Rev. bras. ortop. vol.52 número1

(1)

SOCIEDADE BRASILEIRA DE ORTOPEDIA E TRAUMATOLOGIA

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Artigo

Original

Avaliac¸ão

do

desempenho

in

vivo

_de

_pinos

_porosos

de

hidrogel

para

preenchimento

de

defeito

osteocondral

em

coelhos

夽

Túlio

Pereira

Cardoso

a,∗

,

André

Petry

Sandoval

Ursolino

a

,

Pamela

de

Melo

Casagrande

a

,

Edie

Benedito

Caetano

a

_,

_Daniel

_Vinicius

_Mistura

b

_e

_Eliana

_Aparecida

_de

_Rezende

_Duek

a a_Pontifícia_Universidade_Católica_de_São_Paulo,_Faculdade_de_Ciências_Médicas_e_da_Saúde_de_Sorocaba,_Sorocaba,_SP,_Brasil

b_Universidade_Federal_de_São_Carlos,_Sorocaba,_SP,_Brasil

informações

sobre

o

artigo

Históricodoartigo:

Recebidoem14dejaneirode2016 Aceitoem29demarçode2016

On-lineem13dejulhode2016

Palavras-chave:

Cartilagemarticular Hidrogéis/química Coelhos

r

e

s

u

m

o

Objetivo:Trabalho experimentalparaavaliarodesempenho biológico dearcabouc¸os de hidrogelpoli(L-co-D,Lácidolático)-co-trimetilenocarbonato/poli(álcoolvinílico) (PLDLA--co-TMC/PVA)comoimplantenopreenchimento,enãonoreparo,dedefeitoosteocondral emcoelhosNovaZelândiaeverificarainfluênciadomaterialnaprotec¸ãotecidualinvivo.

Métodos:Foramusados12coelhosdivididosemgruposdenovee16semanas.Emcada animalfoicriadoumdefeitoosteocondralemambososcôndilosfemoraismediais,emum foiimplantadoumarcabouc¸odehidrogel(grupopino)enooutrofoimantidoodefeito(grupo controle).Apósosacrifíciodosanimais,foifeitaanálisehistológicadomaterial.

Resultados: Oscôndilosdogrupopinonãoevidenciaramreaçãoinflamatóriaeestavam rode-adosporcápsulafibrosa.Jánogrupocontrole,umamaiorproliferaçãoósseafoiobservada nasáreasdodefeito,porémcomcartilagemarticulardesorganizada,fibroseevidente,atrofia comexposiçãoósseaeproliferaçãodemembranasinovial.

Conclusão:Ospinosdehidrogelsãopromissoresnafunc¸ãodepreenchimentodedefeitos oste-ocondrais,nãoocasionam,demodogeral,reac¸ãoinflamatóriaenãosãoeficazesnoreparo

dedefeitososteocondrais.

夽

TrabalhodesenvolvidonoLaboratóriodeBiomateriais,FaculdadedeCiênciasMédicasedaSaúdedeSorocaba,PontifíciaUniversidade CatólicadeSãoPaulo,Sorocaba,SP,Brasil.

∗ _Autor_para_{correspondência}_.

E-mail:tuliopcardoso@gmail.com(T.P.Cardoso). http://dx.doi.org/10.1016/j.rbo.2016.03.011

(2)

In

vivo

_evaluation

_of

_porous

_hydrogel

_pins

_to

_fill

_{osteochondral}

_defects

in

rabbits

Keywords: Articularcargilage Hydrogels/chemistry Rabbits

a

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r

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Objective: Thisexperimentalstudyaimedtoevaluatethebiologicalperformanceofpoly (L-co-D, L-lacticacid)-co-trimetilenecarbonate/poly(vinylalcohol)(PLDLA-coTMC/PVA), hydrogelscaffolds,asanimplantinthefilling(andnotintherepair)ofosteochondraldefects inNewZealandrabbits,assessingtheinfluenceofthematerialintissueprotectioninvivo.

Methods: Twelverabbitsweredividedintogroupsofnineand16weeks.Ineachanimal, an osteochondral defectwascreated inboth medialfemoral condyles.In one knee, a hydrogelscaffoldwasimplanted(pingroup)andintheother,thedefectwasmaintained (controlgroup).Ahistologicalanalysisofthematerialwasperformedaftereuthanasia.

Results: Thecondylesofthepingroupshowednoinflammatoryreactionandwere surroun-dedbyafibrouscapsule.Thecontrolgrouppresentedhigherbonegrowthintheareasofthe defect,butwithdisorganizedarticularcartilage,evidentfibrosis,boneexposure,atrophy, andproliferationofsynovialmembrane.

Conclusion:Thehydrogelpinsarepromisinginfillingosteochondraldefects,generallydonot causeinflammatoryreactions,andarenoteffectiveintherepairofosteochondraldefects.

Introduc¸ão

Aosteoartroseouosteoartriteéumadasafecçõesquemais acometemohomem.1_Sua_prevalência_aumenta_com_o_passar dosanos,é comumapós os60 anos.2 _A_cartilagem articu-lareoossosubcondralformamumsistemadelubrificação, estabilização e distribuição uniforme de carga, absorvem choques epermitem movimentação com baixafricção por váriasdécadas.2–4 _Dessa_forma,_a_cartilagem_protege_o_osso subcondral de alto estresse e reduz a pressão normal de contato.2,5 _A_cartilagem_degradada_evolui_com_dor,_rigidez_e diminuição domovimentoarticular.Graças àbaixa capaci-dadederegeneraçãocondral,aosteoartroseéumdosmais importantesproblemasnaortopedia.Comoaumentoda lon-gevidadehumanaedapráticaesportivanasúltimasdécadas observamoscadavezmaislesõesosteocondrais.2

Acartilagemarticularnormalapresentaumafasesólida constituídaprincipalmenteporcolágenoeproteoglicanos (15-32%) e umafase fluida composta predominantemente por água (68-85%).2 _A _cartilagem _hialina_compõe-se _de_10% _de células(condrócitos) edensamatrizextracelular,com 60 a 80%deágua,10a20%defibrasdecolágenotipoIIe10a15%de proteoglicanos.Aspropriedadesmecânicasdacartilagem arti-cularatornamcapazdetransmitircargadeaproximadamente oitovezesopesocorporal,graçasàexsudaçãoeaomovimento dofluídopelosporosdacartilagem,econferemumcoeficiente defricçãode0,008␮(mi).4,6

Oossosubcondraléumafinacamadadeossodensoeduro emcontatocomacartilagemarticular,enquantooosso tra-becularécompostoporabundantematriz(fibrasdecolágeno eminerais)queagenatransmissãodecarga.6

Porseravascular,acartilagemdependedavascularizac¸ão proveniente da medula óssea para que ocorra migrac¸ão de células mesenquimais, responsáveis pelo processo de

cicatrizac¸ão.7,8 _Além_disso,_as_lesões_superficiais _da cartila-gemarticular,quenãoenvolvemoossosubcondral,têmpouca capacidadeintrínsecadereparac¸ão.9

Tantonaosteoartroseprimáriacomonasecundária,a car-tilageméotecidoquesofreasmaioresaberrações.Dentreas alteraçõesmorfológicasocorremperdadesuanatureza homo-gênea,fragmentação,fibrilação,fissuraseulcerações.Coma progressãodadoença,ocasionalmentenãorestanenhumae áreasdeossosubcondralficamexpostas.10

Podemosconsiderartrêsfasesnoprocessoderegeneração tecidual: necrose, inflamação e reparo.11,12 _Porém, _a cicatrização de lesão restrita à cartilagem hialina pode nãoocorrerdessaforma.13_Lesões_superficiais_da_cartilagem hialina que não atinjam o osso subcondral tendem a não cicatrizar.9 _Nessa _lesão _ocorre _{degeneração} _da _cartilagem apartirda zonasuperficialeobservam-sefinasporçõesde fibras de colágeno com aspecto descamativo. Com a pro-gressão da lesão épossível visualizar fissuras verticais na cartilagem articular,queproduzemaspectoirregular esem brilho.4,14

Alesãocondraldesencadeariaumprocessoinflamatório eo hematomarapidamente seorganizariaemcoágulos de fibrina,glóbulosbrancoseelementosdamedulaóssea.

Célulasindiferenciadasdamedulaedoendotélio vascu-larsãotransformadasemfibroblastosprimitivosque,como aportedecapilaresecoágulosdefibrina,setransformamem tecidofibroblásticovascularizadodereparação.11_Esse_tecido fibrocartilaginoso,adependerdosestímulosmecânicose bio-lógicos, formará umtecido cartilaginoso.13 _A _{neoformação} ósseamigradabasedodefeitoparaasuperfíciearticularna regiãoemcontatocomoossosubcondral. Umtecido fibro-cartilaginoso preenche azona de transição einterrompe a formaçãodetecidoósseo.4,11,14

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sintetizaproteoglicanosdemenorpesomolecular.Comoas fibrasdecolágenodotipoIItêmmenordiâmetroedisposic¸ão mais irregular, esse arranjo favorece a permeabilidade à água. Essetecido neoformadoapresentamenor módulode elasticidade quandocomparado como tecido cartilaginoso normal.4,16,17

Otratamentocirúrgicodelesõescondraiseosteocondrais representaumgrandedesafio.Podemostentaraestimulação daformaçãodetecidocartilaginosooufibrocartilaginoso,que seriaareparaçãoouasubstituiçãodessaslesõesportecidos comcaracterísticassemelhantes.4,13

Não existem tecidos de substituic¸ão com propriedades mecânicassimilaresaotecidooriginal.18_Pesquisas_com enge-nhariadetecidoqueusasistemastridimensionaissintéticos comarcabouc¸osporosostêmsidofeitas.19,20

Polímeros como poli(p-dioxanona) – PPD, o poli (ácido lático) – PLA,poli (ácido glicólico) – PGA eseus copolíme-rosPLLAePLGAepoli(␣-hidroxiácidos)comcaracterísticas dedegradac¸ão,biorreabsorc¸ãoebiocompatibilidadetêmsido exaustivamenteestudados.4,21–24

Nonossoestudoempregamosumhidrogel nãoporosoe nãoabsorvível(PLDLA-co-TMC/PVA)parapreenchimentodo defeitoosteocondral,enãoparareparac¸ãoquepermita cres-cimentodeneotecido.

Arespostabiológicainvivocompinosdehidrogel PLDLA--co-TMC/PVAnopreenchimentodedefeitososteocondraisé desconhecida.

Oobjetivodeste trabalho foi avaliarodesempenho bio-lógicode arcabouc¸osde hidrogelPLDLA-co-TMC/PVA como implantenopreenchimento,enãonoreparo,dedefeito oste-ocondralemcoelhosNovaZelândiaeverificarainfluênciado materialnaprotec¸ãotecidualinvivo.

Material

e

métodos

Opresenteestudofoiaprovado pelaComissãodeÉtica em Pesquisa de nossa instituic¸ão (CEUA/FCMS/PUCSP, número 2013/10).

Preparac¸ãodosarcabouc¸ospoliméricos(pinosdehidrogel)

Os pinos de hidrogel são compostos por polímeros semi--interpenetrantesbaseadosemPoli(ÁlcoolVinílico)(PVA)e poli(L-co-D,L ácido lático)-co-trimetileno carbonato (PLDLA--TMC).Ohidrogelfoifeitocomumasoluçãode10%m/vde PVAemáguae10%docompostoPLDLA-TMCemrelação à massadePVAusada.Asoluçãofoientãovertidaemmoldesde PTFE(politetrafluoretileno)comdiâmetrode4,1mm,deixados emprocessodecongelamento-descongelamentodurantedois dias.Apósesseprocessoospinosforamretiradosdomolde, cortadosnosentidodocomprimentocom13mm, esteriliza-dosemradiaçãoUVeimplantados(fig.1).

Estudoinvivocomimplantedospinosecontroles

Foramusados12coelhosNovaZelândia,deambosossexos, entre120e150diase3,5kga4,5kg.

Apósjejumpré-operatóriodeoitohoras,submetemosos animaisàanestesiageralviaintramuscularcomcloridratode

Figura1–PinosdehidrogelPLDLA-co-TMC/PVAemolde usadoparaconfecc¸ãodosdispositivos.

cetamina(30mg/kgdepeso)associadoacloridratodexilazina (5mg/kgdepeso).Feitatricotomiada áreaoperada,os coe-lhosforamposicionadosemmesa cirúrgicaapropriada,em decúbitodorsalhorizontal.Aassepsiafoifeitacomsoluc¸ãode clorexidinaalcoólica0,5%aplicadacomgazesestéreis.O cirur-giãofezusodeluvascirúrgicasestéreisemateriaiscirúrgicos esterilizadosemautoclavea180◦_C_por_duas_horas.

Usamos incisão para patelar medialcom dissecc¸ão por planos (subcutâneo e capsulotomia para patelar medial). Procedeu-seàluxac¸ãolateraldapatelaqueexpôsos côndi-losfemorais.Comojoelhofletidoa90◦_,_criou-se_um_defeito cilíndriconacartilagemarticularenoossosubcondralno côn-dilofemoralmedialcomoempregoumabrocatrefinametálica de3,3mm/38,5mmefoiretiradoumcilindroosteocondralde 1cmdeprofundidadedeambososjoelhos7,13₍_figs.₂_e₃_).

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Figura3–Implanteecilindroosteocondral.

Odefeitocondralfoicriadoemambososcôndilosfemorais mediais,emumdosladosfoiimplantadoopinodehidrogel (ladoimplante),enquantonooutro(ladocontrole)foiapenas mantidoodefeito(fig.4).

Foifeitasuturaporplanosapósalavagemcomsoro fisi-ológico0,9%enãoforamusadoscurativosouimobilizac¸ões. Todososanimaisforammantidosindividualmenteemgaiolas metálicas,comáguaerac¸ãoadlibitum.

Retiradadomaterial–Eutanásiaecoletadetecido

Apósnovesemanasforamsacrificadosseteanimaisecinco após16semanas.

Usamos inalac¸ão com halotano. Após a constatac¸ão da morte,oanimalfoiposicionadoemdecúbitodorsal horizon-tal. Dessa maneira foram ressecados os côndilos femorais mediais dos dois joelhos, por via de acesso para patelar medial.

Avaliac¸ãomacroscópica

Os côndilos foram individualmente identificados, observa-dos macroscopicamente e fotografados (fig. 5). De acordo comaclassificaçãodeOuterbridgemodificada,ogrupopino, tantocom novecomo16semanas–considerou-sequenão houvecrescimentode tecidosobreopino–gruponãopôde serincluídonaclassificação.Jánogrupocontrole,comnove ou16semanas,observaram-sealteraçõescaracterísticasde OuterbridgeII.

Processamentodomaterial–Análisehistológica

Oscôndilosfemoraisforamcolocadosemrecipientesdevidro comsoluc¸ãodeBouin(compostadeácidopícrico,ácido acé-ticoeformaldeído)parafixac¸ãopor24horasquemantéma integridadedostecidosapósamorte.

O material foi descalcificados em EDTA 4,13% (soluc¸ão descalcificadoracompostadeEDTAtetrassódico,tartaratode sódio,tartaratodesódio epotássio,ácidoclorídricoeágua destilada)por21dias.

Para processamento histológico foram feitos cortes paralelos longitudinais (craniocaudais) e identificados sequencialmente para cada amostra. Essa técnica permi-tiu avaliac¸ão precisa de toda área do côndilo, incluindo a inicialmente lesada e toda a superfície ao redor da lesão.

Asamostras,devidamenteidentificadas,foram desidrata-das emumasequênciadesoluc¸õesalcoólicas,diafanizadas sequencialmenteemxilolI,IIeIIIeincluídasemparafinaa 70◦_C._Após_o_corte_de₃_␮m,_as_amostras_foram_coradas_com Hematoxilina-Eosinaeanalisadaspormicroscopiadeluz con-vencional.

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Figura5–A,compinodehidrogel;B,sempino(grupocontrole).

Avaliac¸ãomicroscópica

Noexamehistológicoqualitativodassecc¸õesdofêmur dis-tal,aatenc¸ãofoidirigida,particularmente,paraosseguintes elementos:

1. tipodetecidoquerecobriaasuperfíciearticular:cartilagem hialina,fibrocartilagem,tecidoósseooutecidofibroso; 2. estadodasuperfíciecartilaginosa:lisa,comdepressãoou

irregularcompresenc¸adefissurasoufragmentos; 3. padrãodoossosubcondral;

4. presenc¸aounãodenecroseerespostainflamatória propri-amentedita;

5. encontroounãodealterac¸õeshiperplásicasdacartilagem outecidoósseo;

6. avaliac¸ãodasmembranassinoviais,quandopossível.

Resultados

Naavaliaçãoderesultadosforamconsideradosquantidadede fibrose,neoformaçãoósseaepresençadetecidocartilaginoso nasuperfíciecondilar.

Nogrupopino,sacrificadonovesemanasapósoimplante, encontramosfibrosediscretaemquatroanimais,fibrose acen-tuadaemdoisenenhumcomfibrosemoderada.

Nogrupocontrole,sacrificadonovesemanasapósacriac¸ão dodefeitoosteocondral,encontramosfibrosediscretaemdois animais,moderadaemdoiseacentuadaemdois.

Nogrupopino,sacrificadoapósnovesemanasdoimplante, umanimalapresentouneoformac¸ãoósseaeemcincoelanão foi encontrada. Jáno grupo controle, aneoformac¸ão óssea estavapresenteemquatroanimais,contraausênciaemum animal.

Comrelaçãoàpresençadecartilagemnasuperfície articu-lar,nãofoiencontradaemquatrocoelhosdogrupocontrole eestavapresenteemumcaso.Emumdoscoelhosfoi encon-tradaumasuperfíciequenãopôdeserdefinidacomotecido cartilaginosoorganizado.Nogrupopinoocorreupresençade tecidocartilaginosoemquatrocasos,enquantoemdois coe-lhosnãofoiencontradacartilagem(tabela1efigs.6e7).

Um dos animais incluído no grupo sacrificado com 16 semanas apresentou infecc¸ão no sítio cirúrgico e foi excluídodotrabalho.

Quatrocoelhosdogrupopinoapresentaramfibrosedegrau discretoeumnãotevefibrose.

Aneoformaçãoósseaocorreuemquatrocoelhosdogrupo controleeemumdelesocorreufragmentaçãodomaterial,o queinviabilizou aanálisecorreta.Jánogrupopino nãofoi observadapresençadeneoformaçãoóssea.

Nogrupocontrole,com16semanasocorreudegenerac¸ão de cartilagem em um caso, enquanto naquele com

Tabela1–Coelhosdogrupocomnovesemanas

Sacrifícionovesemanas Grupos Fibrose Neoformac¸ãoóssea Superfíciecartilaginosa

Coelho1-9 Controle Acentuada Ausente Ausente

Coelho1-9 Pino Discreta Ausente Presente

Coelho2-9 Controle Moderada Presente Desorganizada

Coelho2-9 Pino Acentuada Presente Ausente

Coelho3-9 Controle Discreta Presente Ausente

Coelho3-9 Pino Discreta Ausente Ausente

Coelho4-9 Controle Discreta Presente Ausente

Coelho5-9 Controle Acentuada Presente Presente

Coelho6-9 Controle Moderada Ausente Ausente

(6)

Figura6–Lâminahistológicadogrupopinonovesemanas comausênciadereac¸ãoinflamatóriaelevefibrose.

Figura7–Lâminahistológicadogrupocontrolecomnove semanascomneoformac¸ãoóssea,fibroseexuberante edesorganizac¸ãotecidual.

fragmentac¸ão do material não foi possível analisar a presenc¸aou não de cartilagem.Em dois coelhos dogrupo controle encontramos cartilagem na superfície articular contra um que não a apresentava. No grupo pino, cinco

Figura8–Lâminahistológicadogrupopinode16semanas quemostradiscretafibrose,semneoformac¸ãoóssea.

coelhos tinham cartilagem presente, contra um ausente (tabela2efigs.8e9).

Discussão

Dos 12coelhosestudados, apenasumdogruposacrificado comnovesemanasfoiexcluídoporapresentarinfecc¸ãolocal. Portanto,11animaisfizerampartedesteestudo.

A análise histológica dos implantes de arcabouços de PLDLA-co-TMC/PVA após nove semanas evidenciou que o pino não induz reação inflamatória, tampouco estimula a neoformaçãoóssea.Háestimuloparaproliferaçãofibrosanas bordasdalesãoapartirdacartilagemarticularcomformação principalmentedefibrocartilagemetentativadefechamento dalesão.

Nogrupocontroleapósnovesemanashámaisfibrose,mais neoformac¸ãoóssea,sejaapartirdacartilagemarticulardas bordasdalesãocomoapartirdastrabéculasdoossocompacto

Tabela2–Coelhosdogrupocom16semanas

Sacrifício16semanas Grupos Fibrose Neoformac¸ãoóssea Superficiecartilaginosa

Coelho1-16 Controle Discreta Presente Presente

Coelho1-16 Pino Discreta Ausente Ausente

Coelho2-16 Controle Discreta Presente Presente

Coelho3-16 Controle Discreta Presente Denerac¸ão

Coelho4-16 Controle Fragmentac¸ão Análiseinviável

Coelho5-16 Controle Moderada Presente Ausente

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Figura9–Lâminahistológicadogrupocontrolede 16semanasquemostraneoformac¸ãoósseaefibrose.

rodeadasdecélulasosteoprogenitoras.Porém,semevidências dereparodalesãocondral.

Após16semanasoscôndiloscomimplantesdehidrogel nãoevidenciaramreac¸ãoinflamatóriaeestavamrodeadospor cápsulafibrosa.Oossotrabecularaoseuredortemaspecto conservado e há fechamento da superfície articular com presenc¸adecartilagemhialinaouentãocartilagematrófica deaspectofibro-hialino.

Naslesõesdogrupocontrolecom16semanashouvemais proliferaçãoósseanasáreasdodefeito.Noentanto,com car-tilagemarticulardesorganizada,comfibroseevidente,houve atrofiacomexposiçãoósseaeproliferaçãodemembrana sino-vial.

Comrelaçãoàneoformaçãoóssea,nogrupodenove sema-nas, para nossa surpresa, um dos animais do grupo pino apresentoucrescimentodetecidoósseocompadrãofibroso. Jáosoutroscoelhosdesse gruponão apresentaram cresci-mentoósseo,enquantoemtodosdogrupocontroleocorreu neoformaçãoóssea.

Nogrupocontrolesacrificadocom16semanas encontrou--se,como esperado, preenchimento ósseono defeito oste-ocondral, muito provavelmente devido ao maior tempo decorridoentreacirurgiaeosacrifício.Entretanto,nos ani-maisdogrupopinonãohouvecrescimentoósseonodefeito. Issosugerequeapresenc¸adopinoimplantadocausou preen-chimentodetodooespac¸ocriadopelodefeito.

Conclusão

Os pinos de hidrogel demonstraram superioridade com relaçãoàproteçãodasuperfíciecartilaginosaarticular,como artefatos depreenchimento dosdefeitososteocondrais. No entanto, não apresentaram qualquer efeito reparador. Por outrolado,nogrupocontrole,verificou-sedegradaçãoda car-tilagemtantonodefeitoquantonaperiferia.

Conflitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.

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