C ONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO Nº CICLOS

Desnaturação 95 ºC, 1 min

40 Ligação 56 ºC, 1 min

Extensão 72 ºC, 1 min

5.2. AMPLIFICAÇÃO DE DNA GENÓMICO DE ENCEPHALITOZOON INTESTINALIS,

ENCEPHALITOZOON CUNICULI,ENCEPHALITOZOON HELLEM.

A identificação, pela técnica de PCR, das espécies E. intestinalis, E. cuniculi e E.

hellem, é baseada na amplificação do gene que codifica o RNA da pequena subunidade

do ribossoma SSU rRNA. Para a identificação molecular ao nível da espécie, foram utilizados os seguintes primers: SINTF1/SINTR1, específico para E. intestinalis [Visvesvara et al. 1995; da Silva et al. 1997]; ECUNF/ECUNR específico para E.

cuniculi [Visvesvara et al. 1994]; EHELF/EHELR específico para E. hellem

II. MATERIAL E MÉTODOS

- 140 -

Quadro XXIV- Sequências dos primers utilizados na amplificação do gene SSU rRNA

de E. intestinalis, E. cuniculi e E. hellem, por PCR, e suas características (dimensão do oligonucleótido, temperatura de hibridação, designada por TA, conteúdo em GC e

tamanho do fragmento de amplificação).

PRIMERS SEQUÊNCIA (5’→3’) DIMENSÃO

(pb) GC (%) Ta (ºC) AMPLICÃO (pb) SINTF1 TTTCGAGTGTAAGGAGTCGA 20 45 50 ₅₂₀ SINTR1 CCGTCCTCGTTCTCCTGCCCG 21 71 62 ECUNF ATGAGAAGTGATGTGTGTGCG 21 48 52 ₅₄₉ ECUNR TGCCATGCACTCACAGGCATC 21 57 66 EHELF TGAGAAGTAAGATGTTTAGCA 21 33 47 ₅₄₇ EHELR GTAAAAACACTCTCACACTCA 21 38 49

A técnica de PCR comporta determinadas componentes e condições reaccionais indispensáveis. Assim, por cada amostra, preparou-se uma mistura de amplificação contendo 1x tampão de reacção (16 mM (NH4)2SO4, 67 mM Tris-HCL [pH 8,8], 0,01%

tween-20; Bioline), 0,8 mM de uma mistura de dNTPs (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) (Applied Biosystems), 0,2 μM de cada primer (SINTF1 e SINTR1, ECUNF e ECUNR,

EHELF e EHELR; MWG Biotech), 2,5 mM de cloreto de magnésio (MgCl2)

(Bioline), 0,75 U de BiotaqTM _{DNA polimerase (Bioline), 0,01 μg/μl de BSA (SIGMA),}

entre 2 a 8 μl de DNA genómico, obtido após extracção pelo método do FastDNA®

SPIN Kit for Soil, e água desionizada estéril, para perfazer o volume final de 25 μl. Para monitorizar a qualidade dos resultados, em cada ensaio de amplificação, foram incluídos, um controlo positivo (suspensão de DNA da espécie de microsporídio em estudo) e um controlo negativo (água desionizada estéril), substituindo, nas respectivas reacções, os 2 μl de DNA genómico das amostras. As componentes térmicas da reacção, descritas no QuadroXXV, foram aplicadas num termociclador (T1 Thermocycler; Biometra), onde decorreu a amplificação do DNA.

II. MATERIAL E MÉTODOS

- 141 -

QUADRO XXV. Condições de amplificação do DNA, para o gene estudado.

CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO Nº CICLOS

Desnaturação 95 ºC, 30 seg.

30 Ligação* 55 ºC, 30 seg

Extensão 72 ºC, 1 min

* Para E. intestinalis a temperatura de ligação é de 45 ºC.

5.3. AMPLIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE DNA GENÓMICO DE

ENTEROCYTOZOON BIENEUSI

5.3.1. Amplificação de DNA genómico de Enterocytozoon bieneusi.

A amplificação de um fragmento que contem parte da região SSU, a totalidade da região ITS, e parte da LSU do gene rRNA de E. bieneusi foi efectuada através de PCR nested. No Quadro XXVI encontram-se descritas as sequências dos primers utilizados.

Quadro XXVI. Sequências dos primers (AL4037/AL4039 e AL4038/AL4040)

utilizados na amplificação do fragmento que contem parte da região SSU, a totalidade da região ITS e parte da LSU rRNA, de E. bieneusi por PCR nested e suas características (dimensão do oligonucleótido, temperatura de hibridação, designada por TA, conteúdo

em GC e tamanho do fragmento de amplificação).

PCR PRIMERS SEQUÊNCIA (5’→3’) DIMENSÃO

(pb) GC (%) Ta (ºC) AMPLICÃO (pb) 1ª

Parte AL 4037 GATGGTCATAGGGATGAAGAGCTT AL4039 TATGCTTAAGTCCAGGGAG 24 19 46 47 56 49 410 2ª

Parte AL 4038 AGGGATGAAGAGCTTCGGCTCTG AL4040 AGTGATCCTGTATTAGGGATATT 23 23 57 35 59 50 392

O procedimento de amplificação da região alvo foi efectuado num volume de 50 μl, contendo a mistura reaccional da primeira PCR, 5 μl de 10× tampão de reacção (160 mM (NH4)2SO4, 670 mM Tris-HCl [pH 8,8], 0,1% Tween-20) (Bioline), 1,5 mM de MgCl2 (Bioline), 0,8 mM de uma mistura de dATP, dCTP, dGTP e dTTP (Promega),

II. MATERIAL E MÉTODOS

- 142 -

10 pmol de cada primer (MWG Biotech), 0,02 mg de BSA (SIGMA), 1,5 U de Biotaq™ DNA Polymerase (Bioline), entre 5 a 10 μl de DNA genómico e água desionizada estéril, para perfazer o volume final. A segunda PCR foi realizada com 3 μl do DNA amplificado na primeira reacção, sendo a mistura reaccional igual à primeira, com excepção da BSA, que foi excluída.

Em cada reacção de PCR foi incluído um tubo controlo positivo contendo uma amostra de DNA de E. bieneusi e um controlo negativo (no lugar do DNA, foi adicionada água desionizada estéril) .

As reacções de amplificação foram efectuadas num termociclador GeneAmp

PCR System 9700, tendo, em todas, o passo de desnaturação inicial sido de cinco

minutos a 95ºC e o de extensão final de 10 minutos a 72ºC. No Quadro XXVII estão descritas as restantes condições de amplificação dos fragmentos da região SSU, ITS LSU do rRNA.

Quadro XXVII. Condições de amplificação do DNA, para a região do gene estudado.

CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO Nº CICLOS

Desnaturação 95ºC, 50 seg.

30 Ligação 55ºC, 30 seg

Extensão 72ºC, 30 seg

A amplificação, por PCR, efectuada segundo este procedimento, nas condições já descritas foi utilizada apenas para um grupo de amostras, caracterizadas na Division

of Parasitic Diseases, CDC, Atlanta, EUA, pela autora e que compreendeu 20 isolados

de E. bieneusi de origem humana e 32 de origem animal.

5.3.2 Desenvolvimento e optimização de uma nova técnica de PCR nested

Durante o início do trabalho foram sentidas algumas dificuldades práticas com a primeira técnica de PCR usada para a detecção e amplificação da região ITS do gene

rRNA de E. bieneusi, nomeadamente a nível de sensibilidade e da posterior

sequenciação dos produtos amplificados.

Com o objectivo de ultrapassar estes obstáculos foi desenvolvida uma nova PCR

II. MATERIAL E MÉTODOS

- 143 -

e posterior sequenciação da referida região ITS rRNA, com recurso às diversas sequências descritas para E. bieneusi na base de dados do GeneBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=pubmed) utilizando-se o programa bioinformático Primer 3.0 Program (versão 0.4.0), disponível on-line (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3.cgi). A escolha dos primers para amplificação das regiões de interesse, obedeceu a critérios gerais e empíricos, descritos na bibliografia existente e de programas de desenhos de primers, que incluíram, as dimensões das sequências oligonuclotídicas, as características conservadas das zonas de ligação (annealing), a temperatura de hibridação, o conteúdo CG, a ausência de estruturas secundárias e de dímeros de primers. Estes primers foram desenhados para uma temperatura de hibridação de 61,5ºC, tendo sido sintetizados pela MWG Biotech Quadro XXVIII.

Quadro XXVIII. Sequências dos primers (MLLF1/MLLR1 e MLLF2/MLLR2) utilizados

na amplificação do fragmento que contem parte da região SSU, a totalidade da região

ITS e parte da LSU rRNA, de E. bieneusi por PCR nested, e suas características

(dimensão do oligonucleótido, temperatura de hibridação, designada por TA, conteúdo

em GC e tamanho do fragmento de amplificação).

PCR PRIMERS SEQUÊNCIA (5’→3’) DIMENSÃO

(pb) GC (%) Ta (ºC) AMPLICÃO (pb) 1ª

Parte MLLF1 CGCCCGTCACTATTTCAGAT MLLR1 GCTTAAGTCCAGGGAGTATCCA 20 22 50 50 52 55 514 2ª

Parte MLLF2 AGTCGTAACAAGGTTTCAGTTGG MLLR2 GGACTTTTCGCATTCTTTCG 23 20 43 45 53 50 386

Optimizaram-se as reacções de PCR, para os amplicões, para um volume reacional de 25 μl, contendo 1× tampão de reacção (16 mM (NH4)2SO4, 67 mM Tris-

HCL [pH 8,8], 0,01% tween-20; Bioline), 0,8 mM de uma mistura de dNTPs (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) (Applied Biosystems), 0,2 μM de cada primer (MLLF1 E MLLR1 na 1ª parte; MLLF2 e MLLR2 na 2ª parte; MWG Biotech), 2,5 mM de cloreto de magnésio (MgCl2) (Bioline), 0,75 U de BiotaqTM DNA polimerase (Bioline), 0,01

μg/μl de BSA (SIGMA), 2 μl de DNA genómico, obtido após extracção pelo método do FastDNA® _{SPIN Kit for Soil, e água desionizada estéril, para perfazer o volume final de}

II. MATERIAL E MÉTODOS

- 144 -

25 μl. A segunda PCR foi realizada com 4 μl do DNA amplificado na primeira reacção, sendo a mistura reaccional igual à primeira, com excepção da BSA, que foi excluída.

Em cada reacção de PCR foi incluído um tubo com uma amostra de DNA de E.

bieneusi em condições óptimas de qualidade e concentração, para funcionar como

controlo positivo da mistura reaccional e um controlo negativo, como indicador da inexistência de contaminação por DNA exógeno onde, no lugar do DNA, foi adicionada água desionizada estéril.

As reacções de amplificação foram realizadas num termociclador (T1 Thermocycler; Biometra) e submetidas ao passo de desnaturação inicial a 95 ºC durante cinco minutos e o de extensão final a 72 ºC durante 10 minutos. No Quadro XXIX estão descritas as restantes condições de amplificação para o locus estudado.

Quadro XXIX. Condições de amplificação do DNA, para o gene estudado.

CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO Nº CICLOS

Desnaturação 95ºC, 50 seg.

30 Ligação 55ºC, 30 seg

Extensão 72ºC, 30 seg

A nova metodologia desenvolvida confirmou que os primers desenhados para todo o sistema testado apresentaram uma elevada sensibilidade e especificidade molecular para a amplificação e sequenciação do fragmento com 386pb do DNA alvo de E.

bieneusi permitindo uma adequada detecção e caracterização genética dos isolados

obtidos durante o estudo.

5.3.3. Caracterização génetica dos isolados de Enterocytozoon bieneusi.

A disponibilidade e facilidade de utilização de técnicas de biologia molecular possibilitaram a sua utilização na descoberta e aperfeiçoamento de marcadores moleculares para a caracterização intra-específica.

Até à data, a região ITS rRNA constitui o único marcador genético disponível para a caracterização de genótipos de E. bieneusi. A sequência nucleotídica desta região,