J. Pediatr. (Rio J.) vol.93 número6

(1)

www.jped.com.br

ARTIGO

ORIGINAL

Placental

and

colostral

transfer

of

antibodies

reactive

with

enteropathogenic

Escherichia

coli

intimins

␣

,

␤

,

or

␥

夽

,

夽夽

Silvia

P.N.

Altman

a,b

_,

_Milene

_{Tino-De-Franco}

a

_,

_Cristiane

_B.

_Carbonare

a

_,

Patricia

Palmeira

c

_e

_Solange

_B.

_Carbonare

a,∗

a_Instituto_Butantan,_Laboratório_de_{Imunogenética,}_São_Paulo,_SP,_Brasil b_Hospital_Israelita_Albert_Einstein,_São_Paulo,_SP,_Brasil

c_Hospital_das_Clínicas,_Instituto_da_Crianc_¸a,_Laboratório_de_Investigac_¸ão_Médica_(LIM-36),_São_Paulo,_SP,_Brasil

Recebidoem21desetembrode2016;aceitoem29dedezembrode2016

KEYWORDS Enteropathogenic Escherichiacoli; Diarrheagenic Escherichiacoli; Intimin;

Maternallyacquired immunity;

ImmunoglobulinG; Colostrum

Abstract

Objective: Intimins are protein adhesins of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and enterohemorrhagicE. coli(EHEC)capableofinducingattachmentandeffacementlesionsin enterocytes. Anti-intiminantibodies are importantfor the protection from EPEC andEHEC infectionsbecause theseantibodiesinhibitbacterialadhesion andimpairthe initialstepof thepathogenesis. Westudied thetransfer ofmaternal anti-intimin antibodiesfromhealthy Brazilianmotherstotheirnewbornsthroughtheplacentaandcolostrum.

Methods: SerumimmunoglobulinG(IgG)andsecretoryimmunoglobulinA antibodiesagainst conserved(cons)andvariableregionsofintimins␣(v␣),␤(v␤),and␥(v␥)wereanalyzedusing anenzymelinked-immunosorbentassayinthebloodandcolostrumfrom45healthywomenas wellascordbloodserumsamplesfromtheirnewborns.

Results: Theconcentrationsofantibodiesreactivewithv␣intiminweresignificantlylowerthan thoseofanti-v␥andanti-consantibodiesinthecolostrumsamples.IgGserumantibodies reac-tivewithallthesubtypesofintiminsweretransferredtothenewborns,buttheconcentrations ofanti-consserumantibodiesweresignificantlyhigherinmothersandnewbornsthan concen-trationsofantibodiesagainstvariableregions.ThepatternsofIgGtransferfrommothersto newbornsweresimilarforallanti-intiminantibodies.Thesevaluesaresimilartothepercentage transferenceoftotalIgG.

DOIserefereaoartigo:

http://dx.doi.org/10.1016/j.jped.2016.12.005

夽 _Como_citar_este_artigo:_Altman _SP,_{Tino-De-Franco} _M,_Carbonare _CB,_Palmeira_P, _Carbonare_SB._Placental _and_colostral _transfer_of

antibodiesreactivewithenteropathogenicEscherichiacoliintimins␣,␤,or␥.JPediatr(RioJ).2017;93:568---75.

夽夽_Trabalho_associado_ao_Instituto_Butantã,_São_Paulo,_SP,_Brasil.

∗_Autor_para_{correspondência.}

E-mail:carbosol@usp.br(S.B.Carbonare).

(2)

Conclusions: Anti-intimin antibodiesaretransferred frommothers tonewborns throughthe placenta,andreinforcetheprotectionprovidedbybreastfeedingagainstdiarrheagenicE.coli infections.

PALAVRAS-CHAVE Escherichiacoli enteropatogênica; Escherichiacoli diarreiogênica; Intimina;

Imunidadematerna adquirida;

ImunoglobulinaG; Colostro

TransferênciaplacentáriaecolostraldeanticorposreativosaEscherichiacoli enteropatogênicacomexpressãodasintiminas␣,␤ou␥

Resumo

Objetivo: AsintiminassãoadesinasproteicasdeEscherichiacolienteropatogênicas(EPEC)e enterro-hemorrágicas(EHEC)capazesdeinduziraslesõesattachingandeffacingnos enteró-citos.Anticorpos anti-intiminassão importantesparaa protec¸ão contrainfecc¸ões porEPEC e EHEC porqueesses anticorpos inibem a adesão bacterianae impedem opasso inicial do mecanismopatogênicodessasbactérias.Nósestudamosatransferênciadeanticorposmaternos anti-intiminasdemãesbrasileirassaudáveisparaosseusrecém-nascidosatravésdaplacentae docolostro.

Métodos: AnticorposséricosdaclasseIgGesecretóriosdaclasseIgA(SIgA)reativos comas porc¸õesconservada(cons)evariáveisdasintiminas␣(v␣), ␤(v␤)e␥(v␥)foramanalisados pelotestedeELISAnosangueenocolostrode45parturientessaudáveisenosanguedecordão umbilicaldosseusrespectivosrecém-nascidos.

Resultados: Asconcentrac¸õesdeanticorposreativoscomintiminav␣foramsignificativamente mais baixasqueas dosanticorpos anti-v␥ eanti-cons nasamostras decolostro. Anticorpos IgG séricos reativos com todas as intiminas foram transferidos para os recém-nascidos, masasconcentrac¸ões deanti-consforamsignificativamentemaisaltastanto nasmãescomo nos recém-nascidos do que os anticorpos reativos com as regiões variáveis das intiminas. O padrão de transferência de IgG das mães para os recém-nascidos foi muito semelhante para todos osanticorpos anti-intiminas.Osvalores de porcentagemdetransferência foram semelhantesàtransferênciadeIgGtotal.

Conclusões: Anticorpos anti-intiminasãotransferidos dasmãespara osrecém-nascidospela placentaecorroboramaprotec¸ãocontrainfecc¸õesporEscherichiacolidiarreiogênicas(DEC) conferidapeloaleitamentomaterno.

Introduc

¸ão

No mundo em desenvolvimento, a morbidez e a morta-lidade relacionadas a diarreia bacteriana pediátrica são, em grandeparte, atribuídasà categoriadiarreiogênica de Escherichiacoli(DEC).Osrecém-nascidoseneonatosdeaté umano sãoespecialmente vulneráveis à diarreiacausada porDECquandonãoforamamamentados.1

Estudosepidemiológicosentrecriançasbrasileiras reve-laramapresençadecepasdeDECnasfezesnãoapenasde criançascomdiarreia,mastambémdecriançassaudáveis. Asformastípicas(tEPEC)eatípicas(aEPEC)deE.coli ente-ropatogênicasãodetectadasentreessesisoladosdecrianças emáreasruraiseregiõesmetropolitanas.2,3_A_E._coli enteri--hemorrágica (EHEC) é um patógeno entérico que está genéticaefenotipicamenteassociadoàEPEC,porémé dis-tinguível por sua produção de toxinas. Os dois tipos de cepas de bactérias produzem lesões attaching and effa-cing(A/E)namucosaintestinal,resultamemcontatoíntimo das bactérias com a célula hospedeira. Esse fenômeno levaà fosforilaçãode proteínas,destruição damembrana

celulareexpressãodegenesbacterianos,agrupadosemuma ilhagenômicadenominadaLocusofEnterocyteEffacement (LEE).1_Uma_das_proteínas_mais_importantes_codificadas_pela LEE é aintimina, umaproteína de membranaexterna de 94kDa envolvida na adesãoíntimaàscélulasbacterianas. A molécula de intimina é composta de 939 resíduos de aminoácidos(aa) e temduas regiões funcionais: aporção N-terminal,queéaltamenteconservadaeinseridana mem-brana externa bacteriana, e a porção C-terminal 280 aa, queé variávele seuspolimorfismos determinam osvários subtiposdeintiminas.4,5_Foram_descritos_pelo_menos₂₇ sub-tipos de intimina, porém apenas poucos parecem causar doençaemhumanos.Aprevalênciadossubtiposde intimi-nasvariaentretEPEC,aEPECeEHEC,emdiferentesregiões geográficaseperíodos,conformemostradoporestudos epi-demiológicos.Asintiminas␣,␤e␥estavamentreossubtipos deintiminasprevalentesnoBrasilnoiníciode2000.1,6---8

(3)

brasileirassaudáveis.14---18 _Achados_semelhantes_foram des-critoscom relac¸ão a mulheres americanas e mexicanas.19 Entretanto,aindanãofoidescrita atransferência de sub-tipos de anticorpos maternos reativos a intimina para recém-nascidospormeiodaplacenta.

Osanticorposdocolostroinibemaadesãobacterianaàs células HEp-2 in vitro e os mesmos anticorpos anti-EPEC foramencontradosnas fezes derecém-nascidos amamen-tados com o colostro de suas mães,15 _apontaram _para umpossívelmecanismo por meiodoquala amamentação confereproteçãoaosrecém-nascidoscontrainfecções cau-sadas por EPEC e EHEC.14,16,17 _Além _disso, _os _anticorpos anti-intiminas secretores e séricos parecem inibir a ade-são bacteriana a células cultivadas e proteger contra infecção,15,17,20---22_assim_a_{transferência}_de_anticorpos anti--intiminaspodeproteger ofeto e orecém-nascidocontra infecção.Nopresenteestudo,investigamosapresençade anticorposanti-intiminasnosoroenocolostrodemães sau-dáveise nocordãoumbilical deseus recém-nascidoscom ousodeproteínaspurificadasobtidasdebactérias recom-binantes que expressam as porções conservadas (cons) e variáveisdas intiminas␣ (v␣),␤ (v␤)e ␥ (v␥).4 _Ao_medir simultaneamente as concentrações desses anticorpos nas amostrasdesoroobtidasdasmãesebebês,avaliamos tam-bémsuapossíveltransferênciaplacentária.

Material

e

métodos

Amostrasbiológicasdesereshumanos

OprotocolodesteestudofoiaprovadopeloComitêdeÉtica doHospital Israelita Albert Einstein (HIAE)e da Universi-dade deSão Paulo, Brasil (número CEP06/434); todos os procedimentosforamfeitosdeacordocomadeclarac¸ãode Helsinquede1964efoiobtidooconsentimentoinformado porescritodetodasasmãesparticipantes.

AsamostrasforamobtidasnoHIAE,hospitalprivadoque atende famílias de nível socioeconômico médio/alto, de julhoaoutubrode2006.Soro,colostroeplasmasanguíneo decordãoumbilicalforamobtidosde45mãessaudáveise deseus recém-nascidos saudáveis, que corresponderam a 37 partos cesáreos. Os critérios de inclusão foram: mães saudáveis,sem quaisquerpatologiasregistradas durantea gravidezoutrabalhode partoe com resultadosnegativos nostestesdesorologiaparaHIV,HTLVI/II,hepatiteBeC, doençadeChagas,sífilis,toxoplasmoseecitomegalovírus. Sanguematernoedecordãoumbilicalfoiobtido imediata-menteapósopartoeforamcoletadasamostrasdecolostro até 72 horas após o parto. Todas as mães tinham entre 22e 36 anos(idade média31,2), agama totalde imuno-globulinaG(IgG)nosorofoide508,8-1389,1mg/dL(média de800,3mg/dL).Asmãesestavamtodasbemnutridas,eram predominantementeprimíparas,comníveldeescolaridade e situação socioeconômica médios/altos, viviam em boas condições sanitárias na cidade de São Paulo. Os recém--nascidos estavam saudáveis, com peso adequado para a idadegestacional,37a41semanas(médiade38semanas), pesavamentre2.630e39.45g(médiade3.298g).

Um grupo de controle de colostro foi preparado com quantidades iguais de20 amostras coletadasde mulheres saudáveis e um grupo de controle de soro foi preparado

comquantidadesiguaisde100amostrasdesangue coleta-dasdedoadoresadultossaudáveis.Aconcentraçãototalde imunoglobulinaAsecretora(SIgA)dogrupodecolostrofoi determinadaporumensaioimunossorventeligadoàenzima (ELISA)comumpadrãocomercial(Sigma,EUA).Umgrupo desoro comumaconcentraçãoconhecidade imunoglobu-linaG(IgG)foiusadocomopadrão.Amostrascombaixase altasconcentraçõesdeanticorposforamincluídasemcada placadeELISAcomoumcontroleinternodoensaio.

Antígenos

As intiminaspurificadas foramobtidasdeculturas de bac-térias recombinantes com expressão, cada, das porções conservadas e variáveis de intiminas ␣, ␤ e ␥, conforme descrito anteriormente.18 _{Resumidamente,} _as _bactérias recombinantes de E.coli M15 transformadas com plasmí-deos pFLv␣, pFLv␤, pFLv␥ ou pFLcons foram analisadas por reação em cadeia da polimerase (PCR) para con-firmar a presença da inserção após clonagem do vetor plasmídico.Osfragmentosdogeneeaequecodificaa inti-mina foramsequenciados para comparação com as cepas padrão registradas no GenBank. A expressão da proteína foi induzidapela culturadas bactérias com isopropil-␤ -D--tiogalactopiranósido, seguidadeextraçãoemumaprensa francesa e centrifugação. As proteínas foram finalmente purificadas porcromatografia de adsorção por íons metá-licos imobilizados (Ni) (Qiagen, EUA)e os produtosforam analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecilsulfatodesódio.

Anticorposanti-intiminas

(4)

placentáriadosanticorposIgGtotalespecíficospara intimi-nasforamdeterminadosemcadaensaiocomosegue:

%T=

_concentrac_¸ão_de_anticorpos_no_soro_de_cordão_umbilical

concentrac¸ãodeanticorposnosoromaterno

×100

Análiseestatística

Todososresultadosforamsubmetidosaanáliseestatística, inclusiveanálisesdescritivascomgráficosdecaixas,análise devariância(Anova)paramétricacomtestedecomparação múltipla e testede correlação deSpearman, em nível de confiançade 95%,como softwareGraphPadPrism(Graph PadSoftwareInc.,EUA).

Resultados

Afigura 1mostra asconcentrac¸õesdeanticorpos reativos aos quatroantígenos recombinados purificados(cons, v␣, v␤ev␥)presentesnas45amostrasdecolostro,45amostras desoro maternoe 45amostras desorode cordão umbili-caldeseusrespectivosrecém-nascidos.Ográficodecaixas mostra osvaloresmáximose mínimos,percentisde25%e 75%,medianasemédias.

As análises das amostras de colostro pelo teste de Friedman para comparações múltiplas mostraram que as concentraçõesdeanticorposIgAanti-v␣foram significativa-mentemenoresdoqueasdeantiv␥eanticons,porémnão houvediferençasestatisticamentesignificativasnosoutros paresdevalores(fig.1A).As concentraçõesdeanticorpos IgA variaram amplamente e as médias acima das media-nas indicaram que não se tratou se de uma distribuição normal.

A comparação de IgG específica revelou que a concentraçãodeanti-consfoisignificativamentemaiorem comparaçãocomoutrossubtiposnasamostrasdesorodas mãesedosrecém-nascidos.Osníveisdeanticorposantiv␣

foram maiores do que os de antiv␤, porém não houve diferenc¸assignificativasentreessesdoissubtipose anticor-posantiv␥(fig.1BeC).Essesresultadosforamconfirmados pelaanálisededistribuic¸ãodefrequência(dadosnão mos-trados).

Afigura2mostraqueatransferênciadeIgGdemãespara recém-nascidosfoimuitosemelhanteatodosossubtiposde anticorposanalisados.Opercentualmédiodetransferência deanticorposanti-intiminavarioude142%a149%eas medi-anasvariaramde130%a146%.Essesvaloressãosemelhantes aopercentualdetransferênciadeIgGtotal(média=143%, mediana=137%).Nãohouvediferenc¸as significativasentre os percentuais de transferência de anticorpos reativos a váriossubtiposdeintiminas.

Atabela1mostraosresultadosdostestesdecorrelac¸ão de Spearman. Nas amostras de soro materno, houve uma correlac¸ão significativa entre os anticorpos antiv␣

e antiv␤ (p<0,0001). Não houve correlação estatistica-mente significativaentre v␥ e cons.O mesmo padrão de correlação foiobservadonasamostrasdesoro dos recém--nascidos. Os coeficientes de correlação foram altos em

10.000

a

b

c

Concentr

ação de SigA anti-intimina (µg/mL)

Concentr

ação de IgG anti-intimina (µg/mL)

Concentr

ação de IgG anti-intimina (µg/mL)

1.000

100

10

1

0,1

0,01

v α v β v γ Cons

v α v β v γ Cons 100

10

1

0,1

0,01

100

10

1

0,1

0,01

Figura 1 Distribuic¸ões das amostras em caixa por suas concentrac¸ões de anti-intimina: valores máximos e mínimos (linhassuperioreseinferioresforadacaixa,respectivamente), média(䊉₎_e_mediana ₍_), _quartis_de_75%_e_25%_(linhas

(5)

Tabela1 Coeficientesdecorrelac¸ãodasconcentrac¸õesdeanticorposanti-intiminanasamostrasdesoro(IgG)ecolostro(SIgA) epercentualdetransferênciadeIgGdemãepararecém-nascido,emparesdetiposdeintimina

Anticorpos anti-intimina

Soromaterno IgG

Sorode recém-nascidos IgG

Colostro SIgA

Transferência deIgG(%)

v␣vs.v␤ 0,8014

(0,0001)

0,8132

(0,0001)

0,8235

(0,0001)

0,3447 (0,0204) v␣vs.v␥ 0,3590

(0,0154)

0,4586 (0,0015)

0,7768

(0,0001)

0,4603 (0,0015) v␣vs.cons 0,3159

(0,0345)

0,5995

(0,0001)

0,7809

(0,0001)

0,3121 (0,0369) v␤vs.v␥ 0,4433

(0,0023)

0,5034 (0,0004)

0,7232

(0,0001)

0,5306 (0,0002) v␤vs.cons 0,3495

(0,0186)

0,4934 (0,0006)

0,7111

(0,0001)

0,2462 (0,1031) v␥vs.cons 0,1043

(0,4954)

0,2221 (0,1426)

0,7628

(0,0001)

0,3306 (0,0265)

v␣,porçãovariáveldeintimina␣;v␤,porçãovariáveldeintimina␤;v␥,porçãovariáveldeintimina␥.

Oscoeficientesforamdeterminadospelotestedecorrelac¸ãodeSpearman,níveldeconfianc¸ade95%(valoresdepemitálico),p<0,0001 destacadoemnegrito.

todososparesanalisadosparaverificac¸ãodasamostrasde colostro.

A tabela 2 mostra coeficientes de correlação significa-tivosparatodosostipos deintiminaentreasamostrasde soromaternoe dosrecém-nascidos,assim atransferência deanticorposdemãespararecém-nascidosfoiigualmente eficienteparatodosossubtiposdeintimina.Foramvistos coeficientes de baixa correlação entre os anticorpos IgG sérica e SIgA do colostro, pois a geração de anticorpos IgGséricaeIgA secretoraocorrepormeiodemecanismos independentes.

400

300

200

100

0

v α v β v γ Cons

T

ransferência de IgC, %

Total lgG

Figura2 TransferênciadeanticorposIgGanti-intiminaeIgG totaldemãespararecém-nascidos.Distribuic¸ãodeamostrasem caixaporseuspercentuais de transferênciadeanti-v␣, anti--v␤,anti-v␥ eanti-cons etransferênciade IgGtotal: valores máximosemínimos(linhassuperioreseinferioresforadacaixa, respectivamente),média(䊉₎_e_mediana₍),quartisde25%e

(linhassuperioreseinferioresdacaixa,respectivamente).

Tabela2 Coeficientesdecorrelac¸ãodeconcentrac¸õesde anticorpos anti-intiminas entre as amostras de soro (IgG) materno e colostro (SIgA) e entre as amostras de soro maternoedecordãoumbilical(IgG)

Intimina SoromaternoX colostro

Soromaterno XSorode recém-nascidos

v␣ 0,0028

(0,9853)

0,8727(0,0001)

v␤ 0,1475

(0,3337)

0,9568(0,0001)

v␥ 0,1743

(0,2578)

0,9320(0,0001)

cons 0,2265 (0,1346)

0,8519(0,0001)

cons,porçãoconservadadeintimina;v␣,porçãovariávelde inti-mina␣;vß,porçãovariáveldeintiminaß;v␥,porçãovariável deintimina␥.

Oscoeficientesforamdeterminadospelotestedecorrelac¸ãode Spearman,níveldeconfianc¸ade95%(valoresdepemitálico), p<0,0001destacadoemnegrito.

Discussão

(6)

anticorpos do soro de humanos e animais imunizados.13---17,22,24 _Com _base _nisso, _as _intiminas _foram propostas como uma possível candidata a vacina contra infec¸ãoporEPECeEHEC.20,21

Foramencontradosanticorpos nasporçõesconservadas evariáveisdeintiminas␣,␤ e␥em todasasamostrasde soroe colostro analisadas,provavelmentedevidoà ampla prevalênciade EPEC em nossapopulação. Este estudo foi feitocomamostrascoletadasdemãesdeníveis socioeconô-micos médios/altos. Demonstramos achados semelhantes quando analisamos amostras coletadasde mães de níveis socioeconômicos maisbaixos e que moramem áreas com saneamentoprecário.IssosugerequeaprevalênciadaEPEC dependedasituação socioeconômicaoudas condições de higienedospacientes.11,12,16,18 _Achados_semelhantes_foram relatadosporAraujoetal.comrelaçãoàdetecçãodeDEC em amostras fecais de crianças de áreas urbanas pobres ecriançasatendidas emserviçosmédicosprivadasdealto nívelsocioeconômico.25

Criançassaudáveisbrasileirasdesenvolveramanticorpos reativos a fatoresassociados à virulência da EPEC, como intiminas.11 _No_fim_do_primeiro _ano_de _vida,_esses neona-tosmostramrepertóriosdeanticorposanti-EPECnosoroe na salivaequivalentesaosdeadultossaudáveisnamesma população. As intiminas ␣, ␤ e ␥ são compartilhadas por cepasdeEPEC(típicasouatípicas)eEHECeestão presen-tesemDEC encontradaem animaisdomésticoseagrícolas quepodemtercontatopróximocompessoas.Issosugereque aintiminaéumantígenocomumpresentedeformaubíqua napopulaçãobrasileira.26

Os subtipos de anticorpos anti-intiminas encontrados nas amostras analisadas neste estudo podem inibir a adesão bacteriana, pois essa porção da molécula das intiminas é responsável pelas interações com as célu-las hospedeiras, destaca um papel na proteção contra as bactérias.22

A análise estatística da IgG detectada nas amostras de soro materno e de recém-nascidos revelou que as concentraçõesdeanticorposnaporçãoconservadade inti-minaforammaioresemcomparaçãocomosanticorposnas porçõesvariáveisdossubtipos␣,␤e␥.Aregiãoconservada é comum em todos os subtipos e, portanto, é razoável esperarquetodasaspessoasdesenvolvamessesanticorpos, independentemente do subtipo específico de intimina presentenasbactériasemcontato.Resultadossemelhantes foram observadospor Zapata-Quintanillaet al.18 _em _suas análisesdeamostrasdesorodeadultossaudáveis(doadores desangue).Contudo,esseperfilfoidiferenteemamostras decolostro,nasquaisaconcentraçãodeanticorposreativos av␤,v␥,econsfoisemelhante,porémaconcentraçãode anticorposanti-v␣foimenordoqueadeantiv␥eanticons. EssepadrãonãofoivistoporZapata-Quintanillaetal.,18_que encontrarammenores níveis deanti-v␥.Essa discrepância tambémpodeser atribuívelà variação nosrepertórios de anticorposentreasmães,poisasamostrasforamcoletadas de doadores com diferentes características no estudo de Zapata-Quintanilla e no nosso: o nível socioeconômico (hospitalpúblicoemcomparaçãocomhospitalprivado, res-pectivamente),idade(médiade24,6emcomparaçãocom 31,2anos),tipo departo(24,4%em comparaçãocom82% decasosdepartocesáreo)eperíododecoletadeamostras (setembro de 1997 a fevereiro de 1998 em comparação

comjulhoaoutubrode2006).Osestudosepidemiológicos indicaramqueaprevalênciadeintimina␥aumentoucomo surgimentodeaEPECnosúltimosanos.1,3,6---8,25

As intiminas são frequentemente encontradas em bac-tériasisoladasnãoapenasempacientescomdiarreia,mas tambémempessoassaudáveise animaisdomésticos.1,6,7,26 Aintimina␣ foidetectadaemcepas detEPEC eaEPEC.A intimina␤ está associada a tEPEC e aEPEC, bem como a EHEC,aopassoqueaintimina␥éencontradaemaEPECe EHEC.OisolamentodessascepasdebactériasnoBrasilpode explicarapresençadessesanticorposnasamostrasdesoro ecolostro.ApesardabaixaincidênciadeinfecçãoporEHEC entreadultosbrasileiros,osanticorposanti-intimina␥estão presentesemostramumacorrelaçãopositivacomos anti-corposreativosaoutrossubtiposdeintiminas.Oaumento nasfrequênciasdecepasdeaEPECnomeioambientepode serresponsávelpelapresençadeanticorposanti-intimina␥

entrebrasileirossaudáveis.Estudosrecentesmostram sub-tiposdeintiminas␤e␥nainduçãodadiarreiaemhumanos eosubtipo␤parecesersignificativamentemaisfrequente em casos de doenças em comparação com portadores saudáveis.8

Háumacorrelaçãosignificativaentreaconcentraçãode anticorposIgGanti-intimina␣e␤nosoromaternoenosoro derecém-nascidos,quepodeserdevidoaumareação cru-zadaentreosanticorposIgGcomvistasaessasintiminas. Defato,assequênciasgenéticasdasporçõesvariáveis des-sasintiminas têmumahomologia de65%,18 _que_explica _a presença deanticorposdereaçãocruzada. Portanto,esse fenômeno mostra que independentemente do subtipo de intiminacandidato a vacina, esse subtipo podeaumentar anticorposespecíficos,mastambémpodeinduziranticorpos dereaçãocruzadadirecionadosaooutrosubtipo.

As concentrações de anticorpos SIgA reativos a todos os tipos de intiminas presentes nas amostras de colostro mostraramcoeficientes de correlação significativos, suge-riram que há certo grau de reação cruzada entre esses anticorpos.Essasituaçãopodeserexplicadapelahomologia elevadaentreasmoléculasdeintiminaepelamenor espe-cificidade de anticorpos SIgA no colostro em comparação com a IgG no soro. Contudo, as maiores concentrações de anticorpos anti-intimina nas amostras de colostro em comparação comasamostras desoro corroboramo papel essencialdaamamentaçãonaproteçãodeneonatoscontra infecçãoporDEC.Emhumanos,osanticorposSIgAnoleite nãosão absorvidosde forma significativapela mucosado bebêamamentado, mas agem como defesa local.Em um estudoanterior,mostramos,pormeiode imunotransferên-cia, a mesma reatividade dos anticorpos SIgA anti-EPEC nasamostras decolostro que areatividade deanticorpos anti-EPECnas fezes dosrespectivosbebês. Além disso, os anticorposSIgA isolados decolostro por cromatografiade afinidadeinibemaadesãodaEPECàscélulasHEp-2.15

(7)

Apesardehaverumaaltafrequênciadecasosisoladosde DECnoBrasil,ascepasdeEHECnãosãotãocomunsquanto em outros países. Podemossupor que, além das caracte-rísticasambientais, como climae hábitos alimentares, as pessoas podemdesenvolverimunidade contraEHEC resul-tante de contato com outras cepas (por exemplo, DEC). Algunsestudosrevelaramapresençadeanticorposreativos aváriossorotiposdelipopolissacarídeos(LPS),comoO111, O55,O157eO26,emamostrasdesoroecolostrode brasilei-rassaudáveis.12,13_Outros_estudos_mostraram_a_{transferência} maternal-fetaldeanticorposIgGreativosaO111,O16eO6 LPSassociadosasepseneonatal,bemcomoO157.29,30_Esses antígenosLPS são comumente encontradosem diferentes patótiposdeE.coliquesãoagentesdedoençasintestinais ousistêmicas.Comoumtodo,essasobservaçõeseeste tra-balhonos permitem concluir quea proteçãocontra EHEC podeser conferidaporcontatocom EPECououtrascepas deE.coli.

Nossosresultadosconfirmamqueosanticorposmaternos reativos a intiminas são transferidos para os recém--nascidospormeiodaplacentaequeapresençaquealtas concentraçõesdessesanticorposnocolostrocorroboramo fatordeproteçãodaamamentação.

Financiamento

Fundac¸ão de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp---03/13250-3).

Conflitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.

Agradecimentos

A todas as mães por seu consentimento com relação à doação das amostras. À Maternidade, ao Banco de Leite e ao Laboratório de Criopreservação do Hospital Israelita AlbertEinsteinporsuaajudacomacoletadeamostras;à DivisãodeDiagnósticosdaAbbottnoBrasilpeladoaçãodo KitimunoturbidimétricoparaanálisedeIgG;àDra.LucyB. Zapata-Quintanillapelaajudanos experimentos,aRosana PriscopelaanáliseestatísticaeàDra.YaniraRiffoVasquez pelarevisãodomanuscritoepelas sugestõesvaliosas (Ins-titutodeCiênciasFarmacêuticas, King’sCollege,Londres, Inglaterra).

Referências

1.GomesTA,EliasWP,ScaletskyIC,GuthBE,RodriguesJF,Piazza RM, et al. Diarrheagenic Escherichia coli. Braz J Microbiol. 2016;47:3---30.

2.Lozer DM, Souza TB, Monfardini MV, Vicentini F, Kitagawa SS,Scaletsky IC,etal.Genotypic andphenotypic analysisof diarrheagenic Escherichiacoli strains isolated from Brazilian childrenlivinginlowsocioeconomic levelcommunities.BMC InfectDis.2013;13:418.

3.MorenoAC,Filho AF,GomesTdoA, RamosST, MontemorLP, TavaresVC,etal.Etiologyofchildhooddiarrheainthe northe-astofBrazil:significantemergentdiarrhealpathogens.Diagn MicrobiolInfectDis.2010;66:50---7.

4.Adu-Bobie J, Frankel G, Bain C, GoncalvesAG, TrabulsiLR, DouceG,etal.Detectionofintiminsalpha,beta,gamma,and delta,fourintiminderivativesexpressedbyattachingand effa-cingmicrobialpathogens.JClinMicrobiol.1998;36:662---8. 5.Adu-Bobie J, Trabulsi LR, Carneiro-Sampaio MM, Dougan G,

Frankel G. Identification of immunodominant regions within theC-terminalcell bindingdomainofintiminalphaand inti-minbetafromenteropathogenicEscherichiacoli.InfectImmun. 1998;66:5643---9.

6.Franco RT, Araújo LD, Penna FJ, Magalhães PP, MendesEN. IntiminsubtypingofatypicalenteropathogenicEscherichiacoli isolatedfrom childrenwithand without diarrhea:a possible temporalshiftinthedistributionofintiminalleles.Diagn Micro-biolInfectDis.2012;74:81---3.

7.Pitondo-Silva A, Nakazato G, FalcãoJP, Irino K, Martinez R, DariniAL, et al.Phenotypic and geneticfeatures of entero-pathogenicEscherichiacoliisolatesfromdiarrhealchildrenin theRibeirãoPretometropolitanarea,SãoPauloState,Brazil. APMIS.2015;123:128---35.

8.HuJ,TorresAG.EnteropathogenicEscherichiacoli:foeor inno-centbystander?ClinMicrobiolInfect.2015;21:729---34. 9.MartinezMB,TaddeiCR, Ruiz-TagleA, TrabulsiLR,Girón JA.

Antibody response of children withenteropathogenic Esche-richia coli infection to the bundle-forming pilus and locus ofenterocyteeffacement-encoded virulencedeterminants.J InfectDis.1999;179:269---74.

10.VossE,PatonAW,ManningPA,PatonJC.Molecularanalysisof ShigatoxigenicEscherichiacoliO111:H−_proteins_which_react withserafrompatientswithhemolytic-uremicsyndrome.Infect Immun.1998;66:1467---72.

11.Carbonare CB, Carbonare SB, Carneiro-Sampaio MM. Early acquisition ofserum and saliva antibodies reactive to ente-ropathogenicEscherichiacolivirulence-associatedproteinsby infants livingin an endemic area. Pediatr Allergy Immunol. 2003;14:222---8.

12.Palmeira P, Carbonare SB, Guth BE, Carbonare CB, Pontes GN,Tino-De-FrancoM,etal.Acquisitionofserumantibodies reactive with enterohemorrhagic Escherichia coli virulence--associated factors byhealthy Brazilianchildren and adults. PediatrInfectDisJ.2009;28:1089---94.

13.Zapata-QuintanillaLB, PalmeiraP,Tino-De-Franco M,Amaral JA,CarbonareCB,CarbonareSB.Systemicantibodyresponse to diarrheagenic Escherichia coli and LPS O111, O157 and O55in healthy Brazilianadults. Scand J Immunol.2006;64: 661---7.

14.Camara LM, Carbonare SB, Silva ML, Carneiro-Sampaio MM. Inhibition ofenteropathogenic Escherichia coli (EPEC) adhe-siontoHeLacellsbyhumancolostrum:detection ofspecific sIgArelatedtoEPECouter-membraneproteins.IntArchAllergy Immunol.1994;103:307---10.

15.Carbonare SB, Silva ML, Palmeira P, Carneiro-Sampaio MM. HumancolostrumIgAantibodiesreactingtoenteropathogenic Escherichiacoliantigensandtheirpersistenceinthefaecesof abreastfedinfant.JDiarrhoealDisRes.1997;15:53---8. 16.Delneri MT, Carbonare SB, Silva ML, Palmeira P,

Carneiro-Sampaio MM. Inhibition of enteropathogenic Escherichia coli adhesion to HEp-2 cells by colostrum and milk from mothersdelivering low-birth-weightneonates.EurJ Pediatr. 1997;156:493---8.

(8)

19.Noguera-ObenzaM,OchoaTJ,GomezHF,GuerreroML, Herrera-Insua I, MorrowAL, et al. Human milk secretory antibodies againstattachingandeffacingEscherichiacoliantigens.Emerg InfectDis.2003;9:545---51.

20.Dean-NystromEA,GansheroffLJ, MillsM,Moon HW,O’Brien AD.Vaccinationofpregnantdamswithintimin(O157)protects sucklingpigletsfromEscherichiacoliO157:H7infection.Infect Immun.2002;70:2414---8.

21.FerreiraPC,CamposIB,AbeCM,TrabulsiLR,EliasWP,HoPL, etal.ImmunizationofmicewithLactobacilluscasei expres-singintiminfragmentsproducesantibodiesabletoinhibitthe adhesion of enteropathogenic Escherichia coli to cultivated epithelialcells.FEMSImmunolMedMicrobiol.2008;54:245---54. 22.GansheroffLJ,WachtelMR,O’BrienAD.Decreasedadherence ofenterohemorrhagicEscherichiacolitoHEp-2cellsinthe pre-sence of antibodies that recognize theC-terminal region of intimin.InfectImmun.1999;67:6409---17.

23.FomsgaardA.Antibodiestolipopolysaccharides:some diagnos-ticandprotectiveaspects.APMISSuppl.1990;18:1---38. 24.AmaralJA,TinoDeFrancoM,Carneiro-SampaioMM,Carbonare

SB.Anti-enteropathogenic Escherichiacoli immunoglobulin Y isolatedfromeggslaidbyimmunisedLeghornchickens.ResVet Sci.2002;72:229---34.

25.AraujoJM,TabarelliGF,ArandaKR,FabbricottiSH, Fagundes-Neto U, Mendes CM, et al. Typical enteroaggregative and

atypicalenteropathogenictypesofEscherichiacoliarethemost prevalentdiarrhea-associatedpathotypesamongBrazilian chil-dren.JClinMicrobiol.2007;45:3396---9.

26.Aidar-UgrinovichL, BlancoJ,Blanco M,BlancoJE, LeomilL, DahbiG,etal.Serotypes,virulencegenes,andintimintypesof Shigatoxin-producingEscherichiacoli(STEC)and enteropatho-genicE.coli(EPEC)isolatedfromcalvesinSãoPaulo,Brazil. IntJFoodMicrobiol.2007;115:297---306.

27.PalmeiraP,QuinelloC,Silveira-LessaAL, ZagoCA, Carneiro-SampaioM.IgGplacentaltransferinhealthyandpathological pregnancies.ClinDevImmunol.2012;2012:985646.

28.de VoerRM,van derKlisFR,NooitgedagtJE, VersteeghFG, vanHuisselingJC,vanRooijenDM,etal.Seroprevalenceand placental transportation of maternal antibodies specific for Neisseria meningitidis serogroup C, Haemophilus influenzae type B, diphtheria, tetanus, and pertussis. Clin Infect Dis. 2009;49:58---64.

29.NagaoAT,MartinezCC,VieiraVS,TakanoOA,Costa-CarvalhoBT, Carneiro-SampaioMM.PlacentaltransferofIgGandIgGsubclass antibodiesanti-purifiedEscherichiacoliLPSO16,O6andO111. ScandJImmunol.1998;47:609---14.