Estudos de sequenciação de DNA revelaram a presença de sequências sinal de recombinação (RSS) unicas nas extremidades de cada segmento de genes V, D e J da linha germinativa:
Uma RSS está localizada a 3’ de cada segmento de gene V, a 5’ de cada segmento de gene J e dos dois lados de cada segmento de gene D;
Estas sequências funcionam como sinais para o processo de recombinação de rearranja os genes;
Cada RSS contem um heptamero palindrómico conservado e um nonamero rico em AT conservado separado por uma sequência interveniente com 12 ou 23 pares de bases.
As sequências intervenientes de 12- e 23-bp correspondem, respectivamente, a uma ou duas voltas da hélice de DNA. Por esta razão, as sequências são deignadas sequência sinal de recombinação one-turn (one-turn RSS) e sequência sinal de recombinação two-turn (two-turn RSS).
A RSS Vκ apresenta um espaço one-turn e a RSS Jκ apresenta um espaço two-turn;
No DNA de cadeia leve λ, esta ordem é revertida, isto é, a RSS Vλ apresenta um espaço two-turn
e a RSS Jλ apresenta um espaço one-turn;
No DNA de cadeia pesada, as RSS dos segmentos de genes VH e JH apresentam espaços two-turn
enquanto cada lado dos segmentos de genes DH apresentam espaço one-turn.
A lei one-turn/two-turn diz que RSS com um espaço one-turn se conseguem ligar apenas a sequências com um espaço two-turn. Esta lei assegura, por exemplo, que um segmento VL se liga apenas a um
segmento JL a não a outro segmento VL e também que os segmentos VH, DH e JH se combinam na ordem
apropriada e que outros segmentos os mesmo tipo não se ligam um ao outro.
A recombinação V-(D)-J, que ocorre nas junções entre as RSSs e as sequência codificantes, é catalizada por enzimas colectivamente designadas recombinase V(D)J. Estas enzimas são os unicos produtos de genes especificos das células linfóides que estão envolvido no rearranjo V-(D)-J:
RAG-1 e RAG-2 – produtos de genes activantes da recombinação;
TdT – terminal deoxynucleotidyl transferase.
A recombinação de segmentos de genes da região variável consite nos seguintes passos, catalizados por um sistema de enzimas recombinases:
1. Reconhecimento de RSSs por enzimas recombinase, seguida de sinapse na qual duas sequências sinal e as sequências codificantes adjacentes (segmentos de genes) são aproximadas;
2. Clivagem de uma cadeia de DNA pelas RAG-1 e RAG-2 nas junções das RSSs com as sequências codificantes;
3. Uma reacção catalizada pelas RAG-1 e RAG-2 na qual o grupo –OH 3’ livre no corte na cadeia de DNA ataca a ligação fosfodiester que liga a cadeia oposta à RSS, simultaneamente produzindo uma estrutura hairpin na extremidade de corte da sequência codificante e a quebra da cadeia dupla na RSS;
4. Corte do hairpin para gerar locais de adição de
nucleótidos de região P, seguida de primming de
alguns nucleótidos a parte da sequência codificante por uma endonuclease de cadeia simples;
5. Adição de cerca de 15 nucleótidos, designados
nucleótidos de região N, nas extermidades de corte
das sequências codificantes de segmentos V, D e J das cadeias pesadas por uma enzima TdT;
6. Reparo e ligação para juntar as sequencias codificantes e para juntar as sequências sinal, catalizada por enzimas doublestrand break repair normais (DSBR), que são expressas em todas as células somáticas. A recombinação resulta na na formação de uma encaixe codificante, entre as duas sequências codificantes, e um encaixe sinal, entre as RSSs. A orientação transcripcional dos segmentos de genes a serem ligados determina o destino do encaixe sinal e dos DNA interveniente:
Quando os dois segmentos de genes estão na mesma orientação transcripcional, a combinação resulta na delecção do encaixe sinal e do DNA interveniente como um produto circular;
Menos frequentemente, se os dosi genes tiverem orientações opostas, a combinação resulta por inversão do DNA, resultando na retenção de ambos os encaixes no cromossoma.
No locus κ humano, cerca de metade dos segmentos de genes Vκ estão invertidos relativamente aos Jκ e
a sua combinação é feita assim por inversão.
A TdT é um membro dos factores non-homologous end joining (NHEJ) que são expressos em qualquer célula e estão envolvidos no reparo do DNA. Estas adicionam nucleótidos ao DNA e fecham espaços entre dois pedaços de DNA. Constituem um complexo enzimático cujas enzimas são:
DNA-PKs; Ku-70 e Ku-86; Artemis; Pol μ; DNA-ligase IV; XRCC4.
Qualquer deficiência nestas enzimas, NHEJ e Rags, leva a doenças autoimunes pois os linfócitos ficam incapazes de produzir anticorpos.
Junção Flexivel dos Segmentos
Uma das caracteristicas notáveis da recombinação de segmentos de genes é a diversidade de junções codificantes que são formadas entre dois quaisquer segmentos. Apesar das quebras na cadeia dupla de DNA para inicai os rearranjos V-(D)-J serem introduzidos precisamente nas junções das RSSs e das sequências codificantes, a ligação subsequente das sequências codificantes é imprecisa. A diversidade juncional nas ligações V-J e V-D-J são geradas por um numero de mecanismos:
Variação no corte do hairpin para gerar nucleótidos P;
Variações no aparamento das sequências codificantes;
Variações na adição de nucleótidos N;
Flexibilidade na junção de sequências codificantes – a introdução de aleatoriedade no processo de junção ajuda a gerar diversidade de anticorpos contribuindo para a hipervariabilidade do local de ligação ao antigénio.
A junção flexivel pode gerar hipervariebilidade por alterar o open reading frame. No entanto, podemos ter duas consequências:
Rearranjo não produtivo - os segmentos de genes podem ser ligados fora de fase, de modo que o open reading frame não é preservado e a unidade VJ ou VDJ resultante provavelmente pode conter condões stop, de modo que interrompe a tradução;
Rearranjo produtivo – os segmentos de genes podem ser ligados em fase, de modo que o open reading frame é preservado e a unidade VJ ou VDJ pode ser traduzida inteiramente, levando a um anticorpo completo.
Se um alelo rearranja não produtivamente, uma célula B pode ser capaz de rearranjar o outro alelo produtivamente. Se um gene de cadeia leve e um de cadeia pesada rearranjados em fase não forem produzidosm a célula B morre por apoptose. Estima-se que apenas um 1/3 das combinações VL-JL e 1/3
das combinações VH-DH-JH são produtivas. Como resultado, menos de 1/9 (11%) das células pré-B na
Exclusão Alélica
As células B, como todas as células somáticas, são diplóides e contêm os cromossomas maternos e os paternos. No entanto, apesar de uma célula B ser diplóide, ela expressa os genes rearranjados de apenas um cromossoma. O processo pelo qual isto ocorre, designado exclusão alélica, assegura que células B funcionais nunca contêm mais de uma unidade VHDHJH e VLJL:
É essencial para a especificidade antigénica da célula B, porque a expressão de ambos os alelos levaria a multiespecificidade das células B;
Este fenómeno sugere que assim que um rearranjo VH-DH-
JH produtivo e um rearranjo VL-JL produtivo ocorrem, a
maquinaria de recombinação é desligada, de modo que os genes de cadeia leve e pesada em cromossomas homólogos não são expressos.
O modelo de exclusão alélica diz que assim que um rearranjo produtivo é alcançado, a sua proteina codificada é expressa e a presença desta proteina actua como sinal para prevenir rearranjos de genes futuros. De acordo com este modelo:
1. A presença de de cadeia pesada μ sinaliza na célula B de modo a que esta desligue o rearranjo de outros alelos de cadeia pesada e inicie o rearranjo de genes de cadeia leve;
2. Se um rearranjo κ produtivo ocorrer, as cadeias leves κ são produzidas e emparelham com as cadeias pesadas de modo a formar uma molécula de anticorpo completa. A presença deste anticorpo desliga os rearranjos seguintes das cadeias leves;
3. Se um rearranjo κ é não produtivo para ambos os alelos κ , rearranjos dos genes de cadeias λ começam. Se nenhum rearranjo dos alelos λ for produtivo, a célula B para a maturação e morre por apoptose.