Microscopia óptica

O exame histológico de biópsias, ou por citologia de fluídos corporais e de fezes, por microscopia óptica, permite o diagnóstico dos vários quadros clínicos da microsporidiose mas, na grande maioria dos casos, é muito difícil a identificação da espécie ou do género dos microsporídios.

5.2.2.1.Exame histológico ao microscópio óptico

As reduzidas dimensões dos organismos, bem como a escassez de resposta inflamatória dos tecidos infectados, tornam difícil a detecção dos microsporídios por microscopia óptica. A sua visualização depende de um contraste entre os esporos e os restantes constituintes celulares.

Os parasitas, em tecidos corados pela hematoxilina-eosina, passam despercebidos, mesmo a patologistas experientes [Didier 1998; Weber et al. 1999b; Franzen & Muller 1999b].

Em contrapartida, nas colorações Gram e Warthin-Starry modificado, os esporos exibem a propriedade de birrefracção, que os diferencia de outras inclusões intracelulares. As colorações Brown-Brenn ou Brown-Hopps, aparentam alguma utilidade na identificação de microsporídios em secções de tecido embebidas em parafina [Lamps et al. 1998; Franzen & Muller 1999b], corando os esporos maduros de Gram-positvo. Os esporos de vermelho tendem a ser os imaturos [Garcia 2002].

Técnicas de coloração fluorescente com branqueadores ópticos são rápidas e fáceis de efectuar em tecidos, apresentando elevada sensibilidade e podendo ser combinadas com outros métodos de coloração [Franzen et al. 1995a; Franzen & Muller 1999b].

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A coloração de tecidos com o tricrómio modificado-Cromotrope 2R, ou a Warthin-Starry são utilizadas, também, embora ambas as técnicas sejam demoradas e de difícil interpretação [Weber et al. 1992c; Fedorko & Hijazi 1996].

Secções semifinas de material de biópsia, embebidas em resina, coradas com uma vasta gama de corantes (hematoxilina-eosina, Giemsa, azul de toluidina, fucsina básica), são métodos úteis para a visualização dos microsporídios, não sendo contudo usados por rotina, na maioria dos laboratórios [Franzen & Muller 1999b]. Na Figura 7 podem ser observados esporos de microsporídios corados pela técnica do calcoflúor e do Gram-Chromotrope.

5.2.2.2.Diagnóstico citológico e exame de fezes.

A identificação dos microsporídios pela microscopia óptica, em amostras obtidas por processos não invasivos, tem constituído um forte desafio aos investigadores. Os esporos de microsporidia podem ser detectados em diversos fluídos corporais e em amostras de fezes [van et al. 1994a; Weber et al. 1999b].

A parede dos esporos é constituída por uma camada externa (exosporo) proteinácea e por uma camada interna (endosporo) quitinosa. Várias colorações, tais como, Gram, Giemsa, tricrómio ou fluorescentes têm sido experimentadas na coloração dos microsporídios. No diagnóstico citológico, as colorações por Giemsa (ou por Gram

B

Figura 7. (A) Fotografia de esporos de E. cuniculi em esfregaço de secreção pulmonar,

corados pela técnica do calcoflúor; (B) Fotografia de esporos de E. intestinalis, em esfregaço de cultura, corados por Gram-Chromotrope. (×1000). Originais de autora.

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não são apropriadas, visto que não permitem a distinção entre os microsporídios e outros microrganismos presentes nas amostras de produtos biológicos (i.e. enterobactérias, com tamanho, forma e características de coloração semelhantes aos microsporídios) [Fedorko & Hijazi 1996; Weber et al. 1999b]. Só após o desenvolvimento de colorações especiais fluorescentes ou baseadas no reagente chromotrope 2R tornou-se rotineiro o exame microscópico de fluídos corporais para o diagnóstico dos microsporídios.

5.2.2.2.1.Coloração pelo tricrómio modificado.

A técnica de tricrómio modificada, desenvolvida por Weber e colaboradores [Weber et al. 1992a], é o método mais comum, utilizado nos laboratórios de diagnóstico para a detecção de microsporídios em fezes, urina e muco [Didier 1998; Sparfel et al. 1998; Amato et al. 1999; Weber et al. 1999b]. A modificação à técnica de tricrómio consiste em decuplicar a concentração de chromotrope 2R, um dos componentes da solução do tricrómio. Os esporos de microsporídios, observados com uma ampliação

1000, apresentam a sua parede celular corada de rosa, e nalguns pode ver-se uma cinta rosada que divide os esporos, diagonalmente ou equatorialmente [Weber et al. 1992a]. As leveduras podem corar de um modo semelhante, mas distinguem-se dos microsporídios, por serem de maiores dimensões e corarem mais intensamente. As bactérias que coram com a mesma cor, podem-se distinguir dos microsporídios, pela forma não oval (coco ou bastonete), e pela coloração homogénea que apresentam [Weber et al. 1992a].

Esta técnica tem como desvantagens ser lenta e apresentar dificuldades na detecção dos esporos se estes se encontrarem em pequeno número na amostra. Todavia, algumas modificações implementadas por vários autores, como alterações na temperatura e no tempo de coloração [Kokoskin et al. 1994; Didier et al. 1995a], decréscimo no nível de ácido fosfotúngstico e substituição do contracorante [Ryan et al. 1993] têm como propósito acelerar o processo e proporcionar um melhor contraste entre os esporos e o fundo.

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5.2.2.2.2.Coloração pelo Gram - Chromotrope

Moura e colaboradores [Moura et al. 1997], desenvolveram a técnica Gram- Chromotrope a quente, com vantagens acrescidas na coloração dos microsporídios para microscopia óptica. Neste método, as amostras são coradas em soluções de violeta de cristal e iodo, usadas na coloração Gram e, ainda, pela solução do tricrómio modificado, aquecida entre os 50 ºC a 55º C. O tempo de duração da técnica fica reduzido apenas a cinco minutos.

Os esporos de microsporídios, ficam, então, corados de violeta escuro sobre um fundo verde claro. A solução Chromotrope, realça a cinta que rodeia habitualmente o esporo, e ajuda a minimizar a coloração gram-variável, que algumas espécies de microsporídios apresentam, quando coradas com a coloração Gram (Figura 7).

5.2.2.2.3.Coloração por fluorocromos

Para a detecção de microsporídios na urina, fezes ou muco, podem ser usados agentes quimiofluorescentes, sendo o Uvitex 2B, calcoflúor e o fungifluor (formulação de Calcoflúor em 10% de KOH), os corantes de primeira linha [Conteas et al. 1996; Didier 1998; Goodgame et al. 1999; Franzen & Muller 1999b; Weber et al. 1999b]. Os fluorocromos possuem elevada afinidade para a camada quitinosa (endosporo) do esporo, sendo estes identificados pelo seu tamanho, forma e características de fluorescência (halos ovais azul turquesa brilhantes sob luz ultravioleta) [Weber et al. 1999b] (Figura 7). Por vezes, verifica-se uma intensidade variável da coloração dos esporos, presentes numa amostra, brilhando uns mais do que os outros [Luna et al. 1995]. A metodologia desta técnica é fácil e rápida, mas o exame requer um microscópio de fluorescência com um filtro de excitação com comprimentos de onda entre os 350-380 nm e, ainda, de lentes potentes com objectiva de 1000. Estes métodos com fluorocromos, são descritos nalguns estudos como sendo mais sensíveis do que os que utilizam o tricrómio, no entanto podem corar leveduras, dando origem a falsos positivos [Weber & Bryan 1994; Luna et al. 1995; DeGirolami et al. 1995; Chioralia et

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al. 1998; Weber et al. 1999b; Matos et al. 2002]. Todavia, existem outros estudos, que

não corroboram estes resultados [Didier et al. 1995a; Ignatius et al. 1997]. Num aspecto, vários autores estão de acordo, as duas técnicas devem ser utilizadas simultaneamente, de forma a potenciar o diagnóstico correcto, especialmente nos produtos biológicos com baixa carga parasitária [DeGirolami et al. 1995; Didier et al. 1995a; Ignatius et al. 1997].

A concentração dos fluídos corporais torna-se necessária, dado, por vezes, o pequeno número de microsporídios nas amostras biológicas. As técnicas de concentração, para detecção dos esporos de microsporídios, geram alguma polémica. Alguns autores observaram que técnicas de concentração, tais como a concentração com acetato de formalina-éter ou diferentes métodos de flutuação, conduzem a uma perda substancial dos esporos, logo a resultados falso negativos. Outros, porém, verificaram que as técnicas de sedimentação água-éter ou a centrifugação de amostras de fezes tratadas com KOH, aumentavam a possibilidade de identificação dos esporos de microsporídios. Uma destas técnicas de concentração deverá ser, então, aplicada às amostras de fezes [Weber et al. 1999b].