I NTRODUÇÃO G ERAL AOS M ICROSPORIDIA
ESPÉCIES REFERÊNCIAS
5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE
5.2. D IAGNÓSTICO DEFINITIVO
5.2.7. Métodos moleculares
Os métodos moleculares aplicados em todas as áreas do estudo dos seres vivos têm contribuído para um conhecimento mais aprofundado em todos os domínios da
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biologia. Em filogenia e sistemática contribuíram para uma nova organização dos seres vivos ao nível da megasistemática.
Ao longo da última década, verificou-se uma aplicação gradual, das técnicas moleculares, ao diagnóstico e caracterização dos microsporídios. Esta metodologia, tem como objectivo, a detecção de uma determinada sequência do ácido nucleico, ou de um antigénio específico. Enquanto, nos laboratórios de rotina, o diagnóstico de primeira linha é feito com recurso aos métodos de microscopia, nos últimos 15 anos, as técnicas moleculares têm sido, essencialmente, desenvolvidas e aplicadas nos centros de investigação.
Vários autores têm descrito técnicas de amplificação de ácido desoxirribonucleico (DNA, da sigla anglo-saxónica para deoxyribonucleic acid), por reacção em cadeia da polimerase (PCR, da sigla anglo-saxónica para polymerase chain
reaction), a fim de detectar a presença de microsporídios em amostras biológicas e
ambientais, ultrapassando as limitações de sensibilidade e especificidade apresentadas pelas técnicas acima descritas [Ombrouck et al. 1997; Weber et al. 1999b]. O limiar de detecção de microsporídios numa amostra de fezes, através de microscopia óptica, varia entre a presença de 10 e 106 esporos/g de fezes, enquanto a PCR permite detectar
concentrações da ordem dos 102 esporos/g de fezes [Rinder et al. 1998a]. Como tal, estudos epidemiológicos, que envolvam, apenas, a utilização da microscopia óptica, podem conduzir a dados que não reflitam uma correcta avaliação da prevalência de microsporídios. Porém, são necessários, ainda, mais estudos para avaliar estes parâmetros e os valores preditivos destes métodos.
A sensibilidade da reacção de PCR para a detecção de microsporídios depende de diversos factores, tais como o número de cópias da região do genoma a amplificar ou a presença de constituintes fecais inibidores da reacção [Weber et al. 1999b; Carey et al. 2004]. Assim, os sais biliares, a bilirrubina, os metabolitos de fármacos, o DNA de outros microrganismos ou polissacáridos complexos de origem vegetal que sequestrem o ião magnésio, de cuja concentração depende a actividade da enzima Taq DNA polimerase, ou que mimetizem o comportamento do DNA, reduzem a eficiência e a sensibilidade da reacção de PCR [Monteiro et al. 1997; Weber et al. 1999b]. Para ultrapassar este problema são necessários métodos de extracção de DNA genómico eficazes na remoção daqueles inibidores fecais. Os ácidos nucléicos podem ser extraídos
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de amostras biológicas, tais como biópsias de tecidos, raspagens da córnea, aspirados duodenais, urina, material embebido em parafina, assim como de culturas in vitro, ou de amostras em lâmina coradas [Chan & Koh 2008], através de uma variedade de kits comerciais. Podem ser também aplicadas técnicas de uso rotineiro em laboratórios, como seja a digestão pela proteinase K, seguida de um protocolo de extracção com fenol-clorofórmio e precipitação por etanol [Ghosh & Weiss 2009].
Por outro lado, é da máxima importância que a extracção de DNA seja precedida da eficiente destruição da parede dos esporos, uma vez que esta é muito resistente e que a sua lise incompleta compromete todo o processo de extracção e, consequentemente, o rendimento da reacção de PCR. O isolamento e amplificação de DNA, a partir de amostras de fezes, constitui em geral, um maior desafio, tendo por vezes de recorrer-se à disrupção mecânica e/ou condições de extracção mais agressivas [Ghosh & Weiss 2009]. Alguns dos métodos descritos na literatura, incluem a submissão da amostra ao hipoclorito de sódio 0,5%, à quitinase [Fedorko & Hijazi 1996], liticase [Raynaud et al. 1998], tiocianato de guanidina [Kock et al. 1997; Talal et al. 1998], ditiotreitol [Katzwinkel-Wladarsch et al. 1996], ou à fervura [Ombrouck et al. 1996]. Em geral, como já foi referido, as amostras fecais têm um número elevado de inibidores das enzimas polimerases, que são difíceis de remover pelos métodos acima referidos. De modo a potenciar a eficácia de remoção de inibidores, pode recorrer-se à diluição das amostras a estudar [Ombrouck et al. 1997], ou ao tratamento com tiocianato de guanidina [Ghosh & Weiss 2009].
A aplicação da técnica da PCR, ao diagnóstico de um parasita, está condicionada pela informação disponível sobre o seu genoma. Os microsporídios que infectam o Homem, constituem um grupo de agentes patogénicos emergentes, e embora seja reduzida a informação genética disponível até à data, novos dados não páram de surgir.
Os primeiros dados sobre os microsporídios obtidos através dos métodos moleculares, vieram complementar o conhecimento das características eucariotas únicas, destes parasitas, salientando a sua semelhança aos organismos procariotas. Verificou-se, a presença de ribossomas do tipo 70S, rRNA 16S e 23S e, na ausência de uma região espaçadora transcrita 2 (ITS2, da sigla anglo-saxónica para internal
transcribed spacer) observa-se a fusão da região 5.8S com a subunidade grande (23S)
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Também através das técnicas moleculares tem sido possível estudar e avaliar o tamanho do genoma dos microsporídios, tendo-se verificado que comparativamente a outros eucariotas, os microsporídios possuem genomas pequenos, numa gama de tamanhos que podem oscilar entre os 2,3 Mb e os 19,5 Mb. Os genomas de E. cuniculi e
E. intestinalis apresentam apenas 2,9 Mb, e 2.3 Mb, respectivamente, constituindo,
assim, esta última espécie, entre os microsporídios o parasita com o genoma mais pequeno [Biderre et al. 1995; Peyretaillade et al. 1998a].
Ainda são poucos os genes localizados nos cromossomas dos microsporidia e este mapeamento foi feito, apenas, para um número limitado de espécies [Franzen & Muller, 1999]. Actualmente, entre os microsporidios mais estudados, o número de cromossomas varia entre os oito e os 18 [Weiss 2000; Metenier & Vivares 2001].
As reduzidas dimenções do genoma dos microsporídios, sugerem que estes microrganismos desenvolveram estratégias de compactação da informação genética (por exemplo, semelhante à organização do genoma de vírus), e/ou perderam informação genética das vias metabólicas, dependendo exclusivamente de fontes celulares do hospedeiro, para estes compostos. Até á data, a espécie E. cuniculi é a única cujo genoma se encontra totalmente sequenciado [Biderre et al. 1995], e no qual se pode comprovar esta redução genómica. Na verdade, sugere-se que, o ciclo de vida obrigatório intracelular, deste parasita tenha induzido a perda de diversos genes, cujas funções podem vir a ser desempenhadas pela célula hospedeira. Esta espécie de microsporidia, possui um número reduzido de genes, cerca de 2000, desconhecendo-se, todavia a função de mais de metade. [Vivares & Metenier 2000; Katinka et al. 2001]. Para além da redução quantitativa de genes, os que permaneceram, ficaram circunscritos a um espaço limitado, quer pela redução do tamanho total dos genes (por exemplo devido à escassez de intrões), quer pela redução significativa das regiões espaçadoras intergénicas [Katinka et al. 2001; Slamovits et al. 2004].
O DNA que codifica o RNA dos ribossomas é constituído por genes que codificam respectivamente a SSU e a LSU. O produto do gene 16S, que é RNA e não uma proteína, combina-se com proteínas para formar a pequena subunidade dos ribossomas (SSU) A grande subunidade dos ribossomas é formada por proteínas e pelo produto do gene 5,8S, 23S e 5S [Weiss 2000].
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O gene 16S rRNA é uma região muito conservada e muito estável em todos os organismos sendo utilizada em estudos filogenéticos ao nível da megasistemática [Weiss & Vossbrinck 1999].
Ao contrário do que se observa nos outros eucariotas, nos microsporídios, só existe uma unica região intergénica (ITS) localizada entre o gene 16S e o 5.8S ligado ao gene que codifica para a LSU. Esta região do DNA, por ser uma zona não codificante acumula mutações mais rapidamente, sendo muito utilizada para identificar e caracterizar espécies ao nível de um determinado género [Weiss & Vossbrinck 1999].
O RNA e as proteínas ribossomais desempenham um papel essencial na manutenção da estrutura e integridade dos ribossomas sendo o RNA fundamental no processo de síntese proteica em todas as células o que lhe confere uma extraordinária importância e conservação em todos os organismos vivos [Weiss & Vossbrinck 1999].
As sequências do gene do rRNA, depositadas no GenBank são para a maioria dos microsporídios a única informação genética disponível. O número de sequências, nesta base de dados, aumentou de cerca de 200, em 1999, para aproximadamente 6000, na actualidade [Weiss & Vossbrinck 1999]. Assim, a maioria dos métodos moleculares de detecção e identificação de microsporídios, baseados na amplificação pela PCR e descritos na literatura, foram desenvolvidos com base na região do genoma que codifica para os ribossomas (rDNA), mais concretamente na região SSU, ITS e LSU rRNA. A disponibilidade de acesso público destas sequências, caracterizadas pela presença de regiões conservadas e outras variáveis, veio assim constituir-se como uma ferramenta importante, por vezes a única, para a caracterização genética destes parasitas. A clonagem da SSU do rDNA de Vairimorpha nacatrix, um microsporídio associado a doenças com impacte económico na agricultura [Vossbrinck et al. 1987], constitui o primeiro registo da utilização desta região genómica, com sucesso, pelo desenho de oligonucleótidos iniciadores (primers), específicos, no interior desta mesma sequência de nucleótidos.
Primers tendo como sequências alvo as regiões conservadas do gene do rRNA,
resultaram na amplificação do DNA e obtenção de informação genética de diversos microsporídios patogénicos para o homem: E. cuniculi, E. hellem, E. intestinalis, E.
bieneusi e V. corneae [Franzen & Muller 1999b; Menotti et al. 2003b]. No genoma de E. cuniculi, estes genes de rRNA estão presentes em mais de 20 cópias [Katinka et al.
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2001], fornecendo um acréscimo na sensibilidade (relativamente a genes de cópia única), quando se pretende a amplificação de DNA do parasita em amostras biológicas ou ambientais. A região ITS do rRNA, apresenta uma elevada variabilidade, sendo adequada para a caracterização genotípica de algumas espécies de microsporídios, com destaque, para E. bieneusi.
Assim, para o diagnóstico e identificação de espécies de microsporídios infectantes para os humanos [Fedorko & Hijazi 1996; da Silva et al. 1996; Didier et al. 1996a; Gatti et al. 1997], bem como para os animais [Malone & McIvor 1995; Malone & McIvor 1996], têm sido desenvolvidas diversas técnicas de PCR para amplificação de diferentes regiões do gene que codifica a SSU rRNA e a LSU rRNA, bem como da região do espaço intergénico (ITS), cujos estudos foram revistos por Weiss e Vossbrink [Weiss & Vossbrinck 1999], e por Franzen e Müller [Franzen & Muller 1999b].
No Quadro IV, encontram-se compiladas as diversas sequências de primers utilizados na amplificação dos microsporídios (adaptado de [Weiss & Vossbrinck 1999]). Enquanto que alguns primers foram desenhados para amplificar uma gama alargada de microsporídios, incluindo as principais espécies infectantes para o homem e, designados habitualmente na literatura por pan-específicos, outros permitem a identificação da espécie envolvida.
Para além da detecção e identificação directa de diversos microsporídios, a técnica de PCR, associada a outros métodos de biologia molecular, como o polimorfismo do comprimento de fragmentos de restrição (RFLP, sigla anglo-saxónica para restriction fragment length polymorphism), ou a determinação da sequência nucleotídica de fragmentos de DNA amplificado, possibilita, também, a identificação da espécie e/ou genótipo dos parasitas [Weiss & Vossbrinck 1999].
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Quadro IV. Revisão de primers utilizados no diagnóstico molecular de microsporidia. Adaptado de [Ghosh & Weiss 2009].
ESPÉCIES SEQUÊNCIA (5’→3’) PRIMER /SONDA TA/TM (ºC) AMPLICÃO (pb) REF.
Primers usados em PCR
Anncaliia algerae ACTCCGGTAACGTGTGATGTG NALGf2 55 180 [Visvesvara et al. 1999a]
TACAAAGCATGATCCCAGTCT NALGR1
Anncaliia algerae GCCGTTTCCGAAGTTGG NAGf 50 192 [Cali et al. 1998]
ATATCGACGGGACTCTCACC NAG178r
Encephalitozoonidae e Ent. bieneusi CACCAGGTTGATTCTGCCTGAC PMP1 (V1)
60
Eb 250 [Fedorko & Hijazi 1996]
CCTCTCCGGAACCAAACCTG PMP2 Ec 268
Ei 270 Eh 279 Encephalitozoonidae e E. bieneusi TGAATG(G/T)GTCCCTGT MSP1
58 Eb 508 [Katzwinkel-Wladarsch et al. 1996] TCACTCGCCGCTACT MSP2A Ec 289 GTTCATCGCACTACT MSP2B Ei 305 Ei 305 GGAATTCACACCGCCCGTC(A/G)(C/T)TAT MSP3 CCAAGCTTATGCTTAAGT(C/T)(A/C)AA(A/G)GGGT MSP4A CCAAGCTTATGCTTAAGTCCAGGGAG MSP4B
Encephalitozoonidae e E. bieneusi CCAGGUTGATUCTGCCUGACG Mic3U
65/62 Eb 132 [Kock et al. 1997] TUACCGCGGCUGCUGGCAC Mic421U Ec 113 AAGGAGCCTGAGAGATGGCT Mic266 Eh 134 CAATTGCTTCACCCTAAGGTC Eb379 Ei 128 GACCCCTTTGCACTCGCACAC Ec378 TGCCCTCCAGTAAATCACAAC Eh410 CCTCCAATCAATCTCGACTC Ei395
Encephalitozoonidae e E. bieneusi CACCAGGTTGATTCTGCC C1 (V1)
56 Eb 1170 [Raynaud et al. 1998]
GTGACGGGCGGTGTCTAC C2 Ec 1190
Eh 1205 Ei 1186
Encephalitozoonidae TGCAGTTAAAATGTCCGTAGT int530f 40 1000 [Didier et al. 1996a]
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Quadro IV. Revisão de primers utilizados no diagnóstico molecular de microsporidia (continuação). Adaptado
de [Ghosh & Weiss 2009].
ESPÉCIES SEQUÊNCIA (5’→3’) PRIMER /SONDA TA/TM (ºC) AMPLICÃO (pb) REF.
E. intestinalis CACCAGGTTGATTCTGCCTGAC V1 58 375 [Weiss et al. 1994] CTCGCTCCTTTACACTCGAA Si500 E. intestinalis GGGGGTAGGAGTGTTTTTG 3 65 930 [Schuitema et al. 1993] CAGCAGGCTCCCTCGCCATC 3
E. intestinalis TTTCGAGTGTAAGGAGTCGA SINTF1
55 520 [De Groote et al. 1995; da Silva et al. 1997] CCGTCCTCGTTCTCCTGCCCG SINTR
E. cuniculi ATGAGAAGTGATGTGTGTGCG ECUNF
55 549 [Visvesvara et al. 1994; De Groote et al. 1995] TGCCATGCACTCACAGGCATC ECUNR
E. hellem TGAGAAGTAAGATGTTTAGCA EHELF
55 547 [Visvesvara et al. 1994] GTAAAAAGACTCTCACACTCA EHELR
E. bieneusi GAAACTTGTCCACTCCTTACG EBIEF1
55 607 [da Silva et al. 1997] CCATGCACCACTCCTGCCATT EBIER1
E. bieneusi CACCAGGTTGATTCTGCCTGAC V1
48 353 [Zhu et al. 1993; Coyle et al. 1996] ACTCAGGTGTTATACTCACGTC EB450
E. bieneusi CACCAGGTTGATTCTGCCTGAC V1
54 446 [Mansfield et al. 1997; Carville et al. 1997] CAGCATCCACCATAGACAC Mic3
E. bieneusi TCAGTTTTGGGTGTGGTATCGG Eb.gc
49 210 [Velasquez et al. 1996] GCTACCCATACACACATCATTC Eb.gt
E. bieneusi GCCTGACGTAGATGCTAGTC 2
55 1265 [David et al. 1996] ATGGTTCTCCAACTGAAACC 2
Vittaforma corneae TGAGACGTGAAGATGAGTATC NCORF1
55 375 Pieniazek, Visvesvara, PC TCCCTGCCCACTGTCTCCAAT NCORR1
Primers e sondas usadas em hibridação Encephalitozoon spp. CAGGTTGATTCTGCCTGACG FP
63 [Notermans et al. 2005] ATCTCTCAGGCTCCCTCTCC RP
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Quadro IV. Revisão de primers utilizados no diagnóstico molecular de microsporidia (continuação). Adaptado
de [Ghosh & Weiss 2009].
ESPÉCIES SEQUÊNCIA (5’→3’) PRIMER /SONDA TA/TM (ºC) AMPLICÃO (pb) REF.
E. bieneusi CGGTGGTGTGTGTAGGCGTGAGAGTGTATC sonda 55 [Velasquez et al. 1999]
Primers e sondas usadas em RT-PCR ou PCR fluorogénico
EncephP1 CCC TGT CCT TTG TAC ACA CCG CCC EncephP1 68 [Hester et al. 2002]
EcunF1 TCC TAG TAA TAG CGG CTG ACG AA EcunF1 59
EcunR2 ACT CAG GAC TCA GAC CTT CCG A EcunR2 59
EhelF1 GAA TGA TTG AAC AAG TTA TTT TGA ATG TG EhelF1 59
EhelR2 AAC ACG AAA GAC TCA GAC CTC TCA EhelR2 58
EintF1 AAT TCC TAG TAA TAA CGA TTG AAC AAG TTG EintF1 59
EintR2 ACG AAG GAC TCA GAC CTT CCA A EintR2 59
E. bieneusi CGCTGTAGTTCCTGCAGTAAACTATGCC FEB1
65 102 [Menotti et al. 2003a; Menotti et al. 2003b][33,34]
CTTGCGAGCGTACTATCCCCAGAG REB1
ACGTGGGCGGGAGAAATCTTTAGTGTTCGGG sonda
E. intestinalis GCAAGGGAGGAATGGAACAGAACAG FEI1
65 127 [Menotti et al. 2003a]
TTCAGAAGCCCATTACACAGC REI1
CGGGCGGCACGCGCACTACGATA sonda
E. bieneusi TGTGTAGGCGTGAGAGTGTATCTG EbITS-89F
60 103 [Verweij et al. 2007] CATCCAACCATCACGTACCAATC EbITS-191R CACTGCACCCACATCCCTCACCCTT EbITS-114revT Encephalitozoon spp. CACCAGGTTGATTCTGCCTGAC MSP1F 60 CTAGTTAGGCCATTACCCTAACTACCA Eint227R CTATCACTGAGCCGTCC Eint82Trev
Encephalitozoon GTCCGT TAT GCC CTG AGA T
60
268 ACA GCAGCC ATGTTA CGACT
GCC CGT CGC TATCTA AGA TGA CGC A sonda 1 TGG ACG AAG ATT GGA AGGTCT GAG TC sonda 2
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Quadro IV. Revisão de primers utilizados no diagnóstico molecular de microsporidia (continuação). Adaptado
de [Ghosh & Weiss 2009].
ESPÉCIES SEQUÊNCIA (5’→3’) PRIMER /SONDA TA/TM (ºC) AMPLICÃO (pb) REF.
Primers e sondas usadas em microarrays
Microsporidia GATTCTGCCTGACGTGGATGCTATT Msp1 58 [Wang et al. 2005]
ATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAGAT Msp2 61
ATTGACGGAAGGACACTACCAGGA Msp3 57
GTGCGGCTTAATTTGACTCAACGCG Msp4 58
E. bieneusi ACGGCTCAGTAATGTTGCGGTAATT Eb1 56
CCTATCAGCTTGTTGGTAGTGTAAA Eb2 54 TCATGAGACGTGAGTATAAGACCTG Eb3 56 ATCGAATACGTGAGAATGGCAGGAGT Eb4 58 CTAAAAGCGGAGAATAAGGCGCAAC Eb5 58 CGTTGTTCAATAGCGATGAGTTTGC Eb6 56 GGTGAAACTTAAAGCGAAATTGACGG Eb7 56 AGCCTGTGTGTGAGAATACGTGG Eb8 56
Encephalitozoon ACGGCTCAGTGATAGTACGATGATT Ence1 56
TATCAGCTGGTAGTTAGGGTAATGG Ence2 56
GAGTGAAACTTGAAGAGATTGACGG Ence3 56
E. cuniculi TGTGGGGTTGGCAAGTAAGTTGTGG Ec1 59
ATGAGAAGTGATGTGTGTGCGAGTG Ec2 58
GCCTGTGAGTGCATGGCATGAG Ec3 59
GGGAAACTGCAGATAGTGGTCTGC Ec4 59
GGATGTAGTGATGTGTGTGGCAGAG Ec5 59
CTGGACGGGACAGTGTGTGTTGT Ec6 59
E. hellem TAAGTTCTGGGGGTGGTAGTTTGTA Eh1 56
GCGGTTATGAGAAGTAAGATGTTTAGCA Eh2 57
CTGAAGTGAGTGTGAGAGTGTTTTTAC Eh3 57
ATTGGGAGCCTGGATGTAACTGTGG Eh4 59
GGATGTAGTTTTATTGTAGCAGAGG Eh5 54
TGGACGGGACTGTTTTAGTGTTGTC Eh6 58
E. intestinalis TTGACACGAGCCAAGTAAGTTGTAG Ei1 56
TTTCGAGTGTAAAGGAGTCGAGATTGA Ei2 57
GGCAGGAGAACGAGGACGGGAT Ei3 60
CAGGTAGGGGGCTAGGAGTGTTTTT Ei4 59
TGGACGGGACTATATAGTGTTGTG Ei5 56
TATGTCCTGATGTGGATGTAAGAGG Ei6 56
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Acresce, que a PCR é também um instrumento útil na determinação de microsporidios de humanos e animais, que são desconhecidos à partida. Aplicando
primers, que amplificam regiões conservadas da SSU e LSU rRNA, é possível clonar e
sequenciar determinadas porções deste gene em microsporídios a caracterizar. Os primers designados na literatura por V1 (18f::1492r e o 530f::580r) são considerados universais, sendo habitualmente aplicados com sucesso na caracterização específica de microsporídios [Weiss & Vossbrinck 1999; Vossbrinck & brunner-Vossbrinck 2005; Ghosh & Weiss 2009].
Diversas publicações, referem-se à aplicação da técnica de PCR em tempo-real (RT-PCR, sigla anglo-saxónica para real-time polymerase chain reaction), ao diagnóstico dos microsporíos [Hester et al. 2002; Wolk et al. 2002; Menotti et al. 2003a; Menotti et al. 2003b; Verweij et al. 2007]. Esta técnica permite a detecção de amplicões em tempo real, com recurso a fluorocromos ou sondas marcadas com emissão de fluorescência, e tem como vantagens, permitir a quantificação da amostra, encontrar-se padronizada para testar uma grande quantidade de amostras em simultâneo, e dispensar o processo da sua visulização em gel. Estas características, potenciam a eficiência do diagnóstico em laboratório e reduzem o risco de contaminações, inerente à PCR [Monis & Giglio 2006]. Num estudo, registou-se, um limiar de detecção para esta técnica, entre os 102 e os 103 esporos/ml [Wolk et al. 2002].
Também referida na literatura, embora em número reduzido, a hibridação in situ (FISH, sigla do anglo-saxónico para fluorescent in situ hybridization), é uma técnica que possibilita a detecção de microsporídios [Carville et al. 1997; Velasquez et al. 1999; Hester et al. 2000; Graczyk et al. 2007a]. A FISH utiliza uma sonda marcada com fluorescência que ira ligar-se ao ácido nucleico (DNA ou RNA) do parasita [Procop 2007]. Ao contrário da PCR, esta técnica permite informação morfológica e espacial do organismo em estudo. Apesar desta técnica parecer uma ferramenta atraente, visto que proporciona uma vasta informação, duas limitações podem condicionar a sua aplicação ao diagnóstico clínico: é extremamente laboriosa e menos sensível do que a PCR.
Recentemente, foi descrito um sistema de microarrays, para a detecção simultânea das quatro principais espécies infectantes para o Homem, em amostras clínicas, que pelo menos terá como vantagem num único teste identificar mais do que uma espécie, cuja elevada capacidade de processamento das amostras conduz ao ao
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aumento da eficiência de diagnóstico, nos laboratórios de investigação [Wang et al. 2005].
Diversos autores, defendem que, os métodos moleculares, devem ser utilizados, em simultâneo com os outros métodos colorimétricos, procedendo-se, após a identificação dos microsporídios, pela microscopia óptica, à confirmação e à identificação das espécies, pelas técnicas moleculares, visando contribuir para o rápido aumento dos conhecimentos acerca destes organismos.
As técnicas de biologia molecular, em especial a reacção de PCR, possuem um elevado potencial como técnicas de diagnóstico da microsporidiose. Todavia, apesar de considerados métodos fiáveis, fáceis de implementar e com elevada sensibilidade, não são ainda técnicas de rotina laboratorial, sendo necessário uma avaliação rigorosa de parâmetros, tais como a especificidade, sensibilidade e reprodutibilidade, quer entre diferentes laboratórios, quer nas diferentes situações de aplicação, de modo a ser possivel adoptar métodos de referência bem definidos e adequados à sua utilização de rotina no diagnóstico da microsporidiose.