D IAGNÓSTICO MOLECULAR DAS ESPÉCIES E NTEROCYTOZOON BIENEUSI ,

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As tecnologias de biologia molecular, em especial a PCR, descrita pela primeira vez em meados dos anos 80 por Saiki e colaboradores [Saiki et al. 1985]têm vindo a ganhar um relevo crescente no âmbito das técnicas de diagnóstico clínico e epidemiológico nas várias vertentes da parasitologia Médica e Veterinária. A simplicidade, rapidez e economia, permitindo a obtenção de um largo número de cópias de DNA a partir de quantidades diminutas de ácidos nucleicos, mesmo em presença de DNA de baixa qualidade, são características que tornam a PCR um instrumento de trabalho particularmente aliciante relativamente às técnicas convencionais.

A técnica de PCR baseia-se no desenho de primers específicos em regiões genómicas conhecidas e em protocolos criteriosamente estabelecidos. Sumariamente, a PCR consiste num método in vitro para a síntese enzimática de sequências específicas de DNA, utilizando um par de oligonucleótidos iniciadores (primers) que flanqueiam a região de interesse no DNA alvo em locais opostos das cadeias complementares. A amplificação exponencial do fragmento específico, cujas terminações são delimitadas pelas extremidades 5’ dos primers resulta de uma série de ciclos repetitivos, incluindo a desnaturação do DNA a temperaturas elevadas (91-97 ºC), a hibridação (annealing) dos

primers a temperaturas mais baixas (45-65 ºC) e a extenção destes pela DNA

polimerase (68-73 ºC) [Sachse & Frey 2003].

O sucesso de qualquer técnica de PCR em termos de sensibilidade e especificidade é determinado por diversos factores críticos, como a concentração de Mg2+_{, os}

desoxirribonucleótidos (dNTPs), a polimerase na mistura de reacção, as condições de amplificação e, sobretudo, pelo desenho dos primers.

Para os microsporídios no geral, e em particular, para os potencialmente patogénicos para o homem, é reduzido o número de sequências genéticas conhecidas, acessíveis para aplicação das técnicas de biologia molecular.

II. MATERIAL E MÉTODOS

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A região genómica que codifica para o RNA dos ribossomas contém genes funcionais e conservados em termos evolutivos separados por regiões não codificantes e por regiões intergénicas que ligam as diferentes unidades genicas. O espaço entre regiões codificantes dos genes rRNA (ITS) é particularmente útil para a discriminação dos organismos ao nível da espécie e do género, porque a taxa de acumulação de mutações nesta região aproxima-se muitas vezes da taxa de especiação, razão pela qual muitas das estratégias de identificação e caracterização molecular, por PCR, dos microsporídios se baseiam na amplificação desta região do genoma [Weiss & Vossbrinck 1999]. A informação genética disponível para a maioria dos microsporídios corresponde às sequências do gene da SSU rRNA. Por outro lado, também a caracterização intra-específica, só é possivel para algumas espécies de microsporídios, devido à existência de um número limitado de marcadores genéticos: a região ITS

rRNA, pode apresentar desde um elevado grau de polimorfismo, como o que se verifica

na espécie E. bieneusi, ou não ser detectada qualquer variabilidade genética como se encontra descrito para E. intestinalis.

No presente estudo, após pesquisa bibliográfica, o diagnóstico molecular das espécies de microsporidia em estudo consistiu na amplificação e detecção de um segmento de DNA específico (SSU rRNA ou fragmento contendo uma região parcial da

SSU, a totalidade da ITS e, uma região parcial da LSU rRNA), através das técnicas de

PCR e PCR nested, após extracção do DNA genómico do microrganismo. Em termos práticos a PCR nested consiste numa primeira reacção com um par de primers iniciais, cujo amplicão constituirá o DNA molde para uma segunda reacção PCR a realizar com

primers desenhados para o interior da sequência inicialmente amplificada; técnica mais

sensível e específica comparativamente à PCR simples.

As reacções de PCR, efectuadas no presente estudo, sofreram alguns ajustes, em relação ao descrito pelos autores referenciados, nomeadamente, ao nível da temperatura de ligação, dos tempos de ligação e de extensão, da concentração de cloreto de magnésio (MgCl2) e de primers e/ou da concentração da enzima DNA polimerase.

Para cada gene estudado, foram seleccionados três isolados pertencentes a cada uma das espécies de microsporídios identificadas, nos quais, para confirmação do

II. MATERIAL E MÉTODOS

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resultado da análise da PCR, se procedeu à sequenciação dos fragmentos amplificados por este método.

5.1. AMPLIFICAÇÃO DE DNA GENÓMICO DE MICROSPORÍDIOS NO GERAL

A identificação, pela técnica de PCR, de microsporídios no geral, onde se incluem as quatro principais espécies patogénicas para o homem, é baseada na amplificação do gene que codifica o RNA da pequena subunidade do ribossoma (SSU rRNA). Para a identificação molecular de isolados de microsporídios, de amostras em que houve detecção parasitológica de esporos, mas em que não foi possível, a amplificação pelas outras técnicas de PCR adoptadas neste estudo, foram utilizados os seguintes primers, previamente descritos [Raynaud et al. 1998] e designados na literatura, por pan- específicos, por permitirem a detecção de diversas espécies de microsporidia (Quadro XXII)

Quadro XXII. Sequências dos primers pan-específicos utilizados na amplificação do

gene SSU rRNA de microsporídios por PCR, e suas características (dimensão do oligonucleótido, temperatura de hibridação, designada por TA, conteúdo em GC e

tamanho do fragmento de amplificação para as quatro espécies mais frequentes infectantes para o homem).

PRIMERS SEQUÊNCIA (5’→3’) DIMENSÃO

(pb) GC (%) Ta (ºC) AMPLICÃO (pb) C1 CACCAGGTTGATTCTGCC 18 56 50 Eb 1170 C2 GTGACGGGCGGTGTCTAC 18 67 55 Ec 1190 Eh1205 Ei1186

As reacções de amplificação dos genes ribossomais, foram realizadas num volume final de 25 μl, contendo, a mistura de amplificação 1× tampão de reacção (16 mM (NH4)2SO4, 67 mM Tris-HCL [pH 8,8], 0,01% tween-20; Bioline), 0,8 mM de uma

mistura de dNTPs (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) (Applied Biosystems), 0,2 μM de cada

primer (C1 e C2; MWG Biotech), 2,5 mM de cloreto de magnésio (MgCl₂) (Bioline),

0,75 U de BiotaqTM _{DNA polimerase (Bioline), 0,01 μg/μl de albumina sérica bovina}

II. MATERIAL E MÉTODOS

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DNA genómico, obtido após extracção pelo método do FastDNA® _{SPIN Kit for Soil, e}

água desionizada estéril, para perfazer o volume final da reacção. Em cada reacção de PCR foi incluído um tubo com uma amostra de DNA de microsporídio em condições óptimas de qualidade e concentração, para funcionar como controlo positivo da mistura reaccional, e um controlo negativo, como indicador da inexistência de contaminação por DNA exógeno onde, no lugar do DNA, foi adicionada água desionizada estéril.

As reacções de amplificação foram realizadas num termociclador (T1 Thermocycler; Biometra) tendo, em todas elas, o passo de desnaturação inicial sido a 95 ºC durante 10 minutos e o de extensão final a 72 ºC durante 10 minutos. No Quadro XXIII encontram-se descritas as restantes condições de amplificação para o locus estudado.

QUADRO XXIII. Condições de amplificação do DNA, para o gene da SSU rRNA.