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ARTIGO
ORIGINAL
Nuclear
abnormalities
in
cells
from
nasal
epithelium:
a
promising
assay
to
evaluate
DNA
damage
related
to
air
pollution
in
infants
夽
,
夽夽
Michelle
Mergener
a,∗,
Cláudia
R.
Rhoden
be
Sérgio
L.
Amantéa
baUniversidadeFederaldeCiênciasdaSaúdedePortoAlegre(UFCSPA),PortoAlegre,RS,Brasil bUniversidadeFederaldoRioGrandedoSul(UFRGS),PortoAlegre,RS,Brasil
Recebidoem13dejaneirode2014;aceitoem3deabrilde2014
KEYWORDS
Micronucleiassay;
Nasalcells;
Environmental health; Infants; Toddlers
Abstract
Objectives: Thisstudyintendstoprovideaquick,easy,andinexpensivewaytoassessnuclear
abnormalitiessuchasmicronucleiandbudfrequencies;binucleated,karyorrhectic,karyolytic,
pycnotic,andcondensedchromatincellsinnasalscrapingsofinfants,whichareparticularly
important for conducting genotoxic studies related to the inhaledatmosphere in pediatric
populations.
Methods: Nasalswabsampleswerecollectedfrom40infantsunder12monthsofageusinga
smallcytobrush.2,000cellsfromeachinfantsamplewereanalyzedandclassifiedaccordingto
thefrequencyofnuclearabnormalities.
Results: Ratesofnuclearabnormalitiesfoundagreewithvaluesreportedinotherstudiesof
neonatesandchildren.Thisstudyfound0.13%ofcellswithmicronuclei;1.20%karyorrhexis;
0.03% pyknosis; 10.85%karyolysis; 1.11% condensed chromatin; 0.54binucleated cells;and
0.02%nuclearbud.Differenceswerenotobservedbetweengendersorenvironmentalpassive
smoking,norwasanyagecorrelationfound.
Conclusion: Theassayproposedhereissuitableforassessingthefrequencyofnuclear
abnor-malitiesfromnasalcellsininfants.
©2014SociedadeBrasileiradePediatria.PublishedbyElsevierEditoraLtda.Allrightsreserved.
DOIserefereaoartigo:http://dx.doi.org/10.1016/j.jped.2014.04.009
夽 Comocitaresteartigo:MergenerM,RhodenCR,AmantéaSL.Nuclearabnormalitiesincellsfromnasalepithelium:apromisingassayto
evaluateDNAdamagerelatedtoairpollutionininfants.JPediatr(RioJ).2014;90:632---6.
夽夽EstudovinculadoàUniversidadeFederaldeCiênciasdaSaúdedePortoAlegre(UFCSPA),PortoAlegre,RS,Brasil. ∗Autorparacorrespondência.
E-mail:michimerg@yahoo.com(M.Mergener).
PALAVRAS-CHAVE
Ensaiode
micronúcleos;
Célulasnasais;
Saúdeambiental;
Neonatos;
Crianc¸asdeum
atrêsanos
Anormalidadesnuclearesemcélulasdoepitélionasal:umatécnicapromissorapara avaliardanonoDNArelacionadoàpoluic¸ãoatmosféricaemneonatos
Resumo
Objetivos: Este estudo pretendeu fornecer uma forma rápida, fácil e barata de avaliar
anormalidades nucleares, como frequênciasde micronúcleose gêmea, células binucleadas,
cariorréticas,cariolíticas,picnóticas ecomcromatinacondensada, emesfregadosnasaisde
neonatos,oqueéparticularmenteimportanteparaarealizac¸ãodeestudosgenotóxicos
rela-cionadosaoarinaladonaspopulac¸õespediátricas.
Métodos: Foramcoletadasamostrasdeesfregac¸onasalde40neonatoscommenosde12meses
deidade,utilizandoumapequenaescovacitológica.Foramanalisadas2.000célulasdaamostra
decadaneonatoeclassificadasdeacordocomafrequênciadeanormalidadesnucleares.
Resultados: Astaxas deanormalidadesnuclearesencontradasnesteestudo sãocompatíveis
comos valores relatadosem outrosestudosde neonatose crianc¸as.Encontramos 0,13%de
células commicronúcleos,1,20%comcariorrexe, 0,03%compicnose, 10,85%comcariólise,
1,11%comcromatinacondensada,0,54comcélulasbinucleadase0,02%comcélulasnucleares
gêmeas.Nãoobservamosdiferenc¸asentreosgêneros,tabagismopassivoenenhumacorrelac¸ão
entreidades.
Conclusão: Oensaiopropostonesteestudoéadequadoparaavaliarafrequênciade
anormali-dadesnuclearesdecélulasnasaisemneonatos.
©2014SociedadeBrasileiradePediatria.PublicadoporElsevierEditoraLtda.Todososdireitos
reservados.
Introduc
¸ão
Oestudodosefeitosdoimpactoambientalsobreexposic¸ões
visa quantificar os agentes presentes no ambiente para
investigarseuefeitosobreaocorrênciadedoenc¸ascrônicas
em indivíduos expostose esclarecerosvários mecanismos
pelos quais esses processos ocorrem. Nesse sentido, tem
havidoumesforc¸ocada vezmaiorem todoo mundopara
determinar oimpactodos fatoresambientais,genéticose
deestilodevidasobreaestabilidadegenômica.
Tanto em adultos quanto em crianc¸as, os índices
deavaliac¸ãoquerefletemdanosnoDNA,comoapresenc¸ade
micronúcleos (MN), têmsemostrado umaferramenta útil
e podem monitorar suas variac¸ões em mudanc¸as
aciden-taiscadavezmaiores,relacionadasafatoresambientaise
de estilo de vida. É importante focar principalmente em
crianc¸as ouneonatos, porque eles podem ter uma maior
sensibilidade a agentes genotóxicos em comparac¸ão aos
adultos. Adicionalmente, danos genéticos em idades
pre-cocespodemafetaro risco,durante avida,deresultados
adversosàsaúde.Consequentemente,ométododeensaio
demicronúcleostemsidoamplamenteutilizadopara
estu-darosdanosgenéticosemcrianc¸asapósexposic¸õesdentro
do útero e pós-natais em uma variedade de ambientes
rurais e urbanos como resultado detabagismo maternoe
superexposic¸õesindustriaisoutecnológicasacidentais.1---3
Pormeiodeumlevantamentodaliteraturaatual, obser-vamosqueafrequênciadeanormalidadesnuclearesémuito baixa nonascimento. Contudo, em casos de exposic¸ão, o aumentoé muito maisacentuadoem comparac¸ãoa adul-tos.Issoconfirmaaideiadequehámaiorsensibilidadeentre ascrianc¸as expostas.Osestudosmostraramaumentos sig-nificativosnafrequênciadeMNedeoutrasanormalidades nuclearesemcasosdecrianc¸asexpostasàfumac¸adecigarro em ambientes fechados, residências próximas a depósitos de produtos químicos, água contaminada com arsênico e
metaispesados,alémdepoluentesindustriais.Apesardisso, aac¸ão em longoprazo dedeterminadas doenc¸as crônicas etratamentosfortes,comoaquimioterapia,aindanãofoi conceituada.
O usode MN como umamedida dedanos cromossômi-cosfoipropostopelaprimeiravezporCountrymaneHeddle (1976)4emlinfócitosdesangue,sendoométododeescolha
paraavaliac¸ãodagenotoxicidadeempopulac¸õeshumanas.5
Contudo,a maioria dos outrosinvestigadores estava inte-ressadanasanálisesdecélulasesfoliadasdamucosabucal ounasal para coletar dados para pesquisas de exposic¸ão ocupacional.6 Os autores sugeriram a adequac¸ão desses
lugares de coleta, porque os mesmos estão em contato diretocomagentesambientaisnocivoseacoletapodeser feitadeformanãoinvasiva,oqueéparticularmente impor-tanteao realizarestudosenvolvendo crianc¸as. Emcélulas esfoliadas, a presenc¸a de MN indica corpos citoplasmáti-cosextranuclearesassociadosaaberrac¸õescromossômicas. Estas são induzidas por uma variedade de substâncias, inclusivecompostoscarcinogênicospresentesnafumac¸ade cigarro.Ainduc¸ãodecélulascomMNporagentes cancerí-genosemutagênicoséumsinaldoefeitogenotóxicodessas substâncias.7
Por meio do ensaio de micronúcleos em células esfo-liadas também é possível avaliar algumas anormalidades nucleares,comorupturaouperdadematerialgenéticopela medic¸ão da presenc¸a de MB ou célulasnucleares gêmeas (tambémconhecidascomo‘‘ovosquebrados’’),defeitosde citocineserepresentados por células binucleadas e morte celular quando apresentando pouquíssimos núcleos (pic-nose)oucromatinacondensada, oumesmo perdatotalde seusmateriaisnucleares(chamadoscélulascariorréticase cariolíticas).8
anormalidadesnuclearesnoepitélionasal,especificamente emcrianc¸asouneonatos.Contudo,indivíduosnessasfaixas etáriasforamoalvo deváriosestudosavaliandodanosno DNAemcélulasbucaisesfoliadase/oulinfócitosdesangue periférico em situac¸ões específicas de exposic¸ão, como radiac¸ãoionizante9 ouqueima debiomassa,10 oucasosde
síndrome de Down.11 Outros utilizaram coleta de sangue
paraavaliarosdanosaoDNAemcrianc¸assaudáveis.12
Em um estudo recente, não foi observado aumento de anomalias que refletem dano cromossômico (micro-núcleos, células binucleadas, células nucleares gêmeas), porémforamencontradastaxassignificativamentemaiores deaberrac¸õesnuclearesqueindicamcitotoxicidade (carió-lise,cariorrexe, cromatinacondensada) nostrabalhadores que participaram desse estudo. Esses efeitos foram mais acentuadosnascélulasnasaisquenascélulasbucais.13
Atualmente, os poucos estudos existentes mostraram resultadosinconclusivossobreatoxicidadecitogenéticaem humanosdevido a diferentes níveis de exposic¸ão, fatores enganosos e diferenc¸as de protocolo dentre os laborató-rios.Assim,considerandoaimportânciadeavaliarosefeitos do ambiente sobre a saúde, focando principalmente na poluic¸ão do ar, com relac¸ão a crianc¸as pequenas,e tam-bémnanecessidadedepadronizar ummétodoviávelpara pesquisarapresenc¸adeanormalidadesnuclearesem célu-lasesfoliadas,esteestudopretendeuapresentarumaforma rápida,fácilebaratadeavaliaranormalidadesnuclearesem esfregac¸osnasaisdeneonatos.
Métodos
Após aprovac¸ão do Comitê de Ética (CEP/UFCSPA), foram
coletadasamostrasdeesfregac¸onasalde43neonatoscom
menosde12mesesdeidadeinternadosporoutrascondic¸ões
nãoafetandoasviasaéreas.Excluímoscrianc¸ascomdoenc¸as
associadassubjacentes, como doenc¸a cardíacacongênita,
imunodeficiência,doenc¸apulmonarcrônica,doenc¸as
neuro-musculares,síndromescitogenéticas,ouquenecessitaram
deventilac¸ãomecânica.
Foiaplicadoumquestionárioaospaisqueacompanharam
oneonatonomomentodacoletadaamostra.Asperguntas
foramdesenvolvidas combase no ‘‘Relatório sobrea
Epi-demiaGlobal de Tabagismo (Global Adult TobaccoSurvey
---GATS):QuestionáriocomPerguntasOpcionais’’,14 criado
pela Organizac¸ão Mundial de Saúde (OMS), validado em 2010,ecommudanc¸asrelacionadasàgravidezeexposic¸ão infantilàfumac¸adecigarro.
A ferramenta de escolha para coleta das amostras foi umapequenaescovacitológica,fabricadacomercialmente para práticas odontológicas. Esta foi utilizada especifica-mentedevidoàssuascerdasdenáilon(importanteparaque acélulaserompacomfacilidade)etamanhoadequadopara serinseridonas narinas dessas crianc¸as pequenas,e tam-bémparaencaixartotalmenteemummicrotubo.Acoleta decélulasfoifeitaporresidentesempediatria,sob super-visão de ummédico preceptor. As cerdas foraminseridas nas narinas dos neonatos até atingir a concha média, de modoqueascerdasvoltadasparaoseptonasaldobrassem easdooutroladoficassememcontatocomaasadonariz. Nessaposic¸ão, ascerdas foramgiradasna cavidadenasal, afimdeseobteramaiorquantidadepossíveldematerial
celulardoreferidoepitélio.Depoisdisso, asescovas cito-lógicasforamarmazenadasemmicrotuboscontendo1,0mL desorofisiológico(0,08NaCl)eadequadamente identifica-das.Osmateriaisforammantidosemrefrigerac¸ão(4◦C)por
umperíodomáximode12horas.
Nolaboratório, os microtubosforam centrifugados por 10 minutosa1.500 rotac¸õesporminuto (RPM),passando, a seguir, por três lavagens dos materiais com 1,5mL de soluc¸ão fixadora de Carnoy (metanol 3:1 ácido acético), mantendoomaterialsempresuspenso.Naúltimalavagem, a suspensão do material foi feita com apenas 1,0mL de soluc¸ão fixadoradeCarnoyparaconcentrar aindamaisas células.Nofinaldoprocesso,foramfeitastrêslâminaspara cada paciente, cadaumcom aproximadamente0,3mLdo material desuspensão das células. As lâminasforam pré--lavadasearmazenadasemetanola70%paraobtermelhor aderência. Quando utilizadas, as lâminas foram lavadas novamente com água encanada e depoiscom água desti-lada.Enquantoaindaúmidascomáguadestilada,0,3mLda soluc¸ãocontendocélulasemsuspensãofoipingadonas lâmi-nas.Após,asmesmassecaramemtemperaturaambientee, mais tarde, foram coradas com soluc¸ão de Giemsa a 10% emtampãofosfato-salino(PBS)pH7,0.Porfim,aslâminas foramlavadascomáguaencanadaesecadasaoar.
Asanálisesdaslâminasforamfeitascomummicroscópio ópticocommagnificac¸ãode400Xe1.000Xcomaadic¸ãode óleomineral.Apenasaslâminascomcélulasbasaise dife-renciadasforamconsideradasnaanálise.Foramanalisadas 2.000(duasmil)célulasbasaise diferenciadasdaamostra decadaneonatoeclassificadasdeacordocomafrequência demicronúcleos,célulasnuclearesgêmeas,células binucle-adas,picnóticas,cariorréticas,cariolíticasecomcromatina condensada,seguindooscritériosdeavaliac¸ãosugeridospor Knasmuelleretal.,8eThomasetal.15
Avariávelestudadaafastou-sesignificativamenteda nor-malidade, e, portanto,o testeUdeMann---WhitneyUnão paramétrico foi aplicado aos dados. As associac¸ões entre duas variáveisforamanalisadas pelacorrelac¸ão de Spear-man.O nível de relevância foiconsiderado em p ≤ 0,05. Todasasanálisesforamfeitasutilizandoopacoteestatístico deciênciassociais(SPSS)paraWindows(IBMCorp,Armonk, EUA),versão17.0.
Resultados
Aidadedosneonatosvarioude14diasa12meses(média
4,28±3,14 meses).Desses,28 (70,0%)eram homens.Não
foram observadas reac¸ões dos neonatos aos
procedimen-tos.Nãoforamobservadoscasosdeirritac¸ão.Observamos
apenasdesconfortonomomentodacoletadevidoao
estra-nhamentodascrianc¸ase,namaiorpartedoscasos,choro.
Afrequênciamédiadeanormalidadesnuclearesé
apre-sentadanatabela1.Apenastrêslâminasforamdescartadas
porsuabaixacelularidade(<2.000.);então,aanáliseseguiu com40neonatos.Nãohouvecorrelac¸ãosignificativaentre anormalidadesnucleareseidade(emmeses;correlac¸ãode Spearman)nemdiferenc¸asentregêneros(testeUde Mann--Whitney).
Tabela1 Frequênciadeanormalidadesnuclearesnas
célu-lasnasaisdeneonato
Anormalidades nucleares
Frequência cellular/2.000
Desvio--padrão
Percentuais
Micronúcleos 2,70 1,53 0,13%
Cariorrexe 24,02 10,36 1,20%
Picnótica 0,65 0,83 0,03%
Cariolótica 217,10 64,41 10,85%
Cromatina condensada
22,27 11,28 1,11%
Binucleada 10,95 3,63 0,54%
Gêmea 0,40 0,74 0,02%
admitiram ter fumado durante a gravidez. Em termos de
família,20mãesrelataramhaveroutrosmoradoresnacasa
quefumam.Aanáliseestatística(testeUdeMann-Whitney)
tambémnãoapresentoudiferenc¸ascomrelac¸ãoa
anorma-lidades nucleares entre os neonatos que foram expostos
passivamenteàfumac¸adecigarroeaquelesquenãoforam
expostos.
Discussão
Nocontexto daanálisedegenotoxicidadeem humanos, a
maiorpartedosestudosutilizaanálisesdoslinfócitosde
san-gueperiféricoedoepitéliobucal.Reticulócitosoucélulas
nasais raramentesão utilizados.1 Em vez disso, avaliamos
ascélulasesfoliadas,porqueasmesmastêmsidomais uti-lizadas devido aos métodos de coleta não invasivos e ao fatodequeasfrequênciasdeanormalidadenucleares refle-temdiretamenteataxadedanosnostecidosestudados.15,16
Aanálisedascélulasnasaispormeiodoensaiode micronú-cleosmostrou-seadequada,umavezquesetornoupossível a visualizac¸ão de todas as células, refletindo, assim, as alterac¸õesnucleares.
No presenteestudo, asanormalidadesnuclearesforam facilmentevistasnascélulasapartirdeesfregac¸oscorados comsoluc¸ãodeGiemsaa10%emPBSpH7,0.Contudo, res-tosbacterianosecelularessãofatoresenganososquepodem mascararoefeitodosmicronúcleosoudascélulasgêmeas, em comparac¸ão aoutrostestes decolorac¸ão, como Papa-nicolau,FeulgenoucorantedeWright.6,17---19Contudo,essa
dificuldadepodeserresolvidautilizandoummicroscópio.As bactériascoradascomGiemsaevistaspelaluzdo microscó-piodiferemdosmicronúcleosoudascélulasgêmeasporque parecem mais brilhantes, são menores e ficam agrupadas comumacormaisforte.Damesmaforma,osrestos celula-respodemserdiferenciadosdosmicronúcleosoudascélulas gêmeasadicionandoPBS,queforneceumpHneutro,e tam-bémporqueosrestosreagemdemaneiradiferentequando corados,emcomparac¸ãoaonúcleoprincipal.
A frequência das anormalidades nucleares foi de 2.000 células como outros estudos, que analisaram 2.000 células ou mais.19 Apenas três lâminas foram
des-cartadas por sua baixa celularidade (< 2.000). Apesar do menor número de células, este trabalho conseguiu avaliar a presenc¸a de anormalidades nucleares em célu-las das cavidades nasais de neonatos, que são menores que as de indivíduos adultos e também porque é mais difícil coletar células em neonatos, pois a escova pode
ser inconveniente para as crianc¸as, e as mesmas talvez precisemserimobilizadasporseuspais.
Váriosoutrosestudosutilizamoensaiodemicronúcleos em populac¸ões infantis por meio de métodos invasivos, comoamostrasdesangue,1,20,21ouemrecém-nascidos,
uti-lizando sangue do cordão umbilical.22 Apesar de utilizar
Giemsacomo corante,osachadosapresentadosneste tra-balho correspondem a outros na literatura, considerando comparac¸õescomoutrascrianc¸asmaisvelhasquejáforam expostas de forma mais significativa a fatores ambien-tais, porque, no momento, nenhum dos estudos associou a presenc¸a de MN ou outras anormalidades nucleares no primeiroanodevidaafatoresambientais.
Hoje, é difícil definir a real relevância biológica das frequências das anormalidades nucleares em neonatos. Comparac¸õesarespeitodosexoapenasenfatizama ausên-ciadediferenc¸asentrehomensemulheres,principalmente entrecrianc¸astãonovasequeaindanãosãoafetadaspela ac¸ão de fatores hormonais. Contudo, seu valor preditivo paradoenc¸aexigeestudosquecombinemdadosde diferen-tesexposic¸ões,comofatoresambientaiseestilodevidados neonatosedesuasmães.1Portanto,asfrequênciasdas
anor-malidadesnucleares em células nasais de neonatos ainda nãoforamrelacionadasahábitosdefumodosmoradoresde umamesmaresidência.
Nãoexistemestudosdecélulasnasaisdeneonatos, ape-sar de as taxas de anormalidades nucleares encontradas nestetrabalhoseremcompatíveiscomosvaloresrelatados emoutrosestudos19 deneonatose crianc¸as (0,13%
micro-núcleos;1,20%cariorrexe;0,03%picnose;10,85%cariólise; 1,11% cromatina condensada; 0,54 células binucleadas; 0,02% células nucleares gêmeas). Outros autores sugeri-ram,aoavaliarlinfócitosecélulasbucais,queafrequência demicronúcleos foi baixa no nascimentoe aumentou em crianc¸as com 1-4 anos de idade.23 Segundo os dados da
literatura,aindahá controvérsia a respeitoda frequência basaldemicronúcleoseoutrasanormalidadesnucleares,e amesmaéaindamenosclaraquandodizrespeitoàavaliac¸ão emcélulasepiteliaisesfoliadas,principalmentecomrelac¸ão àidadeesexo.24
Osníveismédiosdemicronúcleosemcélulasbucais esfo-liadas relatados por dois outros estudos,25,26 em crianc¸as
entre0a6anosdeidade,diferiramemmaisde0,2vezes, sugerindo umimportante impacto dos fatores ambientais edavariabilidadetécnica sobrea frequênciade micronú-cleosemcélulasbucaisemestudosemhumanos.Emoutro estudoqueenvolveulinfócitosecélulasbucaisdecrianc¸as esuasmães,nenhumadiferenc¸aestatisticamente significa-tivadeidade foiobservada devidoa umaamplagamade variabilidadeinterindividual.15
Os efeitos da poluic¸ão no ar atmosférico parecem ser significativosprincipalmenteemcrianc¸as,quesãomais sen-síveisqueosadultos,devidoao fatodeseuscorposainda estaremem fasededesenvolvimento.27 Curiosamente,em
um estudo com crianc¸as de várias idades, o efeito mais fortedapoluic¸ãodoarsobreafrequênciademicronúcleos foiobservadoemindivíduosmaisjovens.28 Essaobservac¸ão
écompatívelcomasensibilidadepossivelmentemaiordas crianc¸asaexposic¸õesambientais.29
neste trabalho podem ser precursores de novas perspec-tivas no entendimento dos efeitos ambientais sobre as células nasais e seus efeitos relacionados a doenc¸as res-piratóriasna populac¸ãopediátrica. Apesar denão termos encontrado diferenc¸as nas frequências de anormalidades nuclearesentreneonatos expostosàfumac¸adecigarro,o ensaiodemicronúcleosemcélulasnasaistambémconseguiu detectaroutrasanormalidadesnucleares.
Oensaiopropostonesteestudoéadequadoparaavaliar afrequênciadeanormalidadesnuclearesemneonatos. Por-tanto,sugerimos a realizac¸ão de estudosadicionaisnesse campodeavaliac¸ãoparaajudaraestabelecerovalor pre-ditivodasalterac¸õesnuclearesnaelucidac¸ãodeprocessos patológicosemonitoramentodapopulac¸ão,proporcionando melhorescondic¸õesdesaúdeparaneonatoseidosos.
Conflitos
de
interesse
Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.
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