O cacaueiro (Theobroma cacao L., Malvaceae) é uma árvore nativa das bacias dos rios Orinoco e Amazonas, tendo sua origem e distribuição natural nas Américas Central e do Sul. Os pri- meiros cultivos de cacau foram feitos pelas civilizações incas e astecas, que foram pioneiras em sua domesticação. Os astecas atribuíam origem divina ao cacaueiro e por algum tempo no México, as suas amêndoas foram utilizadas como moeda. No Brasil colonial, a exploração do cacau foi quase sempre extrativis- ta, até que, com pouco conhecimento técnico, os primeiros plantios iniciaram no fim do século XVIII.
Por muito tempo o Brasil liderou a produção mundial de cacau, mas na década de 1980, houve um declínio da produção de amêndoas causado princi- palmente pela incidência de vassoura de bruxa nos cacauais, o que resultou em ações de pesquisas para a seleção de clones resistentes ao fungo. Por outro lado, a podridão parda do fruto, causada por um complexo de espécies do gênero
Phytophthora (Straminipila), que pode,
dependendo das condições ambientais, causar perdas de até 90 % da produção de frutos, passou a ser a principal preo- cupação dos cacauicultores de toda parte. O fungo Phytophthora palmivora (Butler) Buter predomina como agente causal da podridão parda do fruto nos frutos de cacau. Os principais métodos empregados no seu controle são os tratos
culturais e o uso de fungicidas e o plantio de variedades resistentes. Dentre os tratos culturais para minimizar seu impacto na produção, a remoção de frutos doentes é eficiente na diminuição do inóculo secundário, mas, é um trato cultural muito laborioso e viável economicamen- te só quando o preço do cacau está em alta no mercado. O controle químico requer várias aplicações e na maioria das vezes estas são ineficientes. Embora a resistência genética seja um dos mais efetivos métodos de controle, ainda não há uma metodologia padrão para avaliar a resistência do germoplasma do cacau a
Phytophthora spp.
Os produtos formulados a partir de
Trichoderma spp., mais comercializados
no Brasil são: Trichodermil (Itaforte Bio- Produtos, Adamantina, SP), usado contra fungos do solo; Biotrich (Biovale Produ- tos Agropecuários Ltda, Venanacio Aires, RS), com ação preventiva contra fitopa- tógenos dos gêneros Rhizoctonia, Scle-
rotina, Fusarium, Phytium, Phomopsis e Rosilinia; Biomix (Terraviva Ind. e Com.
de Insumos Orgânicos, Cotia, SP) utili- zado para o controle de oídio (Uncinula
necator), em videira; Tricovab (fabricado
pela Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira - Ceplac), que contro- la a incidência de vassoura-de-bruxa em cacau (Lucon, 2008). A disponibilidade limitada de produtos comerciais à base de Trichoderma, registrados no Ministé- rio da Agricultura Pesca e Abastecimen- to (Mapa) é a principal causa da baixa aplicabilidade das práticas de biocon- trole. Assim, estrategicamente há uma necessidade de intensificar a difusão de conceitos, princípios e vantagens aos
agrossistemas envolvidos nas tecnologias biológicas contribuindo para a populari- zação do uso de bioprodutos.
Neste contexto, há perspectiva de que as práticas de controle biológico possam contribuir para a redução da doença em níveis economicamente viáveis. Hanada
et al. (2008, 2009 e 2010), observaram
que o fungo endofítico ALF247, residente em cacaueiros tem potencial de uso no biocontrole da podridão parda em con- dições de campo. Os organismo antago- nista foi identificado como Trichoderma
martiale Sam., e com este fungo foi ava-
liado em sua aplicabilidade de uso como agente de controle da podridão parda do fruto do cacaueiro.
DESENVOLVIMENTO DA
PESQUISA
Para obter isolados de Trichoderma spp. foram coletados frutos de cacau e cupuaçu (Theobroma grandiflorum (Willd. ex Spreng.) K. Schum.), com sin- tomas de podridão parda com o propósito de estabelecer uma coleção de trabalho. No Laboratório de Fitopatologia do Inpa, em Manaus, inicialmente foram isolados 160 fungos endofíticos, 13 de cupuaçu e 147 de cacau. Da coleção formada, 57 iso- lados foram descartados, por perda de via- bilidade ou pela incapacidade de produzir esporos em meio de cultura padrão, cons- tituído por batata-dextrose-ágar (BDA). Assim, com a coleção de 103 isolados de fungos endofíticos, foi conduzido um ex- perimento piloto em condições de campo, com o objetivo de avaliar a ação indivi- dual de cada inóculo em frutos de cacau ainda não colhidos, empregando-se três
repetições, totalizando 309 frutos (Hanada
et al., 2008). Após quatro dias, os frutos
foram pulverizados com o agente patogê- nico Phytophthora palmivora.
Aos sete dias após a inoculação do fitopatógenos foi feita uma avaliação da resposta e a incidência e severidade da doença foi avaliada com a definição de uma escala de pontuações, onde: (1) Foi empregada para frutos sadios ou sem sintomas aparentes da doença; (2) Indi- cava lesões localizadas de até 2 mm de diâmetro e perceptíveis a olho nu; (3) Para lesões de 2-20 mm de diâmetro e em expansão; (4) Atribuída a lesões coales- centes com área correspondente até 25 % da superfície do fruto; e, (5) Para lesões generalizadas superiores a 25 % da su- perfície do fruto.
Com os resultados obtidos no experi- mento piloto estimou-se que 71,8 % dos fungos antagonistas, ou seja 74 isolados, mostraram algum grau de redução nos sintomas e severidade da doença. Assim, oito isolados (ALF247 de Trichoderma
martiale; ALF821 e ALF1586 de Pesta- lotiopsis sp.; ALF821 de Cuvularia sp.;
ALF839, ALF849 e ALF1587 de Fusarium sp.; e, ALF902 de Tolypocladium sp.), foram pré-selecionados, para um segundo ensaio, pelo seu potencial de controle da podridão parda em frutos de cacaueiro.
Neste experimento, a ação antagônica dos oito promissores isolados foi avalia- da, incluindo-se também dois tratamen- tos controle: um constituído somente por água e outro contendo fungicida a base de hidróxido de cobre. Após o cultivo em laboratório, os fungos foram diluídos até obtenção de uma suspensão líquida de 107
conídios mL-1 do fungo, que foi utilizado na inoculação dos frutos de cacau. O de- lineamento utilizado foi inteiramente ca- sualizado constituído por 10 tratamentos e 20 repetições, totalizando 200 frutos. Na avaliação das respostas, foi verificado que o tratamento com o fungo ALF247 (Trichoderma martiale) foi o mais eficaz na redução da severidade dos sintomas da podridão parda nos frutos de cacau, mas, não foi tão efetivo quanto o produto fungicida testado. A manifestação de sin- tomas da doença nos frutos submetidos à aplicação de T. martiale, comparada ao efeito do controle com água, pode ser ob- servada na Figura 1.
Nas pesquisas complementares, con- duzidas para avaliar o efeito da aplicação de diferentes concentrações de conídios (1 x 104 a 5 x107 conídios mL-1) de Trichoder-
ma martiale contra Phytophthora palmi-
vora, Hanada et al. (2009), observaram,
com base em regressão logarítmica, que o aumento da concentração do inóculo contribuiu para a redução da severidade da doença, e em seguida foi avaliado o seu efeito residual. Assim, nos primeiros 10 dias após a inoculação do fungo anta- gonista, os frutos de cacau não destaca- dos das plantas matrizes, apresentaram menores níveis de severidade da doença. Por outro lado, aos 40 dias após a aplica- ção de T. martiale não houve significância na severidade da doença com o tratado somente com P. palmivora.
Para melhorar a eficiência do anta- gonista no controle da doença, um novo experimento foi conduzido para avaliar as seguintes formulações: (1) ALF247 + 2 % de óleo vegetal emulsificada deri- vado de soja (Nortox); (2) ALF 247 + 2 % sacarose; (3) ALF247 + 2 % sacaro-
Figura 1. Avaliação dos sintomas visuais da podridão-parda em frutos de cacau (Theobroma cacau),
tratados com Trichoderma martiale em condições de campo. Na linha superior os frutos pulverizados com água e na inferior tratados com suspensão de 107 conídios mL-1 do fungo. *1 *2
*1Definições de escala: 1. Frutos assintomáticos; 2. Lesões de até 2 mm de ϕ; 3. Lesões de 2-20 mm de ϕ; 4. Lesões coalescentes em ± 25 % da área; e, 5. Lesões ≥ 25 % da superfície do fruto; *2Adaptado de Hanada et
se + 2 % Nortox; (4) ALF247; (5) 2 % de Nortox + 2 % de sacarose; (6) 2 % Nortox; (7) 2 % de sacarose.
Neste terceiro bioensaio, o controle positivo e o negativo foram feitos com água e sem o patógeno. Os procedimen- tos foram semelhantes aos experimentos anteriores, e neste teste foram utilizados 10 repetições para cada tratamento. A avaliação foi baseada na escala de se- veridade já descrita e os valores foram convertidos em raiz quadrada. Os dados obtidos foram submetidos ao teste de comparação de médias Scott-Knott a 5 % de probabilidade. Os resultados demons- traram que ocorreu uma redução signi- ficativa da severidade da doença, porém não houve diferenças entre os tratamen- tos, sinalizando que a formulação do an- tagonista com óleo vegetal e/ou sacarose não influenciou nas respostas de redução dos níveis de severidade da doença.
Para avaliar a produção massal de esporos (conídios) do antagonista ALF247 com o propósito de incrementar sua mul- tiplicação e preparo de inóculo um novo experimento foi conduzido. O bioensaio foi desenvolvido em recipientes sacos plásticos com capacidade de 2 kg de solo, contendo 100 g de arroz e mais 30 % de água destilada. Quatro substratos foram avaliados: (1) Somente arroz; (2) Arroz + 0,45 % de CaCO3; (3) Arroz + 0,6 % de ureia; (4) Arroz + 0,225 % de CaCO3 e 0,3 % de ureia. Foram também testadas três fontes de inódulo assim definidas: (1) Adição de 10 discos de 0,5 cm de diâme- tro de micélio e conídios do antagonista ALF247, crescido por 7 dias no meio de cultura batata dextrose agar (BDA); (2) Aplicação de 5 mL de suspensão de 4,5 x
107 conídios mL-1; (3) Aplicação de 5 g de arroz já colonizado com suspensão de 5 x 107 conídios g-1.
O delineamento experimental foi in- teiramente casualizado, obedecendo a um esquema fatorial 4 x 3, considerando- se quatro formulações de substratos e três tipos de fontes de inóculo perfazendo um total de 12 tratamentos com 3 repetições cada. O material foi autoclavado duas vezes em dias alternados por 30 minutos a 121ºC. Os sacos foram mantidos fecha- dos, a 25ºC, no escuro, por seis dias. No segundo dia, os sacos foram abertos para melhorar a oxigenação. Após o período de incubação a produção de conídios de cada tratamento foi contabilizada, e as médias obtidas foram comparada pelo teste Scott-Knott a 5 % de probabilidade.