclusão alélica da cadeia β.
Tal como nas células pré-B, não se sabe qual, se existir, ligando o pré-TCR reconhece. A sinalização do pré-TCR, tal como a sinalização do pré-BCR, poderá ser iniciada de um modo dependente de ligando e é também dependente da montagem do complexo pré-TCR. Esta sinalização é mediada por um numero de cinases citosólicas e proteinas adaptadoras que são conhecidas por também estarem envolvidas na sinalização do TCR.
A função essencial dos pré-TCR na maturação das células T foi demonstrada por numerosos estudos com ratinhos mutados geneticamente:
Em ratinhos deficientes em Rag-1 ou Rag-2, os timócitos não são capazes de rearranjar os genes das cadeias α e β e falham na maturação após a etapa duplo-negativa. Se um gene β rearranjda funcionalmente é introduzido nestes ratinhos deficientes como um transgene, a cadeia β expressa associa-se com pré-Tα para formar um pré-TCR, e a maturação procegue para a etapa duplo-positiva. Um transgene de cadeia α sozinho não liberta a maturação porque a cadeia β é necessária para a formação do pré-TCR;
Ratinhos KO que não apresentam qualquer componente do complexo pré-TCR (i.e., a cadeia β TCR, pré-Tα, CD3, ξ ou Lck – tirosina cinase envolvida na sinalização do TCR e do pré-TCR) mostram um bloqueio na maturação das células T na etapa duplo-negativa.
Produção de Timócitos Efectores e Expressão do TCR
Na etapa seguinte da maturação das células T, os timócitos expressam CD4 e CD8 e são designados timócitos duplo-positivos. Células T duplo-positivas também induzem a expressão do receptor CCR7 de quimiocinas, que guia estas células do córtex até à medula, onde quimiocinas especificas para este receptor são secretadas por células do estroma. A expressão de CD4 e CD8 é essencial para os eventos de selecção subsequentes:
O rearranjo dos genes da cadeia α do TCR e a expressão de heterodimeros TCR αβ ocorre na população CD4+CD8+ duplo-positiva, mesmo antes ou durante a migração dos timócitos do córtex para a medula;
Uma segunda onda de expressão de genes Rag no final da etapa pré-T promove a recombinação do gene α do TCR;
Assim que o rearranjo da cadeia α começa, este procegue por 3 ou 4 dias (em ratinho) até a expressão de Rag-1 e Rag-2 ser desligada por sinais do TCR αβ durante a selecção positiva.
Os passos envolvidos no rearranjo de genes de cadeia α do TCR são bastante semelhantes aos que ocorrem durante o rearranjo dos genes de cadeia β do TCR. No entanto, como não existem segmentos D no locus TCR α, o rearranjo consiste apenas na junção de segmentos V e J:
O grande numero de segmentos Jα permite multiplas tentativas de junção V-J produtiva em cada
cromossoma, aumentando assim a probabilidade de um TCR αβ funcional ser produzido;
Em contraste, com o locus da cadeia β do TCR, onde a produção da proteina e formação do pré- TCR suprime rearranjos seguintes, existe muito pouca, se nenhuma, exclusão alélica no locus da cadeia α.
Assim, rearranjos produtivos de cadeias α do TCR poderão ocorrer em ambos os cromossoma e, se isto acontecer, a célula T irá expressar duas cadeias α. De facto, cerca de 30% das células T periféricas expressam dois TCRs diferentes, com diferentes cadeias α mas com a mesma cadeia β. A consequência funcional desta expressão dual de receptores é ainda desconhecida mas como apenas um é necessário para a selecção positiva, será possivel que o segundo TCR não apresente qualquer afinidade para MHC próprio e, assim, não terá função.
A regulação transcripcional do gene de cadeia α ocorre de um modo bastante semelhante à da cadeia β:
Existem promotores a 5’ de cada gene Vα que apresentam baixo nivel de actividade e são
responsáveis por alto nivel de transcrição de células T especificas quando em proximidade com um enhancer localizado 3’ do gene Cα;
A incapacidade de rearranjar com sucesso a cadeia α do TCR em cada cromossoma leva a uma falha na selecção positiva e estes timócitos morrem por apoptose pois não fizeram um rearranjo produtivo.
A expressão do gene TCR α cedo na etapa duplo-positiva leva à formação do TCRαβ completo, que é expresso na superficie celular em associação com proteinas CD3 e ξ. A expressão coordenada das proteinas CD3 e ξ e a montagem de compexos TCR intactos são necessárias para a expressão na superficie. O rearranjo de genes TCRα resulta na delecção do locus δ que se encontra entre segmentos V. Como resultado, esta célula não é capaz de se tornar uma célula T γδ.
A expressão de genes Rag e recombinação seguinte de genes TCR cessa depois desta etapa de maturação e as primeiras células a expressar TCRs encontram-se no córtex tímico, sendo esta expressão baixa comparada com células T maduras. Por virtude da sua expressão de complexos TCR completos, as células duplo-positivas são capazes de responder a antigénio e são sujeitas a selecção positiva e negativa.
Células que sofrem esta selecção com sucesso progridem para se maturarem em células CD4+ ou CD8+, que são designadas timócitos single-positivos. Assim, as etapas da maturação das células T podem ser distinguidas pela expressão de CD4 e CD8. Esta maturação fenotipica é acompanhada pela maturação funcional:
Células CD4+ - adquirem a habilidade de produzir citocinas em resposta à estimulação de antigénio subsequente e expressar moléculas efectoras (como ligando CD40) que “ajudam” os
Células CD8+ - tornam-se capazes de produzir moléculas que matam outras células.
Timócitos single-positivos maduros entram na medula timica e depois deixam o timo para povoarem tecidos linfáticos periféricos.
Marcadores de Superficie
Apesar dos co-receptores CD4 e CD8 não serem expressos nas fases inicias da etapa duplo-negativo, o programa de diferenciação progride e é marcado por alterações na expressão de moléculas de superficie como c-Kit, CD44 e CD25:
A população de timócitos inicial apresenta c-Kit, o receptor de factores de crescimento para as células estaminais, e CD44, uma molécula de adesão envolvida no povoamento do timo. CD25, a cadeia β do receptor de IL-2, também surge cedo na etapa duplo-negativa. Durante este periodo, as células estão a proliferar mas os genes TCR continuam não rearranjados;
A célula pára de expressar c-Kit, reduz marcadamente a expressão de CD44, e liga a expressão de genes Rag-1 e Rag e começa a rearranjar genes TCR;
A partir daqui, a célula expressa TCR ou pré-TCR, tal como proteinas acessórias do complexo TCR e também co-receptores.