Procedimentos para diagnóstico virológico

4.5.1.1.Aparelho gastrointestinal

Rotavírus

Vírus de ARN (ácido ribonucleico) entérico que provoca diarreia e gastroenterite em humanos, sendo a principal causa de gastroenterite em crianças com menos de cinco anos. É transmitido pela via fecal-oral e é altamente contagioso, com um período de incubação de 2-3 dias. Os Rotavírus do grupo A são os principais agentes patogénicos em humanos e animais e infetam a maioria das pessoas pelo terceiro ano de vida. VP6 (proteína viral 6) é uma proteína da cápside do vírus. (76,79)

Procedimento

É utilizado um teste rápido em amostras de fezes que consiste numa membrana com partículas de ouro coloidal sensibilizada com anticorpos dirigidos contra o vírus. A especificidade do teste é devida a um anticorpo monoclonal dirigido contra proteínas VP6 do vírus que é conjugado com as partículas de ouro, e este conjugado é colocado numa membrana. (92)

Quando a tira-teste é colocada na suspensão fecal (fezes diluídas em diluente do kit), os conjugados solubilizados migram com a amostra por difusão passiva e ficam em contacto com o anticorpo na membrana que origina uma linha vermelha após 10 minutos. A linha de controlo também deverá ser visível de modo a confirmar que o teste foi bem realizado. (92)

Adenovírus

O Adenovírus é um vírus de ADN que representa a segunda causa principal de gastroenterite viral em crianças com menos de dois anos. Podem ser divididos em grupos de A a F, sendo que o grupo F é o mais envolvido na gastroenterite pediátrica. A infeção ocorre predominantemente pela via fecal-oral e o vírus infeta as células epiteliais do sistema gastrointestinal. O período de incubação dura entre 5-8 dias. (76,79) É utilizado um teste rápido de diagnostico de gastroenterite por Adenovírus em amostras de fezes. O método e procedimento utilizado são idênticos aos referidos para o diagnóstico de gastroenterite por Rotavírus. A especificidade deste teste é conseguida pelo uso de

117 anticorpos monoclonais dirigidos contra proteínas especificas do Adenovírus humano. (93)

Norovírus

Os Norovírus incluem os vírus do tipo Norwalk, e outros pequenos vírus que causam gastroenterite, provocando diarreia aguda e vómitos. Não possuem invólucro e são vírus de ARN. Tal como o Rotavírus e Adenovírus, a sua transmissão ocorre por via fecal-oral. Os vírus crescem no intestino, causando lesões na mucosa intestinal e libertados nas fezes. O período de incubação dura cerca de 12-48h. A infeção por Norovírus ocorre em todo o mundo, sendo mais comum em crianças mais velhas e adultos. (76,79)

No laboratório, o diagnóstico é feito através de um teste rápido imunocromatográfico para deteção qualitativa de Norovírus em fezes. (94)

Procedimento

Este teste é baseado em anticorpos monoclonais, que permite detetar antigénios em amostras de fezes de forma rápida. Os reagentes do kit e a amostra são adicionados a um tubo de ensaio. A mistura é agitada e deixada a sedimentar, de modo a se poder adicionar cerca de 150µL do sobrenadante ao dispositivo de teste. A leitura do resultado é feita após 15 minutos. O vírus estará presente caso se verifique a existência da banda do teste e do controlo, para garantir confiança no resultado. A intensidade da cor depende da quantidade de antigénio presente na amostra. (94)

4.5.1.2.Aparelho respiratório

Adenovírus

É realizado um teste rápido de diagnóstico para a deteção de Adenovírus respiratório em secreções nasofaríngeas.

O alvo principal dos Adenovírus é o trato respiratório, pelo que são responsáveis, entre outras, por patologias no trato respiratório e infetam maioritariamente crianças. A infeção ocorre pela inalação de aerossóis e por contato direto, originado uma forte resposta imunitária, podendo ser fatal em pacientes imunocomprometidos. (76,79)

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Procedimento

O teste é baseado numa membrana com partículas de ouro coloidal com anticorpos dirigidos contra o vírus. Quando a amostra entra em contacto com a tira-teste, o conjugado (anticorpo monoclonal dirigido contra antigénios do vírus/partículas de ouro) migra com a amostra e entram em contacto com o anticorpo anti-Adenovírus adsorvido na membrana de nitrocelulose da tira-teste. Se a amostra contem o vírus, será visível uma banda na tira. Uma banda controlo também deverá ser visível para validar o teste. (95)

Influenza A+B

O vírus Influenza provoca uma infeção viral aguda e altamente contagiosa do trato respiratório. Há três tipos de vírus Influenza. O tipo A é o mais prevalente e associado a epidemias mais graves. O tipo B produz patologias geralmente menos graves. Os vírus desta família têm um genoma de ARN segmentado e possuem invólucro. A transmissão do vírus dá-se por via aérea, através de aerossóis, e o vírus multiplica-se nas mucosas do aparelho respiratório causando inflamação celular e originando síndrome febril, garganta dorida, mialgias, tosse entre outros sintomas que duram cerca de 5 dias. Complicações podem originar pneumonia.(76,79)

Para o diagnóstico diferencial dos tipos A e B do vírus é usado um teste rápido para deteção qualitativa dos antigénios dos vírus Influenza tipo A e tipo B em amostras nasais ou nasofaríngeas. Os antigénios podem ser detetados por imunoensaio, que utiliza anticorpos monoclonais específicos para os antigénios do vírus. (96)

Procedimento

A amostra é colocada num tubo com reagente e as partículas do vírus expõem as nucleoproteínas internas. Depois, é colocada a tira teste dentro do tubo, com a qual as nucleoproteínas vão reagir. Caso a amostra contenha antigénios do vírus, uma linha irá aparecer na tira teste, correspondente ao tipo de vírus, juntamente com a linha de controlo, de modo a confirmar que o teste foi realizado corretamente. (96)

Vírus Sincicial Respiratório

É utilizado um teste rápido que consiste num imunoensaio cromatográfico para deteção qualitativa do Vírus Sincicial Respiratório (RSV, do inglês, Respiratory Syncytial Virus) em aspirados nasofaríngeos.

119 O RSV como o nome indica, infeta células do trato respiratório e dissemina-se localmente. A sua transmissão dá-se por inalação de aerossóis. É o vírus mais comum em bebés e crianças pequenas. Provoca sintomas idênticos aos da constipação comum, mas também pode provocar infeções graves ou ser fatal. (76,79)

Procedimento

O teste é imobilizado com anticorpos monoclonais específicos. É adicionada solução tampão e amostra ao tubo de ensaio. Após homogeneizar e repousar 10 minutos, insere-se a tira-teste imobilizada com anticorpos no tubo de ensaio e o resultado é lido passado 15 minutos. Se a amostra contem o vírus, será visível uma banda na tira. Uma banda controlo também deverá ser visível para validar o teste. (97)

4.5.1.3.Mononucleose infeciosa

A mononucleose infeciosa é causada pelo vírus Epstein-Barr, que pertence à família dos vírus Herpes, vírus grandes de ADN com invólucro. É transmitido através da saliva e os sintomas incluem febre, dores de garganta, faringite e inflamação das glândulas linfáticas e linfocitose atípica nos jovens e adultos; nas crianças a doença normalmente é assintomática ou ligeira. (76,79)

No laboratório é utilizado um teste rápido de imunoensaio que deteta a presença de anticorpos heterófilos - classe IgM (imunoglobulina M), presentes na maioria dos casos de mononucleose infeciosa aguda. A amostra utilizada é sangue total, soro ou plasma. (98)

Procedimento

O antigénio é imobilizado na região da linha de teste e a amostra reage com partículas revestidas de antigénio. Esta mistura migra cromatograficamente e interage com o antigénio imobilizado. Caso a amostra contenha anticorpos heterófilos, aparece uma linha colorida na região da linha de teste. Aparece também uma linha colorida que serve de controlo. (98)

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4.5.1.4.Dengue

Dengue é uma doença tropical infeciosa causada pelo Vírus da Dengue, um arbovírus do género Flavivírus (vírus de ARN). O Vírus da Dengue é transmitido por mosquitos do género Aedes. Existem quatro serotipos do vírus (1-4). No geral, a infeção é subclínica. Se o paciente é infetado duas vezes com um serotipo diferente, ocorre doença severa. O indivíduo hospedeiro deste vírus, tem manifestações cutâneas e febre; mais grave se for febre hemorrágica por Dengue. (76,79)

A glicoproteína não estrutural 1 (NS1) é uma glicoproteína presente no soro dos pacientes em altas concentrações. No caso do resultado ser positivo para o antigénio IgM indica que a infeção é primária. Se o anticorpo detetado for IgG (imunoglobulina G) indica infeção secundária. No caso de serem os dois detetados, é uma indicação de infeção tardia primária ou infeção secundária precoce. (99)

Procedimento

É realizado um teste que consiste num ensaio imunocromatográfico que deteta o antigénio NS1 do vírus e deteta e diferencia os anticorpos IgM e IgG em soro, plasma ou sangue total em dois dispositivos de teste isolados. Para isso, a amostra é adicionada nos poços respetivos dos dispositivos de teste e o resultado é lido passado 15 minutos. A presença de duas linhas (teste e controlo) nas janelas de resultados indicam positividade do teste. (99)

4.5.1.5.Vírus da Imunodeficiência Humana

Os Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) são retrovírus de ARN, com envelope, transmitidos principalmente por via sexual, parental, perinatal e transplacentária, que podem causar SIDA. Existem duas espécies de HIV que infetam humanos: HIV-1 e HIV-2. O tropismo deste vírus para as células T CD4+ é determinante para a patogénese do vírus, que compromete o funcionamento do sistema imunitário. No período inicial da infeção, o paciente pode manifestar sintomas de fase aguda, nomeadamente febre, suores, mialgias, dores de garganta, lingadenopatias, náuseas, diarreias e erupções cutâneas, seguindo-se um longo período de latência clínica, em que normalmente ocorrem infeções oportunistas. (76,79)

É utilizado um teste automatizado, de rastreio, baseado na deteção combinada de uma proteína estrutural (antigénio p24) do HIV-1 e das imunoglobulinas totais anti-HIV-

121 1 e anti-HIV-2, que permite reduzir a janela serológica (intervalo de tempo entre a contaminação e o diagnóstico da infeção). (100)

Amostra: soro ou plasma (heparina de lítio ou EDTA). Equipamento: VIDAS®

Método: ensaio imunoenzimático com deteção final em fluorescência

Primeiramente, a amostra e o anticorpo anti-p24 presentes na barrete são aspirados para dentro do cone, o vírus é lisado e os antigénios são libertados e ligam-se aos anticorpos anti-p24 fixados no cone. Simultaneamente, os anticorpos anti-HIV 1 e 2 vão fixar-se à glicoproteína 160 de HIV-1 e péptidos específicos de HIV-1 e HIV-2 presentes na parte inferior do cone. Uma segunda incubação com antigénios presentes na barrete é efetuada na parte inferior do cone, e estes antigénios fixam-se aos anticorpos anti-HIV presentes.

Uma terceira incubação com estreptavidina marcada com fosfatase alcalina é efetuada na totalidade do cone, que se fixa aos anticorpos anti-p24 e aos antigénios.

O substrato (4-metil-umbeliferil fosfato) é inicialmente incubado na parte inferior do cone, e é feita uma primeira leitura de fluorescência a 450nm. A intensidade da fluorescência é proporcional à presença de anticorpos anti-HIV. De seguida, o substrato é incubado na totalidade do cone e é efetuada uma segunda leitura que é proporcional à concentração de antigénio p24 do HIV-1 presente na amostra. (100)

Valores de referência:

Negativo: valor <0,25 (para a deteção antigénio e anticorpo) Positivo: valor ≥0,25 (para a deteção antigénio ou anticorpo)

4.5.1.6.Hepatite B

O Vírus da Hepatite B (HBV, do inglês, hepatitis B virus) pertence a uma família de vírus com tropismo para as células do fígado. São vírus de ADN com invólucro. A infeção por este vírus pode conduzir a uma hepatite aguda ou crónica. A hepatite aguda pode ser assintomática ou apresentar sintomas de gravidade variável que podem conduzir a hepatite fulminante. O vírus pode ser transmitido por via parenteral, perinatal e sexual. Os marcadores serológicos são essenciais para a determinação do estadio da doença. (76,79)

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O antigénio de superfície do HBV (AgHBs) aparece vários dias a semanas, após uma exposição ao vírus e pode persistir vários meses. A presença deste antigénio durante mais de 6 meses define serologicamente a infeção crónica. (101)

Amostra: soro ou plasma (heparina de lítio) Equipamento: VIDAS®

Método: ensaio imunoenzimático com deteção final em fluorescência

Este teste permite a deteção qualitativa do antigénio de superfície do HBV. O antigénio da amostra liga-se simultaneamente ao anticorpo monoclonal fixado no cone e ao anticorpo conjugado com biotina. Este complexo é colocado em contacto com a estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina, que se liga à biotina. Na etapa final, o substrato (4-metil-umbeliferil fosfato) é dispensado pelo cone e a enzima do conjugado catalisa a reação de hidrólise num produto que emite fluorescência a 450nm. O valor medido é proporcional à concentração do antigénio na amostra. (101)

Valores de referência: Negativo: <0,10 Positivo: ≥0,10