SOCIEDADE BRASILEIRA DE ORTOPEDIA E TRAUMATOLOGIA
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Artigo
de
Atualizac¸ão
Potencial
regenerativo
do
tecido
cartilaginoso
por
células-tronco
mesenquimais:
atualizac¸ão,
limitac¸ões
e
desafios
夽
Ivana
Beatrice
Mânica
da
Cruz
a,b,
Antônio
Lourenc¸o
Severo
c,
Verônica
Farina
Azzolin
b,
Luiz
Filipe
Machado
Garcia
b,
André
Kuhn
ce
Osvandré
Lech
c,∗aUniversidadeFederaldeSantaMaria(UFSM),CentrodeCiênciasdaSaúde,SantaMaria,RS,Brasil
bUniversidadeFederaldeSantaMaria(UFSM),LaboratóriodeBiogenômica,SantaMaria,RS,Brasil
cUniversidadeFederaldaFronteiraSul(UFFS),HospitalSãoVicentedePaulo,InstitutodeOrtopediaeTraumatologia,PassoFundo,RS,
Brasil
informações
sobre
o
artigo
Históricodoartigo:
Recebidoem12defevereirode2016 Aceitoem15defevereirode2016 On-lineem18dejulhode2016
Palavras-chave: Células-tronco Tecidocartilaginoso Potencialregenerativo
r
e
s
u
m
o
Osavanc¸osnosestudoscomcélulas-troncomesenquimais(CTMs)adultastornouaterapia regenerativatecidualumaferramentapromissoraemdiversasáreasdamedicina.Na orto-pedia,umdosprincipaisdesafiostemsidoaregenerac¸ãodotecidocartilaginoso,sobretudo emdiartroses.Nainduc¸ãodeCTMs,alémdacitodiferenciac¸ão,ocontexto microambien-taldotecidoaserregenerado,bemcomoumadisposic¸ãoespacialadequada,sãofatores deextremaimportância.Alémdisso,sabe-sequeadiferenciac¸ãodasCTMsébasicamente determinadapormecanismoscomoproliferac¸ãocelular(mitose),interac¸ões bioquímico--moleculares,movimento,adesão celulareapoptose.Apesar deousodeCTMs paraa regenerac¸ãodacartilagemestaraindaemâmbitodepesquisa,existemquestões importan-tesaseremresolvidasparatornaressaterapêuticaeficazesegura.Sabe-se,porexemplo, queaexpansãodecondrócitosemcultura,necessáriaparaaumentaronúmerodecélulas, podeproduzirfibrocartilagem,enãocartilagemhialina.Noentanto,osúltimos resulta-dossãopromissores.Em2014,foipublicadooprimeiroensaioclínicofaseI/IIparaavaliara eficáciaeaseguranc¸adainjec¸ãointra-articulardeCTMsnaregenerac¸ãodecartilagem femo-rotibialehouveumadiminuic¸ãodasáreaslesadas.Umaquestãoaserexploradaéoquanto modificac¸õesnopróprioambienteinflamatórioarticularpoderiaminduziradiferenciac¸ão deCTMsjáalocadasnaquelaregião.Talincógnitapartedoprincípiodeestudosque suge-remqueasupressãodainflamac¸ãoarticularaumentaria,potencialmente,aeficiênciada regenerac¸ãotecidual.Considerandoacomplexidadedoseventosrelacionadosà condrogê-neseeaoreparodacartilagem,conclui-sequeocaminhoaindaélongo,sãonecessárias pesquisascomplementares.
©2016PublicadoporElsevierEditoraLtda.emnomedeSociedadeBrasileirade OrtopediaeTraumatologia.Este ´eumartigoOpenAccesssobumalicenc¸aCCBY-NC-ND
(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
夽
TrabalhodesenvolvidonoInstitutodeOrtopediaeTraumatologiadePassoFundo,PassoFundo,epeloCentrodeCiênciasdaSaúde, UniversidadeFederaldeSantaMaria(UFSM),SantaMaria,RS,Brasil.
∗ Autorparacorrespondência.
E-mails:[email protected],[email protected](O.Lech).
http://dx.doi.org/10.1016/j.rbo.2016.02.007
Regenerative
potential
of
the
cartilaginous
tissue
in
mesenchymal
stem
cells:
update,
limitations,
and
challenges
Keywords: Stemcells
Cartilaginoustissue Regenerativepotential
a
b
s
t
r
a
c
t
Advancesinthestudieswithadultmesenchymalstemcells(MSCs)haveturnedthetissue regenerativetherapyintoapromisingtoolinmanyareasofmedicine.Inorthopedics,one ofthemainchallengeshasbeentheregenerationofcartilagetissue,mainlyindiarthroses. IntheinductionoftheMSCs,inadditiontocytodifferentiation,themicroenvironmental contextofthetissuetoberegeneratedandanappropriatespatialarrangementare extre-melyimportantfactors.Furthermore,itisknownthatMSCsdifferentiationisfundamentally determined by mechanisms such ascell proliferation (mitosis),biochemical-molecular interactions,movement,celladhesion,andapoptosis.AlthoughtheuseofMSCsforthe cartilage regenerationremainsata researchlevel,thereare importantquestionstobe resolvedinordertomakethistherapyefficientandsafe.Itisknown,forinstance,that the expansionof chondrocytesin cultivation,needed to increasethe number ofcells, could end up producingfibrocartilage insteadof hyalinecartilage. However, thelatest resultsarepromising.In2014,thefirststageI/IIclinicaltrialtoevaluatetheefficacyand safetyoftheintra-articularinjectionofMSCsinfemorotibialcartilageregenerationwas published,indicatingadecreaseininjuredareas.Oneissuetobeexploredishowmany modifications in the articulateinflammatoryenvironment could induce differentiation ofMSCsalready allocatedinthatregion.Suchissuearosefromstudiesthatsuggested thatthesuppressionoftheinflammationmayincreasetheefficiencyoftissue regenera-tion.Consideringthecomplexityoftheeventsrelatedtothechondrogenesisandcartilage repair,itcanbeconcludedthattheroadaheadisstilllong,andthatfurtherstudiesare needed.
©2016PublishedbyElsevierEditoraLtda.onbehalfofSociedadeBrasileirade OrtopediaeTraumatologia.ThisisanopenaccessarticleundertheCCBY-NC-NDlicense
(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
Introduc¸ão
O corpohumano seorigina basicamente de células-tronco
embrionárias, ectoderme, mesoderme e endoderme. É a
partir desses três folhetos que os 230 tipos de células
encontrados no organismo se diferenciam. No organismo
diferenciado,muitos tecidosmantêmlinhagensde
células--troncoadultas quefuncionamna reposic¸ãoeregenerac¸ão
tecidual, são as mais abundantes as de origem
mesodér-mica, chamadas células-tronco mesenquimais (CTMs). As
CTMssãoencontradasemdiversoslocaisdocorpo,como a
medulaósseavermelha,folículoscapilares,músculo,cordão umbilical, polpa dentária, tecido adiposo, ósseo e
cartila-ginoso, entre outros.1 Com os avanc¸os do conhecimento
sobreCTMsadultas,ouso clínicoparafins deregenerac¸ão
tecidual se tornou bastante atrativo. Porém, conhecer e
manipular CTMs de modo eficaz e seguro é ainda um
grandedesafio, principalmente quando setrata de tecidos
que têm difícil regenerac¸ão, como é o caso da
cartila-gem.
Nesse contexto, a presente revisão tem como objetivo
fazer uma atualizac¸ão sobre os principais processos
rela-cionados com a morfodiferenciac¸ão e seu potencial papel
na regenerac¸ão do tecido cartilaginoso. Para tanto, as
informac¸õesaquicontidasforambaseadasemartigos cien-tíficosderevistasindexadasnasbasesdoPubmed-Medlinee Scielo.
O
tecido
cartilaginoso
e
os
desafios
para
a
regenerac¸ão
Emtermosestruturais,acartilagemarticularéricaemmatriz extracelular,naqualseencontramdistribuídoscondrócitos isoladosouemgruposclonaisorganizadosempequenas colô-niascelulares.2Oscondrócitossãoresponsáveispelasecrec¸ão
dos componentes da matriz cartilaginosa, como colágeno,
glicoproteínaseproteoglicanas.Anutric¸ãodotecido cartilagi-nosoocorreviacapilarescontidosnopericôndrio,umtecido conjuntivoqueenvolveacartilagemequetemCTMsadultas
chamadascondroblastos.
Entretanto, como as cartilagens que revestem os ossos
dasarticulac¸õesmóveisnãotêmpericôndrio,asuanutric¸ão é feita pelo líquido sinovial presente nas cavidades arti-culares. O líquido sinovial representa um ultrafiltrado de
plasmaqueatravessaamembranasinovial,naqualrecebe
mucopolissacarídeos que contêmácido hialurônico euma
pequena quantidade de proteínas de alto peso molecular.
Assim,mesmocomumagrandequantidadedeproteínas
colá-genas,apequenaquantidade decomponentescelularesno
tecidocartilaginosodificultasuaregenerac¸ãoefazcomque lesõesarticularesrepetitivastenhamumamaiortendênciaà cronificac¸ão.3
Para que se possa entender o papel das CTMs na
regenerac¸ão do tecido adulto é importante lembrar que o
diferenciac¸ão e func¸ão distintas.4 Convém salientarque a regenerac¸ãotecidualnãoestásomentecentradanainduc¸ão
da CTM indiferenciada em uma célula diferenciada. Cada
tipo de tecido tem uma matriz extracelular com papel
fundamental na homeostase corporal. Assim, o contexto
microambiental(matrizextracelular)dotecidoaser regene-radoprecisaserlevadoemconsiderac¸ão.
Cinco mecanismoscausais são cruciaispara queocorra
a diferenciac¸ão celular em tecidos e órgãos corporais,
assim como no próprio processo de regenerac¸ão
teci-dual. Esses são: proliferac¸ão celular (mitose), interac¸ões
bioquímico-moleculares,movimento,adesãocelulare
apop-tose.Comoessesmecanismossãodegranderelevânciaparaa
manipulac¸ãodeCTMscomaperspectivadedesenvolvimento
detécnicas deregenerac¸ão dotecidocartilaginoso,serãoo focoprincipaldestarevisão.
Proliferac¸ão
e
senescência
celular
ParaseentendercommaiorprofundidadeabiologiadasCTMs éprecisocompreenderalgunsmecanismosassociadosaoseu ciclocelular.Como jáconhecido,ascélulas eucarióticasse dividempormitose,consideradaafasefinaldociclo,noqual asduas células-filhas formadas exercerãosuas respectivas func¸õesmetabólicas.
Noentanto,adivisãomitóticanãoéumprocessoilimitado. Amaioriadascélulasespecializadas,àmedidaquesedividem, perdeasuacapacidadeproliferativa.Algumascélulasquenão irãomaissedividirpermanecemconstantementenafasegap1 (G1)damitose,comoéocasodavastamaioriadoscondrócitos. Novoscondrócitossãoformadosapartirdoscondroblastosdo pericôndrioeéporessemecanismoqueotecidocartilaginoso serenova,aindaquelentamentesecomparado,porexemplo, comotecidoósseo.Poroutrolado,existemcélulas especializa-dasadultasquefazemociclocelularcompletoatéqueperdem acapacidadedeseproliferar,porumprocessodenominado senescênciareplicativaouenvelhecimentocelular(fig.1).
Oenvelhecimentocelularédesencadeadopormudanc¸as
queocorremnaregiãoterminaldocromossomoconhecida
comotelômero,queéconstituídoporumamoléculadeácido desoxirribonucleico(DNA)simples-fita(aocontrárioda estru-turadupla-fitapresentenorestantedomaterialgenético).O
DNAteloméricoéformadopelasequênciadeseis
nucleotí-deos –timina, timina, adenina, guanina, guanina, guanina
(TTAGGG)–aqualserepetemilharesdevezes.Essaregião cromossômicaésintetizadapelaenzimatranscriptasereversa (sintetizaDNAetemcomomoldeumamoléculadeácido ribo-nucleico[RNA])chamadatelomerase.
Na divisãocelular ocorre sempre umpequeno
encurta-mento telomérico. Em células embrionárias, o telômero é
reconstituídopelaac¸ãoda telomerase.Nascélulas especia-lizadasogenedaenzimatelomeraseésilenciadoe,portanto,
quandoocorre encurtamento telomérico não existea
pos-sibilidadedereconstituic¸ãodotelômero.Como passardas
divisões (aproximadamente 50-80 mitoses) o telômero fica
muitocurto,passaainibiramitoseeconstituiassima cha-madasenescênciacelularoulimitedeHayflick.
Aocontráriodascélulasespecializadas,asCTMs
apresen-tamogene daenzimatelomeraseativoe,portanto,dentro
doorganismoessascélulasnãoapresentamenvelhecimento
celularacentuado.Entretanto,ataxadeproliferac¸ãodasCTMs éextremamentebaixae,porisso,onúmerodessascélulasnos tecidoscorporaisébastantelimitado,éumgrandedesafioa sercontornadonaterapiaregenerativa.
Algunsestudossugeriramqueainduc¸ãodaproliferac¸ãode CTMsinvitropodeserfeitaviaexposic¸ãoamoléculasde espé-ciesreativasdeoxigênio(EROs),comoéocasodoperóxido dehidrogênio.Ainvestigac¸ãofeitaporBornesetal.5mostrou
que a condrogênese invitro induzidaem CTMsda medula
ósseade ovinos aumentouaproliferac¸ão eadiferenciac¸ão celular.Entretanto,pareceque,apesardoaumentoda expan-sãocelular,ascélulaspassamaapresentarimportantesdanos noDNA,queindicainstabilidadecromossômica.6Oestudode Machadoetal.6corroboraainvestigac¸ãoconduzidaporBrand etal.7quesugeriuqueaexposic¸ãoinvitroaoestresseoxidativo induziuasenescênciacelulardecondrócitos.
Poroutrolado,oestudodeMachadoetal.6mostrou
rever-são de indicadores de senescência replicativa de CTMs de
lipoaspiradoshumanospormeiodasuplementac¸ãodomeio
de cultura com extratohidroalcoólico de guaraná (Paullinia cupana). A semente de guaraná usadapara aproduc¸ão do extratoéumaplantaricaemcafeína,teofilina,teobromina ecatequinas.
Outroresultado bastantesurpreendente foi descritopor Sadeghietetal.,8queinvestigaramoefeitodasuplementac¸ão
comestrogênionacondrogêneseinduzidaemCTMsoriundas
dotecidoadiposo.Foiobservadoqueapresenc¸ade estrogê-nioteve efeitosnegativosnoprocesso decondrogênese via inibic¸ão naexpressão dogenedocolágeno 2ereduc¸ãona expressãodogenedaproteínaagrecan.
Diferenciac¸ão
celular
A partirdozigoto,todas ascélulas corporaisetecidossão formados,emumprocessoderegulac¸ãotranscricional
alta-mentecontrolado.Emgeral,oDNAdogeneeucarióticotem
umasequênciainicialdenucleotídeosconhecidacomoregião promotora.Énelaquemoléculassinalizadorasseligam,
per-mitemounãoatranscric¸ãoedeterminamaquantidadede
RNAtranscrito.Essamodulac¸ãoéconhecidacomoregulac¸ão gênica,ummecanismopeloqualcadatipodecélulaéformado via produc¸ãodediferentesformasequantidadesde proteí-nas.Existemmoléculasendógenas,comohormôniosefatores detranscric¸ão,quepodemregulardiferencialmenteosgenes.
Damesmaforma,moléculasoriundasdadieta,comoo
res-veratrol(presentenauva),induzemaproduc¸ãodesirtuínas, proteínasqueaumentamotempodevidacelular.
Emcondic¸õesinvitroainduc¸ãodadiferenciac¸ãodeCTMs napresenc¸adedeterminadasmoléculasjáébastante
conhe-cida. Entretanto, quando as CTMs são colocadas no órgão
lesionado,nemsempreépossívelsaberseascondic¸ões micro-ambientaisvãofavorecerainduc¸ãodadiferenciac¸ão(mesmo
quandoosagentesindutoressãoconcomitantemente
inseri-doscomascélulas).
Outras moléculasreguladorasdamanutenc¸ãodoestado
indiferenciado das CTMsquegarantemasua
pluripotenci-lidade eautorrenovac¸ão foramidentificadas. Esse éo caso
Célula epitelial
A
B
Condrócito
Condrócito
Go/G1
G2/M
Fase S
Células (n
úmero)
Células (n
úmero)
Conteúdo DNA (fluorescência)
Colágeno do tipo 2
Proteoglicano
Ácido hialurônico
Agregado de proteoglicano componente da matriz
Proteina de ligação H2O
Composição da cartilagem articular Conteúdo DNA (fluorescência)
Figura1–Comparac¸ãoentreociclocelulardeumacélulaepitelialeodeumcondrócitoavaliadoporcitometriadefluxo. (A)EmumtecidoepitelialserãoencontradascélulasnasfasesG0/G1,SeG2/M,enquantoquenotecidocartilaginosoos condrócitosestarãonasuaextensamaiorianafaseG1.Somenteoscondroblastosoriundosdopericôndrioapresentarão ciclocelularcompleto.(B)Ocondrócitos,umavezquesejaformado,geralmenteestáagrupadoemcercadeoitocélulasque secretamconstantementeamatrizextracelular,compostaprincipalmenteporcolágenodotipo2,proteoglicanoeácido hialurônico.
quantoemcamundongos.9 Quando essa proteína deixade
ser expressa indica que a célula entrou no processo de
diferenciac¸ão.10
Para induzir a diferenciac¸ão condrogênica as CTMs são cultivadassem apresenc¸a de soro fetal ouadulto (de ori-gemanimalouhumana),quegeralmenteéusadoparanutrir as células, e sob exposic¸ão ao fator de crescimento b3.11
Assim,ascélulasdesenvolvemumamulticamadacommatriz
extracelular rica em proteoglicanas. Em culturas de 10 a
14 dias, as células passam a produzir colágeno do tipo 2, característicodacartilagemarticular.Alémdisso,apresentam marcadoresdesuperfíciepositivosparacondrócitoselacunas celularestípicasvisíveisàmicroscopiaótica.Oscondrócitos
permanecem viáveisaté cerca de 90 dias após o início da
diferenciac¸ão.12
Ainduc¸ãodacondrogêneseéfeitapormeiodousode diver-sasmoléculasindutoras,especialmentepelasuplementac¸ão
do meio de cultivo com TFN-3, IGF-1, BMP-2 e BMP-6. A
confirmac¸ãodainduc¸ãodacondrodiferenciac¸ãoéfeitapela identificac¸ãodemarcadorescomocolágeno2,Sox-9e agre-canviaanálisedaexpressãodegenesportécnicadereac¸ãoem cadeiadapolimerase(PCR,doinglêspolymerasechainreaction) quantitativaemtemporeal.
Além da regulac¸ão diferencial da expressão gênica, a
metilac¸ão é uma modificac¸ão epigenética que geralmente
silenciados. Esse processo émediado pelas enzimas
DNA--metilases (DNMTs). Genestambém podem sersilenciados
via processo de acetilac¸ão, que impede que as histonas
fiquemrelaxadasassimqueoDNAfiqueexpostoàregulac¸ão transcricional.13
Adesão
e
movimento
celular
e
a
produc¸ão
de
moldes
(
scaffolds
)
Aolongodaembriogênese,ascélulas,alémdoprocessode diferenciac¸ão,necessitammigraroucresceremdirec¸ãoaum
localespecíficoealipermaneceremparaodesempenhode
suasfunc¸ões.Eventos deadesãoemovimentocelular, que
ocorremporsinalizac¸õesquímicaseespaciais,sãode vital importânciaporunircélulasindividuaisemumformato tri-dimensional,talcomonostecidoseórgãoscorporais.
Osmecanismosdeadesãocelularsãoaltamenteregulados aolongodamorfogênesetecidual.Afosforilac¸ãoreversívelpor meiodaproteínaquinaseC(PKC)éumeventochavenaadesão emigrac¸ãocelularduranteacondrogênese.14
Aadesãoeomovimentocelulartambémestão relaciona-doscom aconstituic¸ão arquitetônicadostecidose órgãos. EstudosinvitromostramqueasCTMsrespondemaoformato
doseu ambienteeinvivocélulas tambémsão induzidasà
diferenciac¸ãopelascaracterísticastopográficasdotecidoem queestão dispostas.Tais evidênciasimpulsionaram aárea deengenhariadetecidosquecombinaterapiacelularcomo
usodebiomateriais(moldes,tambémconhecidospela
pala-vra inglesa scaffold). Essa área envolve o uso de materiais
compatíveisebiodegradáveisqueatuamcomomatrizpara
ocrescimentocelular.Osscaffoldsnadamaissãoquesuportes nosquaisascélulassãocultivadasparaconstruirumtecido invitro.
Aestruturadoscaffold,alémdefornecersustentac¸ão mecâ-nicaeorientac¸ãoespacialparaocrescimentoeadiferenciac¸ão celular,devepermitir otransporte denutrientes, metabóli-tos,fatoresde crescimentoeoutrasmoléculas regulatórias importantesparaascélulaseparaamatrizextracelular.Os scaffoldspodemserproduzidosapartirdemoléculasnaturais
ou sintéticas. Entre os biomateriais naturais
encontram--se o colágeno, o ácido hialurônico, a hidroxiapatita e os glicosaminoglicanos.15
Aproduc¸ãode scaffoldsporeletrospinningproduzmoldes
formadosporfibras que conseguemmimetizarfisicamente
umamatrizextracelularnatural.Essacondic¸ãocriaum micro-ambienteadequadoparaadiferenciac¸ãocelularetecidual. Acriac¸ão das fibras de diferentes diâmetros por eletrospin-ningéfeitaapartirdousodesoluc¸õespoliméricasaplicadas aum campomagnético.O poliácidoláctico-co-ácido
glicó-lico(PLGA)éumpolímeroquetemsidoamplamenteusado
naproduc¸ãodescaffoldsporelectrospinning,porqueé biode-gradável, bioabsorvível e biocompatível. O uso de scaffolds
à base de PLGA já foi aprovado para seres humanos pela
agênciaregulatória americana Food and Drug Administration (FDA).Investigac¸õesmostraramqueessebiomaterial conse-gueinduzirocrescimentodediferentestiposdecélulas,como fibroblastos,osteoblastosecondrócitos.16
Outra tecnologia derivada do electrospinning é o
bio--electrospinning, que usa o processamento de suspensões
celularesque sãosubmetidas aum campoelétricode alta
intensidade e induzidas a passar por uma agulha fina, o
quegerapequenasgotículasquecontêmascélulas.Assim,
o scaffold é construído já com as células integradas. Essa
técnica permiteumadistribuic¸ãohomogêneadasCTMs no
molde e, portanto, um maior potencial regenerativo.15 Se
considerarmosacapacidaderegenerativalimitadadotecido cartilaginoso,amescladebiomateriaisecélulas-troncoparece seraopc¸ãomaispromissora,aindaquehajanecessidadede estudoscomplementaresdeeficáciaeseguranc¸a.
Apoptose
e
inflamac¸ão
na
degenerac¸ão
e
regenerac¸ão
da
cartilagem
Célulastêm acapacidadedeautorregularnãosóataxa de
proliferac¸ão ediferenciac¸ão, mastambém asuamorte em
muitassituac¸ões,apartirdeumeventoconhecidocomo apop-toseoumortecelularprogramada.Aocontráriodanecrosee
da autofagia,aapoptose éummecanismoaltamente
coor-denadoequenãocausaprocesso inflamatórioespecífico.17 Entretanto,evidênciasmostramqueprocessosinflamatórios crônicosinduzemadesorganizac¸ãodamatrizextracelulare
apoptose doscondrócitos,o queleva,consequentementeà
destruic¸ãodacartilagem.Issoocorreemmuitasdoenc¸as dege-nerativas,comoaartritereumatoideeaosteoartrite.18
Sabe-se queosmonócitos/macrófagos sãocomponentes
essenciaisdosistemaimuneinatoetêmumagrande
vari-edade defunc¸ões. Elescontrolamoinícioearesoluc¸ão da inflamac¸ãopormeiodafagocitose,liberac¸ãodecitocinas infla-matórias,espéciesreativasdeoxigênio(EROs)eativac¸ãodo sistemaimuneadquirido.Sobcircunstânciasnormais, monó-citoscirculamnacorrentesanguíneaporcurtoperíodoantes deentrarespontaneamenteemapoptose.Apresenc¸ade
fato-res estimulatóriosinibe a apoptose dos monócitos, quese
diferenciam emmacrófagos, osquaispodem viverporum
longoperíodonostecidos.19,20
Os macrófagosproduzem muitassubstâncias relevantes
à resposta imunológica e que coordenam o processo de
inflamac¸ão(citocinasinflamatóriasIL-1,IL-6,TNF␣ea cito-cina anti-inflamatóriaIL-10).Alémdisso, produzemfatores quesãocríticosnocombateamicrorganismos,comoos meta-bólitosdooxigênioeóxidonítrico,fatoresquepromovemo reparotecidual,comoofatordecrescimentodefibroblasto, entreoutros.21 Hojesãoreconhecidosdoistiposdeativac¸ão dosmacrófagosnarespostainflamatória:a“ativac¸ãoclássica” ea“ativac¸ãoalternativa”(fig.2).
Nesseprocesso,quandoocorreumaumentodaativac¸ão
dosmacrófagos M1emrelac¸ãoaosmacrófagos M2,haverá
umreparotecidualdeficientecomdestruic¸ãocontinuadaem tecidoscombaixacapacidaderegenerativa,comonocasoda cartilagem.
Naosteoartrite,aocorrênciadeinflamac¸ãointra-articular
com sinovite indica que o líquido sinovial pode ser a
origem das citocinas inflamatórias e das enzimas
Antígeno + células natural-killers
Interferon gama
(INFy) Monócito
Via clássica Via alternativa 2
1
3
Macrófagos M1 Macrófagos M2 Regeneração
tecidual Fagocitose
dano tecidual
4 IL-10
IL-1B IL-10 TNFa
Figura2–Macrófagosativadospelaviaclássicaparticipamcomoindutoresdainflamac¸ãoesãodenominadosM1.Esses macrófagosproduzemníveiselevadosdeIL-2ebaixosníveisdeIL-10.Estudostambémtêmmostradoqueaativac¸ãode macrófagosdependedoestímulodecitocinasinflamatóriasproduzidasporlinfócitosauxiliaresoucélulasNK,emespecial ointerferongama(INF␥).Osmacrófagosativadosquetêmatividademicrobianaetumoricidasãocaracterizadospor secretargrandesquantidadesdecitocinasemediadorespró-inflamatórios.Nessarespostainflamatóriaessesmacrófagos liberamcitocinaspró-inflamatórias,comoIL-1,IL-6,TNF␣,etambémproduzemespéciesreativasdeoxigênio(EROs),como oânionsuperóxidoeoperóxidodehidrogênio,bemcomointermediáriosreativos,comooóxidonítrico.Logoapóso processodefagocitoseosmacrófagosmorrempormortecelularprogramada,conhecidacomoapoptose.A“ativac¸ão alternativa”envolveoestímulodemacrófagospormoléculascomoasinterleucinasIL-4eIL-13quelevaaoaumentonos níveisdecitocinaanti-inflamatóriaIL-10equeinduzoreparotecidual(respostaanti-inflamatória).Noorganismoa respostaimunológicapró-inflamatóriageralmenteéseguidapelarespostaimunológicaanti-inflamatória.Elaéimportante paraquehajareparotecidualapósumainfecc¸ãomicrobianaouumainjúriafísica.Odesbalanc¸oentreasduasrespostas podegerardoenc¸ascrônicas,comoaosteoartrite.
quedegradamamatriz,oqueresultanadestruic¸ãoda
carti-lagem.Outrasmoléculastambémpodemestarenvolvidasna
apoptosedoscondrócitos,taiscomoMIL-1eTNF␣,pormeio doaumentodaliberac¸ãodeóxidonítrico,eaprostaglandina E2(PGE2).18
AindaqueexistamCTMsnostecidosarticulares,na mem-branasinovial,notendãoenacartilagemarticular,ainduc¸ão dessas células para regenerar o tecido cartilaginoso ainda
não foi totalmente elucidada. Sabe-se que o processo de
condrogênese é desencadeado por fatores como proteínas
morfogenéticas do osso (BMPS) e fatores de crescimento,
como o TGF-. Esses fatores agem sobre genes, como o
fatordetranscric¸ãoSRY-box9(Sox9),queéessencialparaa diferenciac¸ãodoscondrócitos.OSox9controlaatranscric¸ão
de genesque sintetizammoléculas da matriz extracelular,
comoocolágenodotipo2eoagregan,aomesmotempoem
quetambémsuprimemaformac¸ãodecondrócitos hipertrófi-cos.
Processos inflamatórios crônicos parecem influenciar
negativamenteadiferenciac¸ãodasCTMsemcondrócitos.No caso,acitocinaIL1eoTNF␣atêmefeitosupressorda
con-drogênese. Issoporque essas citocinas inibem a expressão
dogeneSox9viasupressãodaexpressãodamoléculaTFG-
(umimportantefatordeiniciac¸ãonadiferenciac¸ãodos
con-drócitos) e o aumento na expressão da molécula Smad7
(inibitóriadacondrogênese).AcitocinainflamatóriaIL-17,que
éumamolécula-chaveemprocessosdeinflamac¸ãocrônica,
tambémtemacapacidadedesuprimiracondrogênese.Essa
moléculasuprimeafosforilac¸ãodaproteínaSox9eimpedea ac¸ãoregenerativadela.22
Portanto, se considerarmos o conjunto das evidências
sobreoimportantepapeldainflamac¸ãocrônicanoprocesso
regenerativo dacartilagem,ficaclaroqueemumambiente
inflamatóriocom níveiselevadosde IL-1, TNF␣ eIL-17as
CTMspoderãonãoresponderadequadamenteàterapia
rege-nerativa.Issoporqueessascélulaspoderãoserinduzidasà apoptoseantesmesmodesediferenciaremcondrócitos.
Aplicac¸ões
clínicas
de
células-tronco
na
regenerac¸ão
do
tecido
cartilaginoso
Muitos estudospré-clínicoseclínicosqueenvolvem poten-cialregenerac¸ãodacartilagemcomCTMssãoconduzidospara diversasdoenc¸as,incluindoaosteoartrite.Apesardeousode CTMsparaaregenerac¸ãodacartilagemestaraindaemnível depesquisa,existemquestõesimportantesaseremresolvidas paratornaressaterapêuticaeficazesegura.
Aimplantac¸ãodecondrócitosdeumaregiãodocorpopara
aregiãolesionadatemcomodesvantagemanecessidadede
Pacientes elegíveis = 22
18 pacientes alocados para
injeção intra-articular de CTMS (IIA-CTM)
09 alocados para fase 1
03 IIA-CTM dose baixa
03 IIA-CTM dose moderada
03 IIA-CTM dose alta
12 IIA-CTM dose alta
03 IIA-CTM dose alta
Seguimento: 6 meses Seguimento:
6 meses Seguimento:
6 meses Seguimento:
6 meses
09 alocados para fase 1
Figura3–DelineamentoexperimentalgeraldoestudoconduzidoporJoetal.33(2014)queavaliou,pormeiodeumensaio
clínico(FaseI/II),oefeitodainjec¸ãointra-articulardejoelhonaregenerac¸ãodacartilagemdepacientescomosteoartrite. AsCTMsforamobtidasapartirdelipoaspiradoabdominal,cultivadasemlaboratórioeintroduzidasnaarticulac¸ãoapós trêssemanas.Dosebaixa=1×107;dosemoderada=5×107;dosealta=1×108célulasemsoluc¸ãosalina.Ospacientes
foramdescontinuadosemrelac¸ãoàterapiafarmacológica,comexcec¸ãodaadministrac¸ãodecetoprofeno.
serimplantadatambém éoutrograndeproblema,poistais
célulaspodemsedesdiferenciareproduzirfibrocartilagem,e nãocartilagemhialina.23–26
Natentativademinimizaressesproblemas,alguns auto-rescomec¸aramapesquisaroefeitodainjec¸ãointra-articular
deCTMs notratamentoda osteoartrite. Esseprocedimento
aparentementetrazmuitasvantagens,jáquepoderiaevitar omanejocirúrgicoemmuitoscasos.27–32Entretanto,somente em2014foipublicadoporJoetal.33oprimeiroensaioclínico faseI/IIparaavaliaraeficáciaeaseguranc¸adainjec¸ão intra--articulardejoelhonaregenerac¸ãodacartilagemarticularpor meiodeanálisesclínicas,radiológicas,artroscópicase histo-lógicas(fig.3).
AsCTMsinjetadasforamobtidasde lipossucc¸ãoda gor-duraabdominalsubcutâneaeasCTMsobtidasforamtestadas quantoasuaviabilidade,suapureza(comavaliac¸ãodos
mar-cadores CD31, CD34,CD45), suaidentidade (com avaliac¸ão
dosmarcadoresCD73,CD90),esterilidadeenãocontaminac¸ão
comendotoxinasoumicoplasmas.
Osprocedimentosparaainjec¸ãointra-articularforam fei-tosnaposic¸ãosupinaecomanestesiaespinhaldepoisdetrês semanasemquefoi feitaalipossucc¸ão.Um exame artros-cópicopadrão foifeitono joelhoeas lesõesda cartilagem
articularforam medidas comumasonda artroscópica
cali-bradaegraduadadeacordocomaclassificac¸ãodelesõesda cartilagem da International CartilageRepair Society (ICRS). As
CTMs diluídasemsoluc¸ãosalina foram injetadassem que
fossefeitodebri, sinovectomia oumeniscotomia duranteo procedimento.Nãoforamrelatadosefeitosadversosgravese aqualidadedacondic¸ãodojoelhoavaliadapormeiodo Wes-ternOntarioandMcMasterUniversitiesArthritisIndex(Womac)
melhorou significativamente nos pacientes que receberam
alta concentrac¸ão de CTMs intra-articular. O tamanho do
defeito da cartilagem diminuiu nos côndilos medial
femu-raletibialetambémnosgruposquereceberamdosesaltas deCTMs.Assim,osautoresconcluíramqueainjec¸ão intra--articularde1×108célulasmelhorouafunc¸ãodojoelhocom osteoartriteeadornojoelhosemcausarefeitosadversosvia reduc¸ãodosdefeitosdacartilagempelaregenerac¸ãodetecido similaràcartilagemhialina.
Considerac¸ões
finais
Apesar de osresultados de Joetet al.33 serem animadores, Kondo etal.,18 na suarevisãosobreotema, salientam que resultadosdeestudosadicionaisqueenvolvemvários proto-colossãonecessáriospararealmentesecomprovaraeficácia e a seguranc¸adesse procedimento. Além disso, esses
últi-mos autorescomentamquesãofeitas outrasinvestigac¸ões
voltadas paraa melhoria da eficiênciada diferenciac¸ão de
CTMsemcondrócitospormeiodaanálisedasuplementac¸ão
domeiodeculturacomváriasmoléculasregulatórias,como incluindoTGF-1–3;BMP-2,-4,-6,-7;FGF-2,IGF-1etc.Além
desses,algunscompostos,comoadexametasonaeoATP,já
mostraramac¸ãopositivasobreacondrogênese.
Outraquestãoimportantedizrespeitoàscondic¸ões micro-ambientaisinflamatóriasdolocalemquevãoserinjetadasas
CTMs.EvidênciasmostramqueasCTMstêmefeitos
Nessecaso,oqueestáemabertoeprecisaserexploradoem estudosfuturossãooquantomodificac¸õesnopróprio ambi-enteinflamatórioarticularpoderiaminduziradiferenciac¸ão deCTMsjáalocadasnaquelaregião.Arespostaaesse
questi-onamentopoderiaconduziraodesenvolvimentodetécnicas
regenerativasassociadasàstécnicascirúrgicasjábem esta-belecidas,semnecessidadedetransplantedeCTMsdeoutras partesdocorpo.Porém,seconsiderarmosacomplexidadedos eventosrelacionadosàcondrogêneseeaoreparoda cartila-gem,ocaminhoaindaélongoesefaznecessáriaumagrande
quantidadedepesquisascomplementares.
Conflitos
de
interesse
Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.
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