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REVISTA
BRASILEIRA
DE
REUMATOLOGIA
Artigo
original
Independência
de
isoformas
de
transferrina
deficiente
em
carboidrato
e
peptídeos
citrulinados
cíclicos
na
artrite
reumatoide
Monika
Gudowska
a,
Ewa
Gindzienska-Sieskiewicz
b,
Ewa
Gruszewska
a,
Bogdan
Cylwik
c,
Stanislaw
Sierakowski
b,
Maciej
Szmitkowski
ae
Lech
Chrostek
a,∗aMedicalUniversityofBiałystok,DepartmentofBiochemicalDiagnostics,Białystok,Polônia
bMedicalUniversityofBiałystok,DepartmentofRheumatologyandInternalMedicine,Białystok,Polônia
cMedicalUniversityofBiałystok,DepartmentofPediatricLaboratoryDiagnostics,Białystok,Polônia
informações
sobre
o
artigo
Históricodoartigo:
Recebidoem9deabrilde2015 Aceitoem5dejaneirode2016
On-lineem3demarçode2016
Palavras-chave:
Anticorposantipeptídeos citrulinadoscíclicos Transferrinadeficienteem carboidrato
Fatorreumatoide Artritereumatoide
r
e
s
u
m
o
Objetivo:Avaliararelac¸ãoentreosdoistiposdemodificac¸õespós-translacionaisde proteí-nasnaAR:glicosilac¸ãonocasodatransferrinadeficienteemcarboidrato(TDC)ecitrulinac¸ão pormeiodosanticorposnocasodoantipeptídeocitrulinadocíclico(anti-CCP).
Métodos:Oestudofoifeitoem50pacientescomAR.ATDCfoimedidacomoteste imu-nonefelométricoNLatexCDTeosresultadosforamapresentadosemunidadesabsolutase relativas.Oanti-CCPfoimensuradocomométodoquimioluminescenteeofatorreumatoide (FR)pelométodoimunoturbidimétrico.
Resultados: DospacientescomAR,80%forampositivosparaanti-CCP,70%paraFRe62% paraambos(anti-CCPeFR).Apercentagemdetransferrinatotal(%TDC)esteve significati-vamenteelevada,masonívelabsolutodeTDCnãoestevealterado.Aconcentrac¸ãomédia deTDCabsolutafoimaiornospacientesanti-CCPpositivosdoquenaquelesanti-CCP nega-tivos.ATDC(concentrac¸ãoabsolutaerelativa)nãosecorrelacionoucomoanti-CCPeoFR. Noentanto,oFRséricosecorrelacionousignificativamentecomoanti-CCP.Opercentual deTDCnãosecorrelacionoucomoanti-CCP,masseunívelabsolutosecorrelacionoucom oanti-CCPapenasempacientesFRnegativoseanti-CCPnegativos.ATDCnãose correla-cionoucomoFR,somentecomoanti-CCPempacientesanti-CCPnegativos.Oanti-CCPse correlacionoucomoDAS28apenasnospacientescomARanti-CCPnegativos,masaTDC (unidadesabsolutaserelativas)secorrelacionoucomoDAS28quandoconsideradostodos ospacientescomAReempacientescomARanti-CCPpositivos.
Conclusões:Esses resultados sugeremqueas alterac¸ões naTDC e as concentrac¸ões de anti-CCP não estão associadas e indicam a independência dessas modificac¸ões pós--translacionaisnaartritereumatoide.Apenasasalterac¸õesnaglicosilac¸ãodatransferrina refletemaatividadedaAR.
©2016ElsevierEditoraLtda.Este ´eumartigoOpenAccesssobumalicenc¸aCC BY-NC-ND(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
∗ Autorparacorrespondência.
E-mail:[email protected](L.Chrostek). http://dx.doi.org/10.1016/j.rbr.2016.01.001
Independence
of
carbohydrate-deficient
isoforms
of
transferrin
and
cyclic
citrullinated
peptides
in
rheumatoid
arthritis
Keywords:
Anti-cycliccitrullinatedpeptide antibodies
Carbohydrate-deficient transferrin
Rheumatoidfactor Rheumatoidarthritis
a
b
s
t
r
a
c
t
Objective: Theaimofthisstudywastoassesstherelationship betweenthetwotypes of posttranslational modifications of proteins in RA: glycosylationon the example of carbohydrate-deficienttransferrin(CDT)andcitrullinationbymeansofautoantibodiesto cycliccitrullinatedpeptides(anti-CCP).
Methods: Thestudywascarriedoutin50RApatients.CDTwasmeasuredusingNLatex CDTimmunonephelometrictest,theresultswerepresentedinabsoluteandrelativeunits. Anti-CCPweremeasuredusingthechemiluminescentmethodandrheumatoidfactor(RF) byimmunoturbidimetricmethod.
Results: 80%ofRApatientswerepositiveforanti-CCP,70%forRFand62%forboth, anti--CCPandRF.Thelevelof%CDTwassignificantlyelevated,butabsoluteCDTlevelwasnot changed.ThemeanabsoluteCDTconcentrationwashigherinanti-CCPpositivepatients thanthatinanti-CCPnegative.CDT(absoluteandrelativeconcentration)didnotcorrelate withanti-CCPandRF.However,serumRFsignificantlycorrelatedwithanti-CCP.%CDTdid notcorrelatewithanti-CCP,butabsolutelevelcorrelatedwithanti-CCPonlyinanti-CCP negativeandRFnegativepatients.CDTdidnotcorrelatewithRF,butsolelywithanti-CCPin anti-CCPnegativepatients.Anti-CCPcorrelatedwithDAS28onlyinanti-CCPnegativeRA, butCDT(absoluteandrelativeunits)correlatedwithDAS28inallpatientsandinanti-CCP positiveRA.
Conclusions: TheseresultssuggestthatthechangesinCDTandanti-CCPconcentrations arenotassociatedwithoneselfandindicateontheindependenceofthese posttranslatio-nalmodificationsinrheumatoidarthritis.Onlythealterationsintransferringlycosylation reflectedtheactivityofRA.
©2016ElsevierEditoraLtda.ThisisanopenaccessarticleundertheCCBY-NC-ND license(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
Introduc¸ão
Aartritereumatoide(AR)éumadoenc¸aautoimunecrônica dostecidosconjuntivos,quecontacom oaparecimentode váriostiposdeautoanticorpos.1 Osautoanticorpos específi-cos produzidos naAR têm sido associados a modificac¸ões pós-translacionais de proteínas e peptídeos.2 Essas envol-vemmodificac¸ões naglicosilac¸ão,citrulinizac¸ão, metilac¸ão, acetilac¸ãoeubiquitinac¸ãoqueocorrememcondic¸ões fisio-lógicasetêmumimportantepapelnofuncionamentonormal dosistemaimune.3Oprimeirotipodeautoanticorpos encon-tradoempacientescomARfoiofatorreumatoide(FR),que éumautoanticorpododomínioFcdaIgG.Encontrou-seque asalterac¸õesnaglicosilac¸ão(galactosilac¸ão/sialilac¸ão)daIgG estãoassociadasàpatogêneseda ARepodemserúteisdo pontodevistadiagnósticoeterapêutico.4Foramfeitos estu-dospara reconhecerasalterac¸õesnaglicosilac¸ãodeoutras glicoproteínas, como a IgA, a alfa 1-glicoproteína ácida, a fibronectina,ahaptoglobinaeatransferrina.Atransferrina humanaexistecomoumapopulac¸ãoheterogêneade varian-tesglicosiladasquediferemnacomposic¸ãodecarboidratos.5 Empessoassaudáveis, ocorremprincipalmente glicoformas tetrasialiladas;asglicoformasquecarecemdeumouambos N-glicanoscompletos sãochamadas de transferrina defici-enteemcarboidrato(TDC).5 Assume-sequeaTDC ésoma detrêsisoformas:asialotransferrina,monosialotransferrinae disialotransferrina.Aglicosilac¸ãodatransferrinanoplasma muda na artrite reumatoide e pode levar ao aumento no
níveldeTDC.6Amodificac¸ãopós-translacionalrecentemente descobertanaARéacitrulinizac¸ão.7 Trata-seda conversão enzimáticadaargininaemcitrulina,catalisadapela peptidi-largininadeiminase(PAD).EmpacientescomAR,aPADpode extravasar dascélulasquemorremnasarticulac¸ões sinovi-ais, quepodemcitrulinar da argininaeproduzir peptídeos citrulinadoscíclicos(CCP).8,9AutoanticorposcontraCCPsão consideradosbiomarcadoresdiagnósticoseprognósticos pre-coces na AR.10 A suapresenc¸a empacientes AR-negativos indicaumaARprecocecompiorprognóstico.8Foram detecta-dasmuitasproteínascitrulinadasempacientescomAR,como fibrinogênios,vimentina,enolaseecolágenotipoII.3
Oobjetivodesteestudofoiavaliararelac¸ãoentreos dife-rentestiposdemodificac¸õespós-translacionais–glicosilac¸ão ecitrulinac¸ão–naAR,pormeio daconcentrac¸ãodeTDCe anti-CCP.
Material
e
métodos
Tabela1–Resultadosdosexameslaboratoriaisempacientescomartritereumatoideecontroles
PCR (mg/L)
FR (UI/mL)
IgG (g/L)
TDC (mg/L)
%TDC Anti-CCP
(U/L)
AR (n=50)
22,96±25,54 p=0,000a
172,23±229,37 p<0,01a
11,79±3,06 p=0,904
42,70±69,40 p=0,564
2,03±0,24 p<0,01a
185,42±325,02 p=0,000a
Controles (n=33)
1,04±0,78 21,58±1,23 11,43±1,42 42,52±9,23 1,77±0,22 0,57±0,21
Osdadossãoexpressoscomamédiaeodesviopadrão.
a p<0,05paraasdiferenc¸asentreospacientescomAReogrupocontrole(TesteUdeMann-Whitney).
O grupo controle consistiu de 33 indivíduos saudáveis (médiadeidade de 41anos)recrutados entreos funcioná-riosdohospital.Coletaram-seamostrasdesangueporpunc¸ão venosa,após12horasdejejum.Todososindivíduos (saudá-veisecomAR)deramoseuconsentimentoinformadopara participardoestudo.EsteestudofoiaprovadopeloComitêde BioéticadaUniversidadedeMedicinadeBialystokefoifeito deacordocomaDeclarac¸ãodeHelsinque.
AatividadedaARfoideterminadapeloescoredeatividade dadoenc¸a(DAS28)deacordocomafórmula:
DAS28=0,56∗ √(t28)
+0,28∗ √(s28)
+0,7∗ln(VHS)+0,014∗VAS
Foramusadasnessafórmulaaquantidadedearticulac¸ões dolorosas(t28),aquantidadedearticulac¸õesinchadas(S28), avelocidadedehemossedimentac¸ão(VHS)eaescalavisual analógica(EVA). Abaixaatividade daAR(DAS 28 entre2,6 e3,2)nãofoidetectada;27,08%dospacientesapresentaram atividadedadoenc¸amoderada(DAS28entre3,2e5,1);efoi encontradaaltaatividadedadoenc¸a(DAS28acimade5,1)em 72,92%.ATDCfoimedidapormeiodoteste imunonefelomé-tricoNLatexCDTno analisadorBN II(SiemensHealthcare Diagnostics,Somerville,USA). Osresultados foram forneci-doscomounidadesabsolutasdeTDC(mg/L)epercentagemda transferrinatotal(%TDC).Osanticorposantipeptídeo citruli-nadocíclico(anti-CCP)forammedidosnoanalisadorArchitect i2000.Osresultadosacimade5U/Lsãoconsideradosnegativos e≥5,0U/Lpositivos.Determinaram-seosvaloresdefator reu-matoide(FR;valoresnormais<30UI/mL),proteínaC-reativa (PCR;intervalonormalde:0,8a1,2mg/L)eimunoglobulinaG (IgG;intervalonormalde5,52a16,31g/L)commétodos imu-noturbidimétricos no c8000 Architect (Abbott Laboratories, AbbottPark,IL,EUA).AVHS(mm/h)foimedidapelométodo deWestergrennoSediplusS2000(Sarstedt,Alemanha).
Análiseestatística
Asdiferenc¸asentreosgrupostesteecontroleforam avalia-daspelotesteUdeMann-Whitney.Consideraram-sevalores dep<0,05comoestatisticamentesignificativos.Acorrelac¸ão entreasvariáveisfoiavaliadapelocoeficientedecorrelac¸ão deSpearman.
Resultados
OsresultadosdosexameslaboratoriaisempacientescomAR econtrolessãoapresentadosnatabela1.Osníveismédiosde
PCR,FR,%TDCeanti-CCPforamsignificativamentemais ele-vadosnospacientescomartritereumatoideemcomparac¸ão comogrupocontrole.DospacientescomAR,80%eram posi-tivosparaanti-CCP,70%paraFRe62%paraambos(anti-CCP eFR).
A concentrac¸ão de TDC não se correlacionou com o anti-CCP quandoconsiderados todos os pacientes com AR (tabela2),excetonosindivíduosanti-CCPnegativos(r=0,696) eFRnegativos(r=0,629).Acomparac¸ãodosníveisdeTDC (uni-dadesabsolutas)emrelac¸ãoàsconcentrac¸õesdeanti-CCPe FRapresentoudiferenc¸aestatisticamentesignificativaapenas aoconsiderarosníveisdeanti-CCP.Nospacientesanti-CCP positivos,aconcentrac¸ãodeTDC(43,1±7,4mg/L) era signi-ficativamente maiselevadadoque emindivíduos anti-CCP negativos(38,9±2,4mg/L)(p=0,022)(fig.1).
Aconcentrac¸ãodeTDC(unidadesabsolutaserelativas)se correlacionoucomaatividadedeAR(ouseja,comapontuac¸ão noDAS28)quandoconsideradostodosospacientescomAR (tabela3).AaltaatividadedaARestáassociadaaumabaixa concentrac¸ãodeTDCabsolutaealtaconcentrac¸ãorelativade TDC.ATDC(expressaemambasasunidades)se correlacio-noucomoDAS28independentementedosníveisdeanti-CCP, excetoaTDC%empacientesFRpositivos.Aconcentrac¸ãode anti-CCPnãosecorrelacionoucomoDAS28quando consi-deradostodos os pacientes comAR, exceto nosindivíduos anti-CCPnegativos.
ATDCnãosecorrelacionoucomoFRquando considera-dostodosos pacientescomAR,exceto aoseconsiderarem osvaloresdeanti-CCPeFR(positivosounegativos)(p>0,05 paracadacomparac¸ão).Aocontrário,oanti-CCPse correlaci-onoucomoFRquandoconsideradostodosospacientescom AR(R=0,348;p=0,019)enosindivíduosanti-CCP negativos (R=0,750;p=0,032).
Tabela2–Correlac¸ãoentreaTDCeoanti-CCP
Teste R p
TodosospacientescomAR TDC 0,088 0,547
%TDC 0,033 0,821
Anti-CCPpositivo TDC −0,212 0,195
%TDC −0,069 0,677
Anti-CCPnegativo TDC 0,696 0,025a
%TDC 0,364 0,301
FRpositivo TDC −0,063 0,741
%TDC 0,223 0,235
FRnegativo TDC 0,629 0,012a
%TDC −0,016 0,954
Negativo Positivo
Anti-CCP 25
30 35 40 45 50 55 60 65 70 75
TDC (mg/L)
p = 0,022
Média Média ± EP Média ± DP
Figura1–Concentrac¸ãodeTDCempacientesanti-CCP positivosenegativos.
Tabela3–Correlac¸ãodoDAS28comoanti-CCPeTDC
Teste R P
Correlac¸ãoentreoDAS28eaTDC
TodosospacientescomAR TDC −0,350 0,014a
%TDC 0,321 0,026a
Anti-CCPpositivo TDC −0,446 0,003a
%TDC 0,324 0,047a
Anti-CCPnegativo TDC 0,567 0,112
%TDC 0,627 0,070
FRpositivo TDC −0,306 0,094
%TDC 0,399 0,026a
FRnegativo TDC −0,428 0,144
%TDC 0,319 0,288
Correlac¸ãoentreoDAS28eoanti-CCP
TodosospacientescomAR 0,050 0,739
Anti-CCPpositivo 0,193 0,246
Anti-CCPnegativo 0,748 0,020a
FRpositivo 0,113 0,550
FRnegativo −0,198 0,517
a Correlac¸ãoestatisticamentesignificativa.
O DAS 28 não diferiuentre os pacientes anti-CCP posi-tivos (5,63±1,37 U/L) e anti-CCP negativos (6,14±1,20 U/L) (p=0,337) e entre indivíduos FR positivos (5,84±1,22 U/L) e FR negativos (5,06±1,41 U/L) (p=0,113). O valor de FR foi significativamente maior em indivíduos com AR anti--CCP positivos (176±216 UI/mL)do quenaqueles anti-CCP negativos (142±307 UI/mL)(p=0,047), maso anti-CCP não diferiuentreospacientescomARFRpositivos(222±378U/L) em comparac¸ão com aqueles FR negativos (117±224 U/L) (p=0,126).
Discussão
Opresenteestudomostrouumaausênciadeassociac¸ãoentre aconcentrac¸ão de isoformas de transferrina deficienteem carboidratos(TDC)eoníveldeproteínasepeptídeos citru-linadosmedidoporautoanticorpos(anti-CCP)empacientes
comAR.Considerando-searelac¸ãoentreoanti-CCPouTDC e oescorede atividade da doenc¸a (DAS28), houve apenas associac¸ão com a concentrac¸ão de TDC. Os resultados do presente estudoestão deacordocom osestudosde Serda-roglu etal.11 eAridoganet al.,12 quemostraramnãohaver correlac¸ão significativaentre o anti-CCP eo DAS 28. Simi-larmente, elesnão encontraram diferenc¸aestatisticamente significativanoDAS28 entreindivíduosanti-CCPnegativos e positivos eentre indivíduosFR positivos e negativos. Do mesmomodo,elesencontraramdiferenc¸assignificativasno FR entre pacientes com ARanti-CCP positivos e negativos. Umúnicoestudo,odeÖnderetal.,revelouqueoanti-CCP estevepositivamenteassociadoamaioresescoresnoDAS-28, enquantoessesnãoestiveramassociadosàVHSeàPCR.13Em outroestudo,foiobservadaumacorrelac¸ãofracaentreos anti--CCPeoDAS28,mastodosospacientescomARerampositivos paraanti-CCP.14Emboranãotenhasidoencontradacorrelac¸ão entreaTDCeoanti-CCPnaAR,houveassociac¸ãoentredois marcadoressorológicosdaAR,oFReoanti-CCP.ATDCse cor-relacionoucomoanti-CCPapenasempacientesFRnegativose anti-CCPnegativos,emboraempacientescomartrite reuma-toidesoronegativos.Essefenômenopodeserresponsávelpela concentrac¸ão significativamente maior de TDC em pacien-tescomARanti-CCP-positivosdoqueemanti-CCP-negativos. Contudo,conformedemonstradoporArido ˘ganetal.,12os anti-corposcontraoCCPerammaisespecíficosparaaARdoque o FR(100%versus96,8%)eoanti-CCP nãosecorrelacionou comaatividadedadoenc¸a(DAS28),mascomoFR.A acurá-ciadiagnóstica(áreasobascurvasROC)doanti-CCPtambém foimaiselevadadoqueadoFR.15Aausênciadecorrelac¸ão entre a atividade da doenc¸a eo anti-CCP e asua existên-cia concomitanteao TDC podeser indicada peladiferenc¸a dependentedotemponaatividadedessasduasmodificac¸ões pós-translacionaisdiferentesdasproteínas.ODAS28indica aatividadedadoenc¸aemcurso,masaativac¸ãodaDAPea citrulinizac¸ão de várias proteínas ultrapassamos sintomas clínicosdadoenc¸a,emboraasalterac¸õesnaglicosilac¸ãoda transferrinasejamparalelasaodesenvolvimentodadoenc¸a. Hamadetal.tambémdescobriramqueapresenc¸adeumnível elevadode anti-CCPnãoestá associadaaumamaior ativi-dadedadoenc¸a.16Noentanto,apositividadeparaanti-CCPe otítulosecorrelacionaramcomadurac¸ãodadoenc¸a,oque podereforc¸arnossahipótesesobreamudanc¸adependentedo temponacitrulinac¸ãoemrelac¸ãoàglicosilac¸ãonaAR.O anti--CCPpodeserencontradonoiníciodocursodaAR,atémesmo anosantesdoaparecimentodossintomasclínicos.17Émuito interessantequeostatusdeanti-CCPpodemudar(de nega-tivoparapositivoevice-versa)apóstrêsanosdoiníciodaAR eamédiadonívelséricodeanti-CCPdeclinaraolongodos anos.18
A principalconclusão desteestudoéque, empacientes comAR,asmudanc¸asnaglicosilac¸ãodatransferrina medi-daspormeiodeisoformasdeficientesemcarboidratos(TDC) não estão relacionadas com a citrulinac¸ão, outro tipo de modificac¸ãopós-translacionalnaAR.
Conflitos
de
interesse
r
e
f
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ê
n
c
i
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