Daniella Pereira da Silva ¹; Kássia Rebeca Silva do Nascimento1; Eduardo Henrique Leite Machado2; Roberta de Albuquerque Bento3; Erilane de Castro Lima Machado3 1
Acadêmica do curso de Nutrição da Universidade Federal de Pernambuco, Centro Acadêmico de Vitória – UFPE/CAV, Rua Alto do Reservatório s/n, Bela Vista. CEP:55608-680 Vitória de Santo Antão/PE – Brasil; E-mail: daniellaps_@hotmail.com 2
Médico Veterinário – Recife/Pernambuco 3
Docente da Universidade Federal de Pernambuco, Centro Acadêmico de Vitória – UFPE/CAV. Vitória de Santo Antão/PE.
Resumo
Introdução: A conservação de alimentos vem se tornando um constante desafio devido ao surgimento de novos produtos no mercado. Entre as denominadas tecnologias emergentes em preservação de alimentos, destacam-se os aditivos naturais, onde vem sendo destacando o potencial antimicrobiano dos fitoconstituintes. Objetivo: Avaliar o potencial antibacteriano in vitro de fitoconstituintes em uso isolado e combinado frente a bactérias de importância em alimentos. Métodos: Usou-se os fitoconstituinteseugenol, carvona e cinamaldeído extraídos dos óleos essências do cravo-da-índia (Eugenia
cariophyllata), hortelã (Menthaspicata) e canela (Cinnamomumzeylanicum), respectivamente; e as bactérias Escherichia coli (ATCC 8739) e Staphylococcus aureus (ATCC 6538). Avaliou-se a atividade antibacteriana mediante o screening, determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e da concentração bactericida mínima (CBM) e o efeito sinérgico foi determinado pela Concentração Inibitória Fracional (FIC). Resultados: Os fitoconstituintes apresentaram no screening, atividade antibacteriana positiva frente às bactérias utilizadas nos ensaios, exibindo halos de inibição com diâmetros de 21 a 31,2 mm. Os valores de CIM variaram, no isolado de 0,06 a 0,17 e no combinado de 0,02 a 0,08, sendo os mesmos valores para o CBM. Todas as combinações testadas apresentaram efeito sinérgico, obtendo valor do FIC ≤ 0,5,exceto o eugenol na combinação eugenol mais carvona que teve como resultado indiferenteConclusão: Verificou-se queatividade antibacteriana dos fitoconstituintes em uso combinado foi mais eficiente do que o uso na forma isolada, e houve efeito sinérgico entre os fitoconstituintes.
Palavras-chave: carvona; eugenol; cinamaldeído; antibacteriano; óleos essenciais. INTRODUÇÃO
A conservação de alimentos vem se tornando um constante desafio devido ao surgimento de novos produtos no mercado que requerem longo e estável período de vida útil, além de alta proteção contra ação de micro-organismos ¹-².
Entre as denominadas tecnologias emergentes em preservação de alimentos, destacam-se os aditivos naturais, que incluem, entre outras substâncias, os óleos
essenciais 3. Extraído das plantas, os óleos essenciais têm sido ressaltados por possuírem notável potencial antimicrobiano, e paralelamente, o potencial antimicrobiano dos seus fitoconstituintes têm sido investigado 4.
Visando fornecer compostos que possam ser utilizados como substitutos de conservantes sintéticos na indústria de alimentos e que apresentem inocuidade atestada, o presente estudo tem por objetivo avaliar a eficácia antimicrobiana dos principais fitoconstituintes dos óleos essenciais do cravo-da-índia (Eugenia cariophyllata), hortelã (Menthaspicata) e canela (Cinnamomumzeylanicum), sendo eles eugenol, carvona e cinamaldeído, respectivamente, frente a micro-organismos patogênicos de importância em alimentos, avaliando-se o efeito in vitro, isolado e sinergicamente. Vale salientar que, diferentemente dos óleos essenciais supracitados, os fitoconstituintes correspondentes se revelaram inócuo quanto ao efeito citotóxico (dados ainda não publicados).
METODOLOGIA
As cepas de Escherichia coli (ATCC 8739), Staphylococcus aureus (ATCC 6538) foram obtidas da coleção de micro-organismos do laboratório de microbiologia Dde alimentos do CAV. A padronização da suspensão bacteriana foi realizado em solução salina a partir de uma cultura sob ativação over night do micro-organismo, comparando-se a turbidez com o padrão 0,5 da escala de MacFarland (108 UFC/mL).
Para os experimentos foram utilizados os fitoconstituinteseugenol, carvona e cinamaldeído extraído dos óleos essenciais do cravo-da-índia (Eugenia cariophyllata), hortelã (Menthaspicata) e canela (Cinnamomumzeylanicum), respectivamente, que foram obtidos da Sigma-Aldrick Brasil Ltda.
O screening da atividade antibacteriana dos fitoconstituintes na forma isolada foi realizado através da técnica de difusão em placas, utilizando-se discos de papel filtro (HADACECK; GREGER, 2000, NAIR et al., 2005). Considerou-se como efeito antibacteriano positivo as placas que apresentaram um halo de inibição igual ou superior a 10mm de diâmetro ao redor do disco (SILVA et al., 2007). Como controle da viabilidade das cepas microbianas verificou-se a capacidade de crescimento das cepas de bactérias em ágar nutriente sem adição do fitoconstituinte. Para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM), foi utilizado a técnica de macrodiluição em caldo. Em seguida foi determinada a CBM em placas (ELGAYYAR, 2001).
Após avaliação do CIM do fitoconstituinte isolado, concentrações menores foram avaliadas em uso combinado entre os fitoconstituintes, de forma que na combinação duplaou triplahouvesse a mesma quantidade de cada fitoconstituinte. A avaliação do efeito sinérgico dos antimicrobianos foi realizada por determinação fracionada da concentração inibitória (FIC). O valor do CIF foi calculado como segue, CIF: CIM do fitoconstituinte em combinação / CIM do fitoconstituinte isolado. Efeito sinérgico foi definido como FIC ≤ 0,5; indiferença como: FIC > 0,5 a 4; e antagonismo como: FIC > 4 (MACKAY; MILNE; GOULD, 2004).
Os resultados do screening da atividade antibacteriana dos fitoconstituintes, apresentados na Tabela 1,revelam que todos os fitoconstituintesapresentaram efeito antibacteriano, e que o potencial antimicrobiano do fitoconstituinteseugenol diante de
Staphylococcus aureus e Escherichia coli, medido a partir do diâmetro dos halos de
inibição formados, foram superiores aos demais.
Os valores referentes à concentração inibitória mínima e concentração bactericida mínima dos fitoconstituintes testados encontram-se na Tabela 2. Ao avaliar o efeito inibitório dos fitoconstituintes sobre o crescimento S.aureuse E. coli, respectivamente constatou-se que os melhores resultados de inibição do crescimento entre os fitoconstituintestestados em uso isolado foram para cinamaldeído e eugenol, nas concentrações 0,06% (Tabela 2). Peiet al. (2009) , ao investigarem o efeito antibacteriano de eugenol e cinamaldeído entre outros fitoconstituintes contra E. coli, obteve como valores da CIM 1,6µl/ml para eugenol e 0,4µl/ml para cinamaldeído5.
Avaliando o efeito sinérgico foi verificado que todas as combinações testadas apresentaram efeito sinérgico, obtendo valor do FIC ≤ 0,5, exceto o eugenol na combinação eugenol mais carvona que teve como resultado indiferente (Tabela 2). Ao observar os resultados, percebeu-se que a combinação dos fitoconstituinteseugenol e cinamaldeído, diante das bactériasS.aureuse E. coli, foi eficiente na concentração de 0,02% (0,2µl/ml = 0,1µl/ml de cada fitoconstituinte), sendo a menor CIM verificada neste trabalho. A combinação dos três fitoconstituintes (eugenol, cinamaldeído e carvona) apresentou CIM de 0,03%, sendo 0,01% para cada fitoconstituinte, para ambas bactérias estudadas (Tabela 2).
CONLUSÃO
De acordo com os resultados expostos, conclui-se que os fitoconstituintes testados comprovaram ter ação antimicrobiana in vitro, sendo o uso na forma combinada mais eficiente do que o uso em forma isolada, verificando-se efeito sinérgico entre os fitoconstituintes.
Tabela 1 – Screening da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais e fitoconstituintes pelo método de difusão em disco.
a-c
Para os óleos essenciais,letras minúsculas iguais nas colunas indicam ausência de diferença estatística segundo Teste de Tukey (p<0,05).
a-c
Para fitoconstituintes,letras minúsculas iguais nas colunas indicam ausência de diferença estatística segundo Teste de Tukey (p<0,05).
Micro-organismos
Diâmetro dos halos de inibição (média±desvio padrão)
Substâncias testadas S.aureus E.coli
Fitoconstituintes Cinamaldeído 26,2±0,84a 21±0,78a Eugenol 28,4±0,55b 31,2±0,78b Carvona 22,8±0,84c 27,2±0,87c
Tabela 2 – Concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) dos fitoconstituintes para cada micro-organismos / Concentração Inibitória Fracional (FIC).
AGRADECIMENTOS
Os autoresagradecemao CNPq – Propesq/UFPE pela bolsa de iniciação científica, e à técnica Edilene Maria Barbosa da Silva pela colaboração técnica.
REFERÊNCIAS
1. Marino, M.; Bersani, C.; Comi, G. Impedance measurement to study antimicrobial activity of essential oils from Lamiaceae and Compositae. International Journal of
Food Microbiology, v.67, n.3, p.187–195, ago., 2001.
2. Burt, S. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods – a review. International Journal of Food Microbiology, v.94, n.3, p.223-253, 2004.
3. Alarcón, M.M.V. Efeito Inibitório dos óleos essenciais sobre o crescimento de
Staphylococcus aureus e Escherichia coli em queijo ricota. 2007. 56p. Dissertação
(Mestrado em Microbiologia Agrícola) – Universidade Federal de Lavras, Lavras, Minas Gerais, Brasil.
4. Costa, A.C. Atividade antibacteriana dos óleos essenciais de Origanumvulgare L. e
Cinnamomumzeylanicum B. contra bactérias multirresistentes. 2009. 96p. Tese
(Doutorado em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos) – Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, Paraíba, Brasil.
5. Pei, R.S.; Zhou, F.; Ji, B.P.; Xu, J. Evaluation of Combined Antibacterial Effects of Eugenol, Cinnamaldehyde, Thymol, and Carvacrol against E.coli with an Improved Method. Journal of Food Science, v.74, n.7, p.379-383, 2009.