P ROCESSAMENTO E CONCENTRAÇÃO DE AMOSTRAS FECAIS, URINA E SECREÇÕES PULMONARES (EXPECTORAÇÃO INDUZIDA E LAVADOS

BRONCOALVEOLARES)

2.1. AMOSTRAS FECAIS

A pesquisa de microsporídios efectuou-se a partir de fracções de amostras, mais precisamente em 0,5 g de fezes ou conteúdo intestinal. Para a concentração de esporos a partir de amostras fecais ou de conteúdo intestinal, foi adoptado o método modificado de sedimentação água/éter [Matos et al. 2002]. Num tubo de centrífuga cónico, com capacidade de 12,0 ml, foi ressuspendida uma alíquota (0,5 g) de fezes, em 3,0 ml de água desionizada. Após a adição de 3,0 ml de éter dietílico (C4H10O - Merck) e agitação

vigorosa no vortéx, a suspensão foi filtrada através de uma gaze para um novo tubo, com a finalidade de remover os detritos fecais de maior dimensão. Uma vez completado o volume final, com água desionizada, a amostra foi centrifugada a 400  g, durante cinco minutos. Depois de desprezada a fase etérea, o sobrenadante foi retirado para um tubo limpo, perfez-se o volume final com água desionizada e realizou-se nova centrifugação, desta vez a 4.100  g, durante 10 minutos. O sedimento, originado na primeira centrifugação, foi guardado, para posterior pesquisa de ovos, quistos e parasitas. Após a segunda centrifugação, o sobrenadante foi rejeitado e, com o

II. MATERIAL E MÉTODOS

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sedimento resultante, prepararam-se esfregaços, em três lâminas tratadas com poli-L- lisina.

Depois de secarem, à temperatura ambiente, um dos esfregaços era submetido à técnica de coloração Gram-Chromotrope. As lâminas restantes foram conservadas a – 20ºC, para posterior estudo ou para confirmação de algum resultado, caso fosse necessário. Ambos os sedimentos obtidos das duas centrifugações, foram reunidos num mesmo eppendorf de 2 ml e conservados a 4ºC. Todas as centrifugações foram efectuadas à temperatura ambiente. Posteriormente, os sedimentos foram submetidos a uma técnica de extracção de DNA.

2.2.AMOSTRAS DE URINA

As amostras de urina, foram colhidas em recipientes estéreis e enviadas imediatamente para o laboratório da Unidade de Protozoários Oportunistas/VIH e Outras Protozooses, do Instituto de Higiene e Medicina Tropical, onde se iniciou o seu processamento. Da totalidade do líquido, retiraram-se, aproximadamente, 2,0 ml de suspensão, procedendo-se à sua centrifugação a 1500  g, durante 10 min. O sobrenadante foi desprezado e o sedimento foi ressuspenso em 0,5 ml de soro fisiológico. Uma gota, 20-30 l da amostra, foi aplicada com uma pipeta descartável, em três lâminas, tratadas com poli-L-lisina com o cuidado de espalhar em círculo com uma área de 15-20 mm de diâmetro, após o que eram deixadas a secar, à temperatura ambiente. Uma das lâminas era utilizada para posterior observação pela técnica de Gram-Chromotrope e as restantes foram conservadas a –20º C. O restante produto tratado foi conservado a 4º C. Posteriormente, os sedimentos foram submetidos a uma técnica de extracção de DNA.

2.3.SECREÇÕES PULMONARES

O presente estudo compreendeu amostras de secreções pulmonares enviadas para o laboratório da Unidade de Protozoários Oportunistas/VIH e Outras Protozooses, do Instituto de Higiene e Medicina Tropical, cujo objectivo principal, era o diagnóstico da pneumocistose. Ao chegarem ao laboratório, as amostras de secreções pulmonares (EI e LBA), foram identificadas e processadas de imediato. O material biológico foi

II. MATERIAL E MÉTODOS

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concentrado e dividido para procedimentos de diagnóstico e para posteriores estudos moleculares. O protocolo de processamento, para os dois tipos de amostra, encontra-se descrito abaixo:

2.3.1. Expectoração induzida (EI)

Com o objectivo de garantir uma boa higiene oral e uma hidratação adequada, previamente à recolha das EI, todos os doentes respeitaram um período de jejum para alimentos sólidos de 12 horas. A todos os doentes administrou-se uma solução salina hipertónica a 1,8 %, durante 15 minutos, através de um nebulizador ultrassónico. As amostras, obtidas por este processo, foram recolhidas em recipientes estéreis e enviadas para o laboratório. Todos os procedimentos posteriores foram por nós executados.

O processamento das expectorações iniciou-se com a adição de um mucolítico, o ditiotreitol 0,3 % (DTT; Sigma), às amostras, a 37º C, durante 30 minutos, com o objectivo de solver e solubilizar as partículas e agregados de muco. A amostra liquefeita foi transferida para um tubo de centrífuga, adicionou-se PBS, 150 mM, com pH 7,2 (SIGMA), até preencher o volume do tubo, levando-se a centrifugar a 4100 g, durante 20 minutos. O PBS comporta-se como um tampão estabilizante e a centrifugação serve para concentrar os esporos de microsporídios que ficam no sedimento. O sobrenadante é rejeitado, seguindo-se a ressuspensão do sedimento em 0,5 ml de PBS. Com a ajuda de uma pipeta descartável, aplicou-se uma gota de cerca de 20-30 l da amostra, em três lâminas de microscopia pré-tratadas com poli-L-lisina (vide Anexo ), que foi espalhada em círculo de aproximadamente 10-15 mm de diâmetro. Deixou-se secar, à temperatura ambiente (no interior de “hotte”), dividindo-se o restante volume da amostra para microtubos de 1,5 ml.

As lâminas foram conservadas a –20º C, à excepção de uma em que o esfregaço foi submetido à coloração pelo Gram-Chromotrope. A restante expectoração tratada foi conservada a –80º C.

2.3.2. Lavado broncoalveolar (LBA)

O LBA foi obtido, após encravamento do fibroscópio no lobo médio do pulmão, instilando 150 ml de soro fisiológico pré-aquecido a 37º C, dividido por três seringas de 50 ml, tendo sido aspirado suavemente. Todos os procedimentos prévios foram

II. MATERIAL E MÉTODOS

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efectuados por técnicos especializados. O produto obtido foi enviado, de imediato para o laboratório.

O protocolo de preocessamento é bastante semelhante ao apresentado para as amostras de EI, no entanto, como as amostras de LBA, normalmente, não apresentam muco, iniciou-se o processamento transferindo a amostra directamente para um tubo de centrífuga, perfazendo-se o volume do tubo com PBS e centrifugando-se a mistura (4100 g). A partir deste ponto, o procedimento foi igual ao indicado para as amostras de EI.

No final de ambos os procedimentos, uma lâmina de microscopia com o esfregaço (material biológico concentrado) foi usada para efectuar a técnica de Gram- Chromotrope (GC) e as restantes foram conservadas a -20ºC, para posterior estudo ou para confirmação de algum resultado, caso seja necessário. Os tubos contendo a amostra concentrada foram armazenados a -80ºC, de modo a conservar intacto todo o material biológico.

2.4.OBTENÇÃO DO CONTEÚDO INTESTINAL E EXSUDADO TRAQUEAL POST MORTEM DE UM GRUPO DE AVES.

As amostras de conteúdo intestinal e exsudado traqueal, de uma parte do grupo de aves estudado, foram recolhidas durante o exame post mortem da totalidade dos pombos e de quatro papagaios (Psittacus erithacus). As necrópsias foram realizadas, por um Médico veterinário auxiliado pela autora deste estudo, sempre que possível, no próprio dia de chegada dos cadáveres ao Instituto de Higiene e Medicina Tropical. Quando não foi possível necropsiar no próprio dia, conservaram-se os cadáveres a –20 ºC. Em cada necrópsia, efectuaram-se esfragaços da traqueia. Os intestinos foram retirados e, posteriormente, esvaziados do seu conteúdo e conservados a 4ºC. As zaragatoas da traqueia foram mergulhadas em 1,0 ml de solução de fosfato tamponado salino (PBS, sigla anglo-saxónica para phosphate buffered saline) com pH 7,2 (SIGMA), fortemente comprimidas contra o tubo, e conservadas a 4ºC.

II. MATERIAL E MÉTODOS

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3. COLORAÇÃO DIFERENCIAL

3.1.COLORAÇÃO PELO GRAM-CHROMOTROPE (GC)(adaptada de [Moura et al. 1997])

Tradicionalmente, a técnica do tricrómio modificado, constituía a coloração histológica, mais aplicada à identificação morfológica dos esporos de microsporídios. Tal como o seu nome indica, esta técnica utiliza três corantes distintos: um para os núcleos, outro para o citoplasma e um terceiro para as estruturas de sustentação. O tricrómio é preparado com base no método de Weber e colaboradores [Weber et al. 1992a], modificado por Ryan e colaboradores [Ryan et al. 1993], que substituiu o contracorante verde sólido, pelo azul de anilina e diminuiu a quantidade de ácido fosfotúnstico, de modo a obter um melhor contraste entre a cor dos esporos e a coloração de fundo, e por Didier e colaboradores [Didier et al. 1995a] que introduziu alterações no tempo de incubação e na temperatura. No método original, as amostras eram coradas durante 90 minutos, à temperatura ambiente, enquanto aqui o período de execução da técnica demora apenas 30 minutos, a incubar na estufa, a 37º C (fornece uma coloração mais intensa dos microsporídios e prolonga a vida da solução por mais uma ou duas semanas).

Com base na metodologia referida anteriormente, Moura e colaboradores desenvolveram a técnica de Gram-Chromotrope, para a detecção parasitológica dos microsporídios [Moura et al. 1997]. Esta técnica de coloração histológica, combina as vantagens das duas colorações, a do tricrómio modificado e a de Gram potenciando a capacidade tintorial dos corantes e resultando numa maior capacidade de detecção dos esporos destes parasitas. A técnica de Gram-Chromotrope foi a metodologia adoptada, para o presente estudo.

As amostras, destinadas para coloração pelo Gram-Chromotrope, foram fixadas pelo calor seco a 60ºC, fornecido por uma placa térmica, durante 5 minutos e deixados a arrefecer à temperatura ambiente. Após a fixação, os esfregaços foram corados com uma solução de violeta de genciana (Eurotubo), durante 30 segundos e lavados sob um fio de água da torneira. De seguida, foram corados com lugol (Eurotubo), durante 30 segundos. O lugol foi removido por uma solução descorante (Eurotubo), que por sua vez, foi removida sob um fio de água da torneira). Depois de secos, foram corados com a solução de tricrómio modificado (Scientific Device Laboratory, Inc.) e incubados em camâra húmida a 37ºC, durante 30 minutos. Decorrido este período de incubação, os

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esfregaços foram lavados sucessivamente por uma solução com ácido álcool (90 % etanol e 0,45 % de ácido acético), seguida de uma solução de etanol (95%) (Merck) e por último, por uma solução de etanol 100%. Depois de secos à temperatura ambiente, procedeu-se à leitura do esfregaço, após aplicação de uma gota de meio de montagem

entellan new (Merck) e de uma lamela de vidro 24  50 mm. A leitura foi efectuada,

sempre pelo mesmo observador, com apoio da microscopia óptica (Olympus BX51), com objectiva de imersão ( 1000).

A amostra foi considerada positiva, sempre que foram identificados três ou mais esporos [Weber et al. 1992a; DeGirolami et al. 1995], redondos ou ovais, de parede fina corada de violeta a rosa escuro, com uma pequena zona polar ou central não corada. A

solução chromotrope, realça a cinta que rodeia o esporo e minimiza a coloração Gram-variável, observada em algumas espécies de microsporídios [Moura et al. 1997].

Como controlo positivo, processaram-se, em idênticas condições, amostras clínicas de humanos, que se sabia estarem contaminadas por microsporídios.

3.1.1.Quantificação da carga parasitária

Para além do diagnóstico parasitário, a técnica de Gram-Chromotrope foi aplicada na quantificação das cargas parasitárias das amostras em estudo. Assim, a carga parasitária de cada uma das amostras, foi estimada com base na média do número de esporos observados nos esfregaços efectuados, em vinte campos de visão, com a ampliação de ×1000. A média obtida foi classificada segundo o descrito no Quadro XXI.

Quadro XXI. Critério para a determinação da carga parasitária dos isolados de

microsporídios, englobados no presente estudo.