Cassiana de Oliveira
Mayara Gonçalves Motta
O presente projeto visa o isolamento de microrganismos endofíticos de folhas sadias da planta erva mate com possível propriedades farmacológicas, entre elas podemos destacar as atividades antimicrobianas contra patógenos humanos. O objetivo principal e Isolar microrganismos endofíticos de folhas de erva–mate (Ilex paraguariensis A. St.-Hil.) com potencial antibacteriano; verificar a ocorrência de antagonismo entre os microrganismos isolados e patógenos humanos. As coletas das amostras de erva mate serão realizadas em diferentes períodos do ano; as condições de isolamento serão de acordo com a metodologia descrita no projeto e irão variar de acordo com os microrganismos isolados. Espera-se encontrar microrganismos com atividade antibacteriana, estes serão isolados e classificados de acordo com metodologias clássicas e moleculares.
OBJETIVOS: a) Isolar microrganismos endofíticos de folhas de erva–mate (Ilex paraguariensis A. St.-Hil.) com potencial antibacteriano. b) Verificar a ocorrência de antagonismo entre os microrganismos isolados e patógenos humanos.
JUSTIFICATIVA: A planta erva mate possui no seu interior uma série de microrganismos endofíticos com propriedades farmacológicas, entre elas podemos destacar as atividades antimicrobianas contra patógenos humanos. Esta pesquisa, faz-se necessária para determinar quais microrganismos (fungos e bactérias) possuem atividade antimicrobiana e contra quais microrganismos patogênicos estas propriedades farmacológicas agem causado um efeito inibidor.
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA: As plantas medicinais e seus derivados consistiram durante muito tempo à base da medicina popular e, atualmente, cerca de 30% dos fármacos utilizados são de origem vegetal. Isto se deve, em parte, à grande variedade de espécies de plantas com propriedades biológicas. Acredita-se que cerca de 80% da população mundial use as plantas como primeiro recurso terapêutico (SILVA; FILHO, 2002).A
erva mate (Ilex paraguariensis A. St.-Hil.) é uma planta nativa da America do sul, pertencente à família Aquifoliaceae. É um importante produto natural no contexto socioeconômico e cultural na América do Sul e, principalmente, no Brasil. A região sul do País e a maior produtora de erva mate (ESMELINDRO et al., 2002) e sua importância concentra-se principalmente na área de bebidas por infusão, como chás, chimarrão, tererê e sucos (CARVALHO, 1994). As características biológicas da erva mate são decorrentes de vários fatores como, por exemplo, os fatores climáticos, características do solo, variações genéticas (COELHO et al., 2002), ou ainda pela presença ou ausência de microrganismos endofíticos (MELO; AZEVEDO, 1998).
MICRORGANISMOS ENDOFÍTICOS: Segundo Petrini (1991), microrganismos endofíticos são aqueles que habitam o interior das plantas pelo menos durante um período do ciclo de vida da mesma sem lhes causar danos ou doença. Essa interação microrganismo-planta é tão íntima que tem sido sugerido como um processo co-evolutivo entre plantas e patógenos. Muitas espécies destes microrganismos apresentam
a capacidade de sintetizar compostos que inibem ou são antagônicos a insetos e a microrganismos patogênicos (MACCHERONI et al., 2004). A produção de metabolitos primários e secundários pelos microrganismos é conhecida há muito tempo e explorado do ponto de vista biotecnológico. Os
exemplos mais conhecidos são os antibióticos. Do ponto de vista biológico, a produção deste principio ativo pode estar associada com a interação entre os microrganismos e seu habitat (MACCHERONI et al., 2004). Na literatura, encontram-se algumas referências de estudos envolvendo microrganismos endofíticos isolados de plantas medicinais, mas poucas utilizando erva mate, a qual apresenta alto potencial farmacológico. Segundo Pimentel et al. (2006), os fungos endofíticos encontrados em plantas de erva mate podem agir de maneira antagônica, neutra ou até benéfica para o vegetal hospedeiro, exibindo vários graus de interdependência fisiológica e ecológica. Desta forma, justifica-se o interesse em elucidar aspectos da biologia destes microrganismos, para compreender melhor a sua relação com a planta hospedeira e seu papel na produção de novos fármacos.
IDENTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS: A Identificação de um dado microrganismo baseia-se no preenchimento das características atribuídas aquele microrganismo. O processo de identificação dos microrganismos é efetuado através da determinação de um número mínimo de propriedades. Os microrganismos endolíticos podem ser detectados por vários métodos no interior de tecidos vegetais, são eles: Microscopia ótica ou eletrônica onde podem ser vistos ocupando espaços intercelulares; métodos de coloração e métodos sorológicos.
clássicos como: morfologia, testes bioquímicos e sorológicos utilizados para identificação dos mais diversos microrganismos e são importantes, porém apresentam limitações que os tornam insuficientes, muitas vezes, para a identificação e discriminação mais precisa dos microrganismos. Contudo, quando associados às técnicas de biologia molecular, os métodos taxonômicos clássicos tornam-se, em conjunto, poderosas ferramentas para a caracterização e a identificação dos mais diversos microrganismos. (BRUIJN et al. 1996; CARBONE E KOHN, 1993; GUIMARÃES; MOREIRA, 1999; WHITE, et al., 1990). A detecção de organismos específicos em extratos de plantas ou solo pode ser determinada por diversas técnicas moleculares entre as mais utilizadas podemos citar a reação em cadeias da polimerase PCR (REIS JUNIOR, et. al. 2002). Entre os componentes moleculares de um organismo, os ácidos ribonucléicos ribossomais (rRNA) são considerados os biopolimeros mais adequados para estudos de diversidade microbiana, seus genes, os rDNAs, são distribuídos universalmente entre os diferentes grupos de seres vivos, sendo a molécula com maior grau de conservação o existente. (LANE et al.; 1985). O 16S rRNA gera grande quantidade de informações úteis para inferências filogenéticas, por ser uma molécula menor e possibilitar uma maior facilidade de seqüenciamento , tornou-se uma molécula de referência. (WOESE, 1987; REIS JUNIOR, et. al. 2002). A técnica Analise de restrição
do DNA ribossomal amplificado (ARDRA) é baseada no grau de conservação dos sítios de restrição do rDNA que reflete padrões filogenéticos, ela é bastante útil para uma rápida analise da diversidade de uma ambiente (GRIFONU et al., 1995). Para a analise de diversidade intra especifica entre grupos isolados com afinidade filogenética, recomendação a ampliação do espaço intergênico 16S-23S rDNA, esta região apresenta uma maior variabilidade de bases (REIS JUNIOR, et. al. 2002).
MATERIAL E MÉTODOS: As coletas das amostras de erva-mate realizadas no Centro Nacional de Pesquisa de Florestas (CNPF) da EMBRAPA (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária), no município de Colombo, PR, entre março de 2009 a março de 2010. Para a coleta do material, será realizada uma seleção aleatória das plantas
adultas, sendo escolhidas as folhas de aspecto jovem e sadio. As plantas devidamente marcadas para posteriormente serem realizadas novas coletas. ISOLAMENTO DOS MICRORGANISMOS ENDOFÍTICOS: Os isolamentos serão realizados no Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Ciências Biológicas e de Saúde da Universidade Tuiuti do Paraná. O material botânico coletado será processado no prazo de 24 horas. Após a coleta, será lavado abundantemente com água corrente e detergente neutro para retirar o excesso de epifíticos, matéria orgânica e resíduos sólidos. Antes do processo de desinfecção externa os
pecíolos vedados com parafina, a fim de evitar que os agentes de desinfecção penetrem por essa abertura, alterando o resultado real do isolamento. Em seguida, em câmara asséptica, as folhas lavadas em água destilada esterilizada por duas vezes e posteriormente o material será imerso em álcool 70% por 1 minuto. Na sequência, em hipoclorito 3% por 4 minutos e novamente em álcool 70% por 30 segundos, para retirar o excesso de hipoclorito. Então, o material será lavado três vezes em água destilada estéril da qual será retirado 50 μL para fazer o controle da assepsia (SOUZA et. al., 2004). As folhas cortadas em fragmentos circulares de aproximadamente 6 mm. Estes fragmentos transferidos para placas de Petri contendo meio de cultivo batata, dextrose e ágar (BDA), acrescido de tetraciclina (100mg/L) para isolamento de fungos e meio Tryptona Soy Agar (TSA) acrescido de benlate (1μg/mL), para isolamento das bactérias. As placas com os fragmentos incubadas a 28ºC e 37 ºC.O crescimento das colônias fúngicas e bacterianas será acompanhado diariamente. Para purificação dos isolados fúngicos, esporos de cada um dos isolados homegeneizados em solução de Tween 80 a 0,1 %, e alíquotas de 0,1 mL semeadas em placas de Petri contendo meio BDA com auxílio da
alça de Drigalski. As placas incubadas à temperatura ambiente (28 ± 2 ºC), conforme descrito por Pimentel et al. (2006).
ATIVIDADE ANTIBACTERIANA: Para se observar a atividade antibacteriana das amostras de microrganismos endofíticos, empregadas duas metodologias descritas por Mariano (1993). As linhagens referências, provenientes da ATCC (American Type Culture Collection), escolhidas aleatoriamente linhagens de fungos. Depois, cultivados por oito dias em placas de Petri com meio BDA ou TSA retirados fragmentos do meio com 6 x 6 mm para fermentação em 10 mL de BD (acrescido de 0,2% de extrato de levedura) a 25 oC, a 120 r.p.m., após oito dias. Decorrido este tempo o micélio será separado do meio metabólico por filtração em papel. O líquido será novamente filtrado em membrana millipore (0,22 μm ou 0,45 μm) e armazenado a 4 oC para realização dos ensaios antimicrobianos. Serão realizados testes semiquantitativos, em triplicata, in vitro, para avaliar a antibiose dos metabólitos extracelulares presentes nos meios fermentados contra as linhagens-teste.
Palavras-chave: fungos endofiticos; propiedades biológicas; atividade antimicrobiana.