Sete modos de diversificação de anticorpos foram já identificados em ratinho e humanos:
Segmentos de multiplos genes da linha germinativa;
Junção combinatória V-(D)-J;
Flexibilidade juncional;
Adição de nucleótidos região P (adição P);
Adição de nucleótidos região N (adição N);
Hipermutação somática;
Associação combinatória de cadeias leves e pesadas.
Apesar da contribuição exacta de cada uma destas vias de diversificação para a diversidade total do anticorpo não ser conhecida, cada uma destas contribui significativamente para o imenso numero de anticorpos distintos que o sistema imune mamifero é capaz de gerar.
Segmentos de Multiplos Genes da Linha Germinativa
Um inventório dos segmentos de genes V, D e J funcionais no DNA da linha germinativa de um humano revela 51 VH, 25 D, 6 JH, 40 Vκ, 5 Jκ, 31 Vλ e 4 Jλ segmentos de genes. Em adição a estes segmentos
funcionais existem ainda vários pseudogenes e devemos ter em emnte que estes valores foram obtidos de apenas um individuo, podendo variar entre diferentes individuos. Em ratinho, apesar dos valores serem conhecidos com menos precisão, parecem existir cerca de 135 VH, 13 D, 4 JH, 85 Vκ, 4 Jκ, 3 Vλ e 3 Jλ
segmentos de genes:
Apesar do numero de genes encontrados na linha germinativa de humanos e ratinhos ser menor ao esperado pelo modelo da linha germinativa, os multiplos segmentos de genes V, D e J da linha germinativa contribuem claramente para a diversidade de locais de ligação ao antig+enio nos anticorpos.
Junção Combinatória V-(D)-J
A contribuição dos multiplos segmentos de genes da liha germinativa para a diversidade dos anticorpos é magnificada pelo rearranjo aleatório desses segmentos nas células sométicas. É possivel calcular quanta diversidade pode ser alcançada pelo rearranjo de genes:
A habilidade de qualquer um dos segmentos de genes VH combinar com qualquer um dos
segmentos DH e com qualquer um dos segmentos JH fornece uma quantidade consideravel de
diversidade de cadeias pesadas;
De modo semelhante, a combinação de qualquer um dos um dos segmentos de genes VL
combinar com qualquer um dos segmentos JH fornece uma quantidade consideráve de cadeias
leves;
A combinação de cadeias leves com cadeias pesadas aumenta a diversidade um modo colossal. No entanto, é importante ter em conta que estes são calculos minimos de diversidade potencial. A flexibilidade juncional, as adições de nucleótidos P e N e, especialmente, a hipermutação somática contribuem bastante para a diversidade dos anticorpos, e que estes valores elevados não significam que a um determinado momento da sua vida um individuo tenha este numero de variedades de anticorpos, mas sim o reportório total que podemos encontrar em vários individuos.
Multiplos segmentos da linha
germinativa Cadeia pesada
Cadeias leves κ λ Em Humano V 51 40 30 D 27 0 0 J 6 5 4 Junção combinatoria V-D-J e V-J
(numero possivel de combinações) 51 x 27 x 6 = 8262 40 x 5 = 200 30 x 4 = 120 Associações combinatórias possiveis
das cadeias leves e pesadas 8262 x (200 + 120) = 2,64 x 10
6 Em Ratinho V 134 85 2 D 13 0 0 J 4 4 3 Junção combinatoria V-D-J e V-J
(numero possivel de combinações) 134 x 13 x 4 = 6968 85 x 4 = 340 2 x 3 = 6 Associações combinatórias possiveis
das cadeias leves e pesadas 6968 x (340 + 6) = 2,41 x 10
6
Flexibilidade Juncional
A enorme diversidade gerada por meio das combinações dos segmentos V, D e J é de seguida aumentada por um fenómeno designado flexibilidade juncional:
A recombinação envolve a ligação RSSs para formar um encaixe sinal e a ligação de sequências codificantes para formar o encaixe codificante;
Apesar das RSSs serem sempre ligadas de modo preciso, a ligação das sequências codificantes é normalmente imprecisa.
A flexibilidade juncional leva a vários rearranjos não produtivos mas também gera combinações produtivas que codificam aminoácidos alterantivos em cada junção codificante, aumentanto a diversidade de anticorpos:
A variação na sequência de aminoácidos gerada pela flexibilidade juncional nas junções codificantes caem na terceira região hipervariável (CDR3) no DNA da cadeia leve a da cadeia pesada;
Visto que a CDR3 tem a maior contribuição para a ligação ao antigénio pela molécula de anticorpo, as alterações de aminoácidos gerados pela flexibilidade juncional são importantes na geração da diversidade dos anticorpos.
Adição P
Após a primeira clivagem de uma unica cadeia de DNA na junção de um segmento de genes de região variável e a RSS ligada, os nucleótidos na terminação da sequência codificante formam uma estrutura em hairpin. Este hairpin é depois clivado por uma endonuclease:
A segunda clivagem por vezes ocorre a uma posição que deixa uma pequena cadeia simples na terminação da seuqência codificante;
A adição subsequente de nucleótidos complementares a esta cadeia (adição P) por enzimas de reparação gera uma sequência palindrómica na junção codificante e, assim, esses nucleótidos são designados nucleótidos P;
Variações na posição na qual o hairpin é cortado leva, assim, a variações na sequência da junção codificante.
Adição N
As junções codificantes da região variável em genes rearranjados de cadeias pesadas contêm pequenas sequências de aminoácidos que não são codificadas pelos segmentos de genes V, D ou J na linha germinativa. Esses aminoácidos são codificados por nucleótidos adicionados durante o processo de junção de D a J e de V a DJ por uma reacção catalizada pela TdT, processo esse designado adição N:
Cerca de 15 nucleótidos podem ser adicionados às junções DH-JH e VH-DH-JH;
A diversidade adicional gerada pela adição de nucleótidos N é bastante elevada porque as regiões N parecem consistir em sequências completamente aleatórias;
Como esta diversidade ocorre nas junções V-D-J codificantes, está localizada no CDR3 dos genes de cadeia pesada.
Hipermutação Somática
Toda a diversidade de anticorpos descrita até agora tem origem em mecanismos que operam durante a formação de regiões variáveis especificas por rearranjo de genes. Diversidade de anticorpos adicional é gerana em unidade de genes de regiões variáveis rearranjados por um processo designado hipermutação somática. Como resultado, nucleótidos individuais nas unidades VJ ou VDJ são substituidos por outros alternativos, potencialmente alterando a especificidade das imunoglobulinas codificadas:
A hipermutação somática rearranja regiões V localizadas numa sequência de DNA contendo cerca de 1500 nucleótidos, o que inclui o total dos segmentos VJ ou VDJ;
A hipermutação somática a uma frequência de 10-3 pares de base por geração. Esta taxa é bastante superior à taxa de mutação espontânea (10-8) de outros genes;
Visto que o comprimento combinado dos genes da região variável das cadeias pesada e leve é cerca de 6000 bp, a hipermutação somética introduzirá pelo menos uma mutação a cada duas divisões celulares no par de genes VH e VL que codificam um anticorpo.
O mecanismo de hipermutação somática ainda não foi determinado, mas envolve a enzima AID (activation induced cytidine deaminase). A maior parte das mutações são substituições em vez de delecções ou inserções. A hipermutação somática introduz essas substituições de um modo quase completamente aleatório:
Certos motivos de nucleótidos e sequências palindrómicas dentro dos VH e VL podem ser
especialmente susceptiveis a hipermutação somática;
Hipermutações somáticas ocorrem por todo o segmento VJ ou VDJ, mas em células B maduras estão agrupadas nos CDRs das sequências VH e VL, onde influenciam a afinidade geral para o
antigénio e entrarão na selecção de células B com maior afinidade para um determinado antigénio durante a maturação.
A hipermutação somática aumenta progressivamente ao longo da primeira, segunda e terceira imunizações aumentando a afinidade do anticorpo para um antigénio. Isto permite que células B especificas para um antigénio sejam seleccionadas e que a diversidade de anticorpos seja produzida mesmo depois dos genes serem rearranjados e de uma célula B se tornar especifica para um antigénio. Isto é, permite que células B alterem de especificidade ou aumentem a sua especificidade para um antigénio.
Associação Combinatória de Cadeias Leves e Pesadas
Em humanos, existe a potencialidade de gerar 8262 genes de cadeia pesada e 320 genes de cadeia leve como resultado dos rearranjos de genes das regiões variáveis. Assumindo que qualquer um dos genes de cadeia leve ou pesada possiveis podem ocorrer aleatoriamente na mesma célula, o numero potencial de combinações das cadeias leves com as cadeias pesadas possiveis é 2.644.240:
Este numero é provavelmente superior à quantidade de diversidade combinatoria actualmente gerada num individuo, porque não será provável que todas as VH e VL se emparelhem umas com
as outras;
Para alem disso, o processo de recombinação não é completamente aleatório. Nem todos os segmentos VH, D e VL são usados com a mesma frequência. Alguns são usados mais
frequentemente, outros apenas ocasionalmente, e ainda outros quase nunca.
Apesar do numero de diferentes locais de anticorpos diferentes que o sistema imune é capaz de gerar ser dificil de calcular com precisão, sabe-se que este é elevado. Devido ao grande numero de novas sequências criadas por flexibilidade juncional, adição P e adição N serem no terceiro CDR, elas estão posicionadas para influenciar a estrutura do local de ligação do anticorpo. Em adição a estas fontes de diversidade de anticorpos, o fenomeno de hipermutação somática contribui de enormemente para o reportório de anticorpos depois da estimulação pelo antigénio.
No entanto, estes processos ocorrem mais commumente para ratinhos e humanos, sendo que outros animais, como as aves, usam outros mecanismos e mais frquentemente a mutação somética.